3個(gè)竹種的花粉特性觀察及花粉培養(yǎng)和貯藏條件篩選

林樹(shù)燕， 趙 榮， 李 潔， 鄭 笑， 丁雨龍,①

(南京林業(yè)大學(xué)： a. 竹類(lèi)研究所， b. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037)

3個(gè)竹種的花粉特性觀察及花粉培養(yǎng)和貯藏條件篩選

林樹(shù)燕a,b， 趙 榮b， 李 潔b， 鄭 笑b， 丁雨龍a,b,①

(南京林業(yè)大學(xué)： a. 竹類(lèi)研究所， b. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 南京 210037)

竹類(lèi)植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期很長(zhǎng)，大多數(shù)竹種開(kāi)花后即死亡，因而對(duì)竹類(lèi)開(kāi)花生物學(xué)及生殖生物學(xué)的研究相對(duì)較少[1-2]。花粉萌發(fā)和貯藏特性是竹類(lèi)開(kāi)花生物學(xué)特性研究的重要內(nèi)容之一，目前主要集中于花粉粒的形態(tài)和活力等方面[3-8]，關(guān)于竹類(lèi)花粉萌發(fā)和貯藏條件的相關(guān)研究尚不多見(jiàn)。為此，作者對(duì)鵝毛竹(ShibataeachinensisNakai)、孝順竹〔Bambusamultiplex(Lour.) Raeusch. ex Schult. et J. H. Schult.〕和異葉苦竹〔Arundinariasimoniif.heterophyllus(Makino et Shirasawa) Muro〕的花粉形態(tài)和活力、萌發(fā)和貯藏條件進(jìn)行了研究，以期為竹類(lèi)生殖生物學(xué)研究及3個(gè)竹種的遺傳育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試3個(gè)竹種的花粉于2009年至2012年的3月份至5月份(盛花期)采自南京林業(yè)大學(xué)竹種園。選取4個(gè)不同單株上的小花，采集成熟且未散粉的花藥，各竹種重復(fù)采樣3次；迅速用FAA固定液固定，于4 ℃保存，用于花粉形態(tài)觀察。用于花粉活力測(cè)定和培養(yǎng)的花藥則隨采隨用。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態(tài)觀察 取已固定花粉，洗凈并依次用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇和無(wú)水乙醇脫水，分別用K850型臨界點(diǎn)干燥儀和E-1010型離子濺射儀進(jìn)行干燥和噴金，用FEI QUANTA-200型掃描電子顯微鏡觀察并拍照。各竹種選10個(gè)視野，各視野選10粒以上花粉粒測(cè)量直徑，各重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.2 花粉活力測(cè)定 用I2-KI染色法[9]檢測(cè)花粉活力，并用Leica DM2500型生物顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)各視野中花粉粒總數(shù)和染色花粉粒數(shù)并計(jì)算花粉活力，結(jié)果取平均值。各竹種鏡檢5個(gè)視野(每個(gè)視野花粉粒數(shù)大于25)，各重復(fù)3次。

1.2.3 花粉培養(yǎng)條件篩選 采用培養(yǎng)基發(fā)芽法[10]用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%蔗糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%硼酸的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5和6 h后取花粉，用Leica DM2500型生物顯微鏡觀察花粉萌發(fā)狀況，以花粉管長(zhǎng)度超過(guò)花粉粒直徑為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每次取樣均鏡檢3個(gè)視野(各視野花粉數(shù)大于50)，各重復(fù)5次，計(jì)算花粉萌發(fā)率平均值，并據(jù)此確定各竹種花粉的最適培養(yǎng)時(shí)間。分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%、0.005%和0.010%硼酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%、15%和20%蔗糖交叉配制成12種簡(jiǎn)單培養(yǎng)基，用上述最適培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)花粉，計(jì)算花粉萌發(fā)率，據(jù)此確定各竹種花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基。

1.2.4 花粉萌發(fā)率日變化觀察 在盛花期晴天的7：00至16：00每隔1 h采集1次尚未散粉的花藥，用上述最適培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h，并按上述方法計(jì)算花粉萌發(fā)率，分析其日變化規(guī)律。

1.2.5 花粉貯藏條件和貯藏時(shí)間篩選 在盛花期的10：00采集異葉苦竹花粉，分別置于室溫(25 ℃)和低溫(4 ℃、-5 ℃、-10 ℃)下保存；一部分花粉中加入硅珠，視為干燥保存；另一部分花粉不經(jīng)干燥直接保存。分別在貯藏1、3、6、10、24、32、48、72、96和120 h后取樣觀察并計(jì)算花粉萌發(fā)率，至視野中無(wú)花粉萌發(fā)時(shí)停止觀察。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算及處理

按照公式“花粉活力=(染色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%”和“花粉萌發(fā)率=(萌發(fā)花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù))×100%”計(jì)算花粉活力和花粉萌發(fā)率。用EXCEL 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用SPSS 13.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 花粉形態(tài)及萌發(fā)特征

3個(gè)竹種的花粉均呈近球形(圖1)，具單個(gè)圓形或橢圓形萌發(fā)孔，明顯且內(nèi)凹，具孔環(huán)和蓋；外壁紋飾為細(xì)顆粒狀(圖1-1,4,7)；花粉外壁極薄，易皺癟破裂。鵝毛竹、孝順竹和異葉苦竹的花粉直徑分別為23.5～51.7、32.70～41.57和18.8～28.2 μm，平均直徑分別為40.22、36.77和27.86 μm。在鵝毛竹花粉和花粉管中可見(jiàn)2個(gè)精核和1個(gè)生殖核(圖1-2,3)。

1-3. 鵝毛竹Shibataeachinensis: 1. 花粉形態(tài) Pollen morphology; 2. 2個(gè)精細(xì)胞和1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞 Two sperms and one vegetative cell; 3. 萌發(fā)的花粉Germinated pollen. 4-5. 孝順竹Bambusamultiplex: 4. 花粉形態(tài)Pollen morphology; 5. 萌發(fā)的花粉Germinated pollen. 6-9. 異葉苦竹Arundinariasimoniif.heterophyllus: 6. 萌發(fā)的花粉Germinated pollen; 7. 花粉形態(tài)Pollen morphology; 8. 精細(xì)胞到達(dá)萌發(fā)孔Sperm reaches to aperture; 9. 花粉管中的精細(xì)胞Sperms in pollen tube.

圖1 供試3個(gè)竹種的花粉形態(tài)

Fig. 1 Pollen morphology of three bamboo species tested

2.2 花粉活力的比較

在鏡檢的440粒鵝毛竹花粉中，發(fā)育良好、不良和無(wú)活力的花粉分別占38.6%、55.5%和5.9%，花粉敗育率61.4%；在鏡檢的510粒孝順竹花粉中，發(fā)育良好、不良和無(wú)活力的花粉分別占75.1%、18.0%和6.9%，花粉敗育率24.9%；在鏡檢的554粒異葉苦竹花粉中，發(fā)育良好、不良和無(wú)活力的花粉分別占88.4%、6.9%和4.7%，花粉敗育率11.6%。

2.3 花粉的最適培養(yǎng)條件

2.3.1 最適培養(yǎng)時(shí)間 由表1可見(jiàn)：鵝毛竹、孝順竹和異葉苦竹的花粉萌發(fā)率分別在培養(yǎng)4、2和3 h時(shí)達(dá)到最高，分別為9.4%、15.7%和46.2%；但它們的花粉萌發(fā)率分別在培養(yǎng)3、2和2 h后無(wú)顯著差異，表明最佳培養(yǎng)時(shí)間以3 h內(nèi)為宜。

2.3.2 最適培養(yǎng)基 由表2可見(jiàn)：在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%硼酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%蔗糖的培養(yǎng)基中鵝毛竹和孝順竹的花粉萌發(fā)率最高，分別為9.1%和15.8%；在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.001%硼酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%蔗糖的培養(yǎng)基中異葉苦竹的花粉萌發(fā)率最高，為76.5%。當(dāng)硼酸含量相同時(shí)異葉苦竹的花粉萌發(fā)率隨蔗糖含量的提高而增大；鵝毛竹和孝順竹的花粉萌發(fā)率則在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%蔗糖的培養(yǎng)基中最高。

培養(yǎng)時(shí)間/hCulturetime花粉萌發(fā)率/% PollengerminationrateSCBMASH15.1±0.8b7.8±0.4b19.5±1.2b28.1±0.7b15.7±0.7a45.7±1.5a39.1±0.8a14.8±0.5a46.2±1.4a49.4±0.5a14.5±0.6a45.0±1.2a58.9±0.8a14.7±0.3a45.4±1.6a69.2±0.5a15.3±0.7a45.7±1.5a

1)SC: 鵝毛竹Shibataeachinensis; BM: 孝順竹Bambusamultiplex; ASH: 異葉苦竹Arundinariasimoniif.heterophyllus. 同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%Massratio硼酸Boricacid蔗糖Sucrose花粉萌發(fā)率/% PollengerminationrateSCBMASH0.00153.4±0.2c8.9±0.6c23.1±1.3c0.001106.7±0.4b12.1±0.7b41.6±1.6c0.001159.1±0.8a15.8±1.4a45.2±0.5c0.001202.3±0.5c7.8±0.5c76.5±1.7a0.00552.1±0.8c7.6±0.8c19.6±0.4c0.005105.2±0.3b8.2±0.5c32.8±1.2c0.005157.9±0.4ab10.2±1.2b35.4±1.4c0.005203.9±0.7c8.0±0.5c64.2±1.6b0.01051.7±0.9c7.1±0.8c16.4±0.4c0.010106.0±0.5b8.2±0.3c35.1±0.6c0.010157.8±0.6ab10.8±0.8b38.6±0.3c0.010203.8±0.3c7.7±0.9c69.8±0.8ab

1)SC: 鵝毛竹Shibataeachinensis; BM: 孝順竹Bambusamultiplex; ASH: 異葉苦竹Arundinariasimoniif.heterophyllus. 同列中不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05) Different small letters in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2.4 花粉萌發(fā)率的日變化規(guī)律

由3個(gè)竹種花粉萌發(fā)率的日變化曲線(圖2)可見(jiàn)：9：00至11：00采集的花粉萌發(fā)率較高。其中，9:00采集的鵝毛竹花粉萌發(fā)率最高，為9.2%；10：00采集的孝順竹和異葉苦竹的花粉萌發(fā)率最高，分別為15.7%和72.9%。3個(gè)竹種中異葉苦竹花粉萌發(fā)率的日變幅最大。

2.5 花粉的最適貯藏條件和貯藏時(shí)間

由圖3可見(jiàn)：在不同貯藏溫度下異葉苦竹新鮮花粉(采后未干燥)的萌發(fā)率總體上高于干燥花粉。在不同貯藏條件下貯藏1 h后花粉萌發(fā)率均急速下降，并隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減??；其中，在不同溫度下干燥花粉均在貯藏3～10 h后失去活力，而新鮮花粉在貯藏10 h后萌發(fā)率降幅趨緩?？傮w上看，異葉苦竹花粉不耐貯藏，其新鮮花粉較為適宜的貯藏溫度為-5 ℃和4 ℃，貯藏時(shí)間以10 h內(nèi)為宜。

—◆—: 鵝毛竹Shibataeachinensis; —▲—: 孝順竹Bambusamultiplex; —■—: 異葉苦竹Arundinariasimoniif.heterophyllus.

圖2 3個(gè)竹種花粉萌發(fā)率的日變化曲線

Fig. 2 Daily change curve of pollen germination rate of three bamboo species

—: 干燥花粉 Dry pollen; ┄: 新鮮花粉 Fresh pollen; ◆: 室溫 Room temperature; ▲: 4 ℃; ■: -5 ℃; ●: -10 ℃. Ⅰ-Ⅹ： 貯藏時(shí)間分別為1、3、6、10、24、32、48、72、96和120 h Storage time is 1, 3, 6, 10, 24, 32, 48, 72, 96 and 120 h， respectively.

圖3 不同貯藏條件下異葉苦竹花粉萌發(fā)率的變化

Fig. 3 Change of pollen germination rate ofArundinariasimoniif.heterophyllus(Makino et Shirasawa) Muro under different storage conditions

3 討 論

鵝毛竹、孝順竹和異葉苦竹的花粉均為近球形，具單個(gè)萌發(fā)孔，有明顯的孔環(huán)和蓋，萌發(fā)孔內(nèi)凹，這些特征與禾本科(Gramineae)植物的花粉形態(tài)[3]特征基本一致。因此，雖然不同竹種的花粉大小有差異，但花粉形態(tài)相似。

供試3個(gè)竹種花粉萌發(fā)率差別較大，且花粉敗育率也較高；雄性敗育可導(dǎo)致野外條件下鵝毛竹不結(jié)實(shí)，孝順竹和異葉苦竹僅能收獲少量種子。三細(xì)胞型(1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和2個(gè)精細(xì)胞)花粉壽命比二細(xì)胞型(1個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和1個(gè)精細(xì)胞)花粉短，而禾本科植物的三細(xì)胞型花粉的壽命相對(duì)更短[11]。異葉苦竹的花粉在貯藏1 h后活力迅速下降，也表明其花粉不耐貯藏、壽命較短。在供試的3個(gè)竹種中，異葉苦竹的花粉萌發(fā)率相對(duì)較高，但在干燥條件下其花粉萌發(fā)率明顯降低。因此，適當(dāng)?shù)臐穸扰c低溫條件是異葉苦竹花粉貯藏的必要條件。

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(責(zé)任編輯: 郭嚴(yán)冬)

Observation on pollen character and selection of pollen culture and storage conditions of three bamboo species

LIN Shuyana,b, ZHAO Rongb, LI Jieb, ZHENG Xiaob, DING Yulonga,b,①

(Nanjing Forestry University: a. Bamboo Research Institute, b. Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing 210037, China),

J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(4): 111-113

Pollen character and viability ofShibataeachinensisNakai,Bambusamultiplex(Lour.) Raeusch. ex Schult. et J. H. Schult. andArundinariasimoniif.heterophyllus(Makino et Shirasawa) Muro were observed, and suitable culture and storage conditions of pollen were selected by taking pollen germination rate as the index. Results show that pollen of three bamboo species is nearly spherical with a single aperture, obvious pore ring and cover, aperture is concave. The highest germination rate ofS.chinensis,B.multiplexandA.simoniif.heterophyllusis 9.1%, 15.8% and 76.5%, respectively. Suitable culture medium for pollens ofS.chinensisandB.multiplexcontains boric acid and sucrose with mass ratios of 0.001% and 15%, respectively, while that for pollen ofA.simoniif.heterophylluscontains boric acid and sucrose with mass ratios of 0.001% and 20%, respectively, and the appropriate culture time is less than 3 h. The suitable storage conditions for pollen ofA.simoniif.heterophyllusare storing fresh pollen under 4 ℃ or -5 ℃ for less than 10 h.

竹類(lèi); 花粉形態(tài); 花粉活力; 花粉萌發(fā)率; 培養(yǎng)和貯藏條件

bamboo; pollen morphology; pollen viability; pollen germination rate; culture and storage conditions

2015-04-27

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD23B05)； 中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014M560427)； 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31000294)； 江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(PAPD)

林樹(shù)燕(1976—)，女，山東濰坊人，博士，副教授，主要從事竹類(lèi)植物發(fā)育學(xué)的研究。

①通信作者E-mail: ylding@vip.126.com

Q944.59; Q945.4

A

1674-7895(2015)04-0111-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.04.16