高效液相色譜法測定復(fù)方丹參片與滴丸中7種活性成分含量*

張愛兵，張珺，程月發(fā)，張春雨，郭蘭，劉穎碩

(1.河北省唐山市食品藥品檢驗中心化學(xué)室，唐山 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，唐山 063300)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

高效液相色譜法測定復(fù)方丹參片與滴丸中7種活性成分含量*

張愛兵1，張珺2，程月發(fā)2，張春雨1，郭蘭2，劉穎碩2

(1.河北省唐山市食品藥品檢驗中心化學(xué)室，唐山 063000；2.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，唐山 063300)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)法同時測定復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸中7種活性成分的含量。方法 采用Zorbax XDB-C18色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，檢測波長為203，270和281 nm。結(jié)果 7種成分峰面積與濃度的線性關(guān)系良好；加樣回收率在95.1%～100.4%；滴丸樣品中丹參酮ⅡA未能檢出。結(jié)論 建立了同時測定兩類復(fù)方丹參制劑中丹參素、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸B、人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA含量的方法，精密度高，重復(fù)性好，可用于兩類復(fù)方丹參制劑的質(zhì)量控制；復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA含量明顯高于滴丸。

丹參片，復(fù)方；丹參滴丸，復(fù)方；活性成分；色譜法，高效液相

以丹參、三七和冰片組方的復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸是目前我國心血管病臨床應(yīng)用最為廣泛的丹參制劑。復(fù)方丹參片最早由上海中藥制藥二廠于1975年研制并在1976年9月完成產(chǎn)品鑒定，有關(guān)該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究1984年得以公開[1]。復(fù)方丹參滴丸則是根據(jù)《中華人民共和國藥典》1990年版復(fù)方丹參片的處方，用滴丸工藝研制而成的中藥制劑[2]。雖然兩制劑所用原料藥材完全相同，但由于工藝和所含的主要有效成分的不同，所采用的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也完全不同[3]。目前有關(guān)兩產(chǎn)品的爭議較多，主要集中在兩個方面：不同劑型藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)究竟應(yīng)該采用何種辦法和指標(biāo)[4-5]；兩種藥物在藥效學(xué)研究方面是否存在差異[6-7]。就質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究而言，有關(guān)研究已經(jīng)很多，但到目前為止，尚欠缺同時比較兩藥多種主要活性成分的報道。筆者試圖通過建立高效液相色譜(HPLC)法，對復(fù)方丹參片和滴丸中7種主要活性成分進行含量測定，以豐富質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的方法和內(nèi)容。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1100型系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，包括G1311A四元梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315B二級管陣列檢測器；Chem StationRev A 10.02色譜工作站；BP211D電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.01 mg)；SB2200超聲波清洗機(上海Branson公司，頻率50 Hz)。

1.2 試劑 復(fù)方丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：K1A004，I2A020和I2A040)和復(fù)方丹參滴丸(天津天士力制藥有限公司，批號：120104，120613和120908)均購自本地藥店。對照品：原兒茶醛(批號：110810-201007)，三七皂苷R1(批號：110745-200415)，人參皂苷Rg1(批號：110703-200726)，人參皂苷Rb1(批號：110704-200420)和丹參酮 ⅡA(批號：110766-200416)均購自中國食品藥品檢定研究院，均供含量測定用；對照品丹參素(批號：22681-72-7)和丹酚酸 B(批號：115939-25-8)均購自貴州迪大生物有限公司，含量>98%。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Zorbax XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A為乙腈；B為0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫(表1)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長為203，270和281 nm，進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫中流動相的比例

Tab.1 Proportion of mobile phase in gradient elution

t/min乙腈(A)/%0.1%磷酸水溶液(B)/%01981121981302575363367506535706535

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品1.77 mg，置5 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為354 μg·mL-1的貯備液，備用。精密稱取對照品丹參素3.38 mg、原兒茶醛3.47 mg、三七皂苷R17.22 mg、人參皂苷Rg15.72 mg、丹酚酸B 2.26 mg和人參皂苷Rb14.58 mg，分置5 mL棕色量瓶中，加20%甲醇溶解并定容，配成濃度分別為676，694，1 444，1 144，452和916 μg·mL-1的儲備液，備用。分別精密吸取上述丹參素、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸 B、人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA貯備液各1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 取復(fù)方丹參片20片，精密稱定，研磨成粉末，精密稱取0.30 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定總量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，溶液過孔徑0.45 μm濾膜，即得。取復(fù)方丹參滴丸50粒，精密稱定，研磨成粉末，精密稱取0.30 g置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定總量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，溶液過0.45 μm濾膜，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 分別按復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸的生產(chǎn)工藝制備缺丹參和三七的陰性制劑，并按照樣品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2.5 流動相的選擇 本實驗的檢測波長在203 nm處，甲醇在短波長處有紫外吸收，會干擾皂苷類物質(zhì)色譜峰的測定，因此不能選用甲醇作為流動相。樣品里含有酚酸類物質(zhì)，故在流動相里加入酸溶液以防酚酸類物質(zhì)水解，而甲酸或乙酸在低波長處有紫外吸收，故本實驗選擇的流動相為乙腈-0.1%磷酸進行梯度洗脫。

2.6 檢測波長的選擇 通過對丹參素、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸 B、人參皂苷Rb1和丹參酮 ⅡA的紫外檢測，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在203 nm低波長處出峰；丹參素，原兒茶醛和丹酚酸 B在281 nm處有最大吸收；丹參酮 ⅡA在270 nm處有最大吸收，因此采用二極管陣列檢測器，檢測波長為203，270和281 nm。結(jié)果見圖1。

2.7 陰性對照實驗 分別取混合對照品溶液、樣品溶液和陰性對照溶液按本實驗色譜條件進行測定。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在樣品溶液HPLC圖中，分別有與對照品溶液色譜峰保留時間一致的色譜峰，三七陰性對照溶液的HPLC圖中在與對照品溶液相同保留時間的位置上，沒有出現(xiàn)丹參素、原兒茶醛、丹酚酸 B和丹參酮ⅡA的色譜峰。丹參陰性對照溶液的HPLC圖中在與對照品溶液相同保留時間的位置上，沒有出現(xiàn)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的色譜峰。表明陰性樣品溶液對測定無干擾。結(jié)果見圖1。

2.8 線性關(guān)系考察 吸取混合對照品溶液過孔徑0.45 μm濾膜后，在本實驗色譜條件下分別進樣1，2，5，10，20和40 μL，記錄色譜峰面積。以濃度(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對其進行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2。

2.9 方法學(xué)考察

2.9.1 重復(fù)性實驗 取復(fù)方丹參片(批號：K1A004)和復(fù)方丹參滴丸(批號：120104)，按樣品溶液的制備方法分別平行制備6份樣品溶液，按實驗色譜條件測丹參素、原兒茶醛，、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸 B、人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA的平均含量。結(jié)果復(fù)方丹參片(批號：K1A004)各成分含量依次為6.316，0.251，27.540，5.209，36.538，8.646和1.339 mg·g-1，RSD分別為0.74%，1.23%，0.92%，1.37%，0.66%，1.12%和0.76%；復(fù)方丹參滴丸(批號：120104)各成分含量依次為12.423，1.663，28.860，5.065，0.228，4.979和0 mg·g-1，RSD分別為0.88%，1.06%，1.13%，1.21%，0.87%，1.42%。表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高。

2.9.2 穩(wěn)定性實驗 取復(fù)方丹參片(批號：K1A004)和復(fù)方丹參滴丸(批號：120104)樣品溶液，按本實驗色譜條件，分別于0，2，4，6，8 h進行測定、記錄色譜圖，分別計算丹參素、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸 B、人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA峰面積的RSD。結(jié)果復(fù)方丹參片(批號：K1A004)各成分含量依次為0.34%，0.72%，0.32%，0.65%，0.93%，0.87%和0.95%；復(fù)方丹參滴丸(批號：120104)各成分含量依次為0.45%，1.02%，0.92%，0.82%，0.73%，0.65%，其中丹參酮ⅡA含量檢測不到。說明兩樣品溶液在避光密閉容器中保存，在8 h內(nèi)含量變化不大，比較穩(wěn)定。

2.9.3 加樣回收率實驗 取復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸的樣品(已知復(fù)方丹參片中丹參素，原兒茶醛，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，丹酚酸 B，人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA的含量分別為6.316，0.251，27.540，5.209，36.538，8.646和1.339 mg·g-1；復(fù)方丹參滴丸中丹參素、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸 B、人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA的含量分別為12.423，1.663，28.860，5.065，0.228，4.979和0 mg·g-1)，分別加入一定量的對照品溶液后，測定含量，計算回收率。見表3。

2.10 樣品含量測定 取3個批號復(fù)方丹參片及3個批號的復(fù)方丹參滴丸，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液各3份，按相應(yīng)的色譜條件對樣品溶液中丹參素、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸 B、人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA的含量進行測定，用外標(biāo)法計算。結(jié)果見表4和圖1。

A.對照品；B.復(fù)方丹參片；C.復(fù)方丹參滴丸；D.三七陰性對照液；E.丹參陰性對照液；F.陰性對照液；1.丹參素；2.原兒茶醛；3.三七皂苷R1；4.人參皂苷Rg1；5.丹酚酸B；6.人參皂苷Rb1；7.丹參酮ⅡA

圖1 對照品及復(fù)方丹參制劑的HPLC色譜圖

A.reference； B.FufangDanshentablet； C.FufangDanshendropping pill； D.negative solution without Panax notoginseng； E.negative withoutRadixSalviaeMiltiorrhizae； F.negative withoutPanaxnotoginsengandRadixSalviaeMiltiorrhizae；1.propanoid acid； 2.protocatechuic aldehyde； 3.notoginsenoside R1； 4.ginsenoside Rg1； 5.salvianolic acid B； 6.ginsenoside Rb1； 7.tanshinone ⅡA

Fig.1 HPLC chromatograms of references andFufangDanshenpreparations

表2 7種成分線性關(guān)系實驗結(jié)果

Tab.2 Results of linear relation test on seven active components

對照品回歸方程線性范圍/μgr丹參素Y=544.98+4320X0.068～2.7040.9980原兒茶醛Y=4.03+7207X0.004～0.1660.9998三七皂苷R1Y=2.42+256X0.289～11.5520.9999人參皂苷Rg1Y=3.18+349X0.057～2.2880.9993丹酚酸BY=974.51+4786X0.226～9.0400.9981人參皂苷Rb1Y=7.09+237X0.092～3.6640.9954丹參酮ⅡAY=-1.94+3563X0.018～0.7081.0000

表3 兩種樣品中7種成分回收率實驗結(jié)果

Tab.3 Results of recovery tests on seven active components in two kinds of samples %，n=9

“-”未檢出

“-” not check out

3 討論

3.1 關(guān)于復(fù)方丹參制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究活性成分的選擇 復(fù)方丹參制劑究竟采用何種活性成分作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定性與定量指標(biāo)，一直存在爭議，其主要原因在于中藥制劑的原料提取方法和制造工藝不同。在2010年版《中華人民共和國藥典》一部中，對復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參顆粒均要求進行丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的薄層層析鑒別，含量測定只規(guī)定了丹參酮ⅡA和丹酚酸 B項目；而對復(fù)方丹參滴丸，薄層層析鑒別除了三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1外，增加了人參皂苷Re和冰片項目，減除了丹參酮ⅡA，含量測定方面以丹參素作為唯一的定量指標(biāo)，另有指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)[3]。韋英杰等[8]在國內(nèi)較早采用高效液相二極管陣列檢測法同時測定去糖衣丹七片、復(fù)方丹參片和復(fù)方丹參滴丸中的原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量，但該實驗存在一個不足，即沒有對丹參素進行測定，而丹參素恰恰是復(fù)方丹參滴丸藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的HPLC含量測定的唯一成分。因此，如果排除這個最主要的活性成分來建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究方法或者比較制劑的質(zhì)量，無疑會降低其實際應(yīng)用價值。其他的有關(guān)研究，多是對單一產(chǎn)品的多個活性成分的測定[9-11]或者是側(cè)重于復(fù)方丹參制劑中多個代表性脂溶性和/或水溶性成分的測定[12-15]，而對復(fù)方丹參制劑中的丹參和三七的多個活性成分測定較少。本研究依據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定的丹參和三七藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定要求，參考有關(guān)研究的技術(shù)和方法，選擇丹參素、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、丹酚酸 B、人參皂苷Rb1和丹參酮ⅡA作為測定指標(biāo)，同時兼顧了復(fù)方丹參片和滴丸的主要成分，建立的方法具有實際應(yīng)用價值。

3.2 復(fù)方丹參滴丸中丹參酮ⅡA含量測定的差異 中藥的藥效不是源于一個或幾個活性成分，而是作為一個整體起作用。因此，質(zhì)量控制應(yīng)盡量把握全面指標(biāo)。但復(fù)方丹參制劑即使原料藥材完全相同，因為工藝的差別會導(dǎo)致制劑活性成分存在差異[12]，最為明顯的是丹參酮ⅡA。李楚源等[13]采用HPLC-DAD法對復(fù)方丹參制劑中的活性成分進行定量比較分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參片的丹參酮ⅡA含量較高，而某些復(fù)方丹參制劑中的丹參酮ⅡA定量檢測不出；韋英杰等[8]對復(fù)方丹參片進行測定時，也未能檢測出隱丹參酮和丹參酮ⅡA。李玉珍等[14]采用HPLC方法測定丹酚酸B和丹參酮ⅡA在復(fù)方丹參片和滴丸中的含量，在滴丸中含量極低，定量測定未能檢出。有些實驗雖然檢測到滴丸中的丹參酮ⅡA，但含量相對偏低[10，15-16]。本研究也未能定量檢測出復(fù)方丹參滴丸中丹參酮ⅡA，進一步說明了兩種劑型中丹參脂溶性成分特別是丹參酮ⅡA含量差異較為明顯。章弘揚等[9]采用飛行時間質(zhì)譜結(jié)合離子阱多級質(zhì)譜的分析方法，從復(fù)方丹參滴丸中共鑒定出8種丹參酚酸類和5種三萜皂苷類活性成分，分別歸屬于丹參和三七兩種藥材，也未發(fā)現(xiàn)丹參酮類化合物，從不同的方法學(xué)和技術(shù)手段層面間接證實滴丸中丹參酮ⅡA含量較低的判定。

表4 樣品含量測定結(jié)果

Tab.4 Results of content determination of samples mg·g-1，n=3

“-”未檢出

“-” not check out

對兩類廣泛應(yīng)用的復(fù)方丹參制劑中多組分活性成分進行含量測定，是對質(zhì)量控制方法的拓展和補充。由于兩類制劑的化學(xué)成分含量有一定的差異，其功能主治、用法用量等在藥效學(xué)研究，臨床研究后確定是否應(yīng)有所區(qū)別[14]。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.021

Determination of Seven Active Components Compared withFufangDanshenTablets and Dripping Pills by HPLC

ZHANG Aibing1,ZHANG Jun2, CHENG Yuefa2, ZHANG Chunyu1，GUO Lan2, LIU Yingshuo2

(1.TangshanInstituteforDrugControl,HebeiProvince,Tangshan063000,China；2.JitangCollegeofHebeiUnitedUniversity,Tangshan063300,China)

Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of seven active components inFufangDanshentablets andFufangDanshendripping pills. Methods These seven compounds were analyzed simultaneously with a Zorbax C18column by gradient elution using acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution as mobile phase, the flow rate was 1 mL·min-1and the detection wavelength was set at 203, 270 and 281 nm, respectively. Results All the seven components showed good linear relation between peak area and concentration of the test, and the average recoveries were between 95.1%-100.4%.Tanshinone ⅡA was not detected in samples of dropping pills. Conclusion The HPLC method to determine the components including tanshinone ⅡA, salvianolic acid B, propanoid acid, protocatechuic aldehyde, notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1of the two differentDanshenpreparations has been established, and it has the advantages of simplicity, high precision, good repeatability, and can be used for the quality control of two kinds ofFufangDanshenpreparations.The content of tanshinone Ⅱ A inFufangDanshentablet was distinctly higher than that of dropping pills.

FufangDanshentablets；FufangDanshendripping pills；Active components；Chromatography,high performance liquid

2014-04-23

2014-07-29

*唐山市2013年科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃基金資助項目(13130298z)；2012年河北聯(lián)合大學(xué)科學(xué)研究基金資助項目(z201242)

張愛兵(1972-)，男，河北唐山人，主管藥師，學(xué)士，從事藥物分析和藥品檢驗。電話：0315-2034098，E-mail：zhangaibing2013@163.com。

程月發(fā)(1967-)，男，安徽桐城人，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物藥理學(xué)研究。電話：0315-8114108，E-mail：arthurcyf@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)08-1067-05