高效液相梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定情安喘定片5種成分

林源

(浙江省溫嶺市中醫(yī)院藥劑科，溫嶺 317500)

高效液相梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定情安喘定片5種成分

林源

(浙江省溫嶺市中醫(yī)院藥劑科，溫嶺 317500)

目的 采用高效液相梯度洗脫法，同時(shí)測(cè)定情安喘定片中蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素含量。方法 采用依利特Hypersil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.9 mL·min-1；以甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：蕓香苷和槲皮苷為254 nm，補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素為269 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果 蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素質(zhì)量濃度分別在6.06～121.20 μg·mL-1(r=0.999 9)、5.80～116.00 μg·mL-1(r=0.999 2)、4.65～93.00 μg·mL-1(r=0.999 7)、7.10～142.00 μg·mL-1(r=0.999 5)、6.30～126.00 μg·mL-1(r=0.999 3)時(shí)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系；蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的平均加樣回收率分別為99.26%，98.28%，97.12%，98.05%，96.72%，RSD(n=6)分別為0.76%，1.54%，0.64%，0.87%，0.61%。結(jié)論 該方法是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法，可用于情安喘定片的質(zhì)量控制。

情安喘定片；蕓香苷；槲皮苷；補(bǔ)骨脂素；佛手柑內(nèi)酯；芹菜素

情安喘定片處方源自國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第九冊(cè)[1]，由魚(yú)腥草、五指毛桃、榕樹(shù)葉、胡頹子、珍珠層粉、冰片、鹽酸雙氯醇胺等7味藥物組成，氣芳香，味苦澀、辛。具有平喘、止咳、祛痰、消炎之功效，可用于慢性支氣管炎、支氣管哮喘等癥的治療。魚(yú)腥草和五指毛桃為方中的主要藥物，原部頒標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)性狀和個(gè)別藥材進(jìn)行顯色鑒別，未對(duì)方中的任何藥物進(jìn)行含量測(cè)定[1-2]，很難有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量和療效。筆者采用高效液相梯度洗脫法對(duì)情安喘定片魚(yú)腥草中的蕓香苷、槲皮苷和五指毛桃中的補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯、芹菜素進(jìn)行含量測(cè)定，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。本方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可作為情安喘定片中蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(安捷倫科技(中國(guó))有限公司，含G1311A四元泵、G1330B自動(dòng)進(jìn)樣器恒溫器、G1322A脫氣機(jī)、Chemstation色譜工作站、G1315B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器)。

1.2 試藥 蕓香苷對(duì)照品(批號(hào)：100080-201408，含量：90.2%)、槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)：111538-200504，含量：92.9%)、補(bǔ)骨脂素(批號(hào)：110739-201115，含量：99.3%)、芹菜素(批號(hào)：111901-201102，含量：99.6%，置五氧化二磷干燥器中減壓干燥12 h后使用)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；佛手柑內(nèi)酯(批號(hào)：484-20-8，含量：98.0%)購(gòu)于上海同田生物技術(shù)有限公司；情安喘定片(規(guī)格：每片0.4 g，批號(hào)：131003，131005，131006)購(gòu)于廈門(mén)中藥廠有限公司；陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)藥材均購(gòu)于浙江省臨海醫(yī)藥有限公司中藥飲片廠，經(jīng)各自藥材國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合要求；甲醇(色譜純，批號(hào)：20130507，含量：≥99.9%)、乙腈(色譜純，批號(hào)：20141006，含量：≥99.9%) 購(gòu)于天津市康科德科技有限公司；磷酸(分析純，批號(hào)：20140608，含量：≥85.0%)購(gòu)于廣州化學(xué)試劑二廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1%磷酸溶液[3-9]，梯度洗脫(0～10 min，20.0%A；～20 min，20.0%A→25.0%A；～40 min，25.0%A→35.0%A；～46 min，35.0%A→20.0%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)(0～20 min，λ1=254 nm[10]；～46 min，λ2=269 nm[11])；流速為0.9 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。此系統(tǒng)條件下所測(cè)組分與其他組分分離效果良好，理論板數(shù)按芹菜素計(jì)算不得低于2 000，分離度均>2.0。

2.2 混合對(duì)照品溶液配制 取5種對(duì)照品蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素各適量，精密稱定，分別置5個(gè)20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配制得蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素質(zhì)量濃度分別為0.606，0.580，0.465，0.710，0.630 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再分別精密吸取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5，2，4，2，1 mL置同一個(gè)50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯與芹菜素質(zhì)量濃度分別為0.060 6，0.023 2，0.037 2，0.028 4，0.012 6 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，混勻，稱取約1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲波超聲提取40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按情安喘定片處方比例稱取除魚(yú)腥草的其余藥味和除五指毛桃的其余藥味各1份，按情安喘定片的制備工藝分別制成魚(yú)腥草陰性對(duì)照樣品和五指毛桃陰性對(duì)照樣品[1]，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成魚(yú)腥草陰性對(duì)照溶液和五指毛桃陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、魚(yú)腥草陰性對(duì)照溶液及五指毛桃陰性對(duì)照溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果在與蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰；而魚(yú)腥草陰性對(duì)照溶液色譜圖中未顯示蕓香苷和槲皮苷吸收峰；五指毛桃陰性對(duì)照溶液色譜圖中未顯示補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素吸收峰。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mL，分別置5個(gè)10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y與對(duì)照品質(zhì)量濃度X，得蕓香苷回歸方程為：Y=2.326 5×104X+513.4，r=0.999 9，線性范圍為6.06～121.20 μg·mL-1；槲皮苷Y=5.321 8×103X+317.1，r=0.999 2，線性范圍為5.80～116.00 μg·mL-1；補(bǔ)骨脂素Y=1.569 9×104X+602.7，r=0.999 7，線性范圍為4.65～93.00 μg·mL-1；佛手柑內(nèi)酯Y=1.098 1×104X+291.9，r=0.999 5，線性范圍為7.10～142.00 μg·mL-1；芹菜素Y=6.021 8×103X-591.3，r=0.999 3，線性范圍為6.30～126.00 μg·mL-1。結(jié)果表明：蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素在各自的線性范圍內(nèi)，所測(cè)組分質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)得5種成分的峰面積，峰面積RSD分別為0.57%，0.98%，0.33%，0.56%和0.85%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

A.魚(yú)腥草陰性對(duì)照溶液；B.五指毛桃陰性對(duì)照溶液；C.對(duì)照品；D.樣品；1.蕓香苷；2.槲皮苷；3.補(bǔ)骨脂素；4.佛手柑內(nèi)酯；5.芹菜素

圖1 蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的HPLC圖

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批號(hào)供試品，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量RSD分別為0.67%，0.25%，0.81%，0.59%和0.91%。結(jié)果表明，本法測(cè)定重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)：131003)，在室溫下放置0，2，4，8，12，24 h后，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定其峰面積值，蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素峰面積的RSD分別為0.52%，0.83%，0.29%，0.50%和0.73%。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批情安喘定片(批號(hào)：131003，蕓香苷為3.13 mg·g-1、槲皮苷為1.18 mg·g-1，補(bǔ)骨脂素為1.95 mg·g-1，佛手柑內(nèi)酯為1.44 mg·g-1，芹菜素為0.628 mg·g-1) 適量，研細(xì)，混勻，取約0.5 g，精密稱定，精密加入混合對(duì)照品溶液25 mL和甲醇25 mL，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算5種組分回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.11 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品甲組成分，按“2.3”項(xiàng)下供試品制備方法，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定本品中蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察流動(dòng)相乙腈-水梯度洗脫、甲醇-水梯度洗脫、甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，結(jié)果以甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫時(shí)色譜峰分離較好，分離度均>2.0。本方法采用多波長(zhǎng)梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定情安喘定片中5種成分的含量，對(duì)有效控制該品種的質(zhì)量和療效意義重大。蕓香苷和槲皮苷的檢測(cè)波長(zhǎng)參考文獻(xiàn)資料[10]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該組分檢測(cè)波長(zhǎng)定為254 nm；補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素的檢測(cè)波長(zhǎng)參考文獻(xiàn)資料[11]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該組分檢測(cè)波長(zhǎng)定為269 nm。

表1 蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素加樣回收率實(shí)驗(yàn)

批號(hào)蕓香苷槲皮苷補(bǔ)骨脂素佛手柑內(nèi)酯芹菜素1310031.25±0.010.472±0.0020.780±0.0050.576±0.0050.251±0.0071310051.39±0.020.523±0.0050.812±0.0080.594±0.0020.262±0.0031310061.16±0.010.491±0.0030.764±0.0030.569±0.0040.255±0.006

3.2 供試品溶液提取方法的選擇 在供試品溶液制備過(guò)程中，分別考察了加熱回流法、超聲提取法對(duì)蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素5種成分的提取效率，結(jié)果顯示加熱回流提取與超聲提取法效率相當(dāng)，但考慮到超聲波超聲提取較加熱回流簡(jiǎn)便易行，故選取超聲提取法；超聲提取時(shí)間選取20，40，60 min進(jìn)行考察，結(jié)果超聲提取40 min和超聲提取60 min提取率相差不大，但明顯高于提取20 min，故選取超聲波超聲提取40 min作為該品種中蕓香苷、槲皮苷、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯和芹菜素含量測(cè)定供試品溶液的提取方法。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.027

2014-05-19

2014-08-05

林源(1984-)，男，浙江溫嶺人，主管中藥師，學(xué)士，研究方向：中藥學(xué)。電話：(0)13566665731，E-mail：lunwenlinyuan@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)08-1086-04