異氟烷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經保護作用及作用機制研究

張 睿，楊祖悌，張同寅，宋海軍，王 斌

·論著·

異氟烷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經保護作用及作用機制研究

張 睿，楊祖悌，張同寅，宋海軍，王 斌

目的 探討異氟烷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經保護作用及作用機制。方法 選擇成年健康雄性SD大鼠80只，采用隨機數(shù)字表法分為假手術組、腦損傷組、異氟烷預處理組和異氟烷后處理組，每組20只。采用改良Feeney自由落體法制作大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，假手術組大鼠僅做開窗手術處理，異氟烷預處理組大鼠在造模前給予異氟烷持續(xù)麻醉，腦損傷組和異氟烷后處理組大鼠造模成功后立即進行復蘇，且異氟烷后處理組大鼠于復蘇后給予異氟烷持續(xù)麻醉。采用神經功能缺損評分表(NSS)評定各組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h神經功能缺損情況，免疫印跡法檢測各組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織磷酸化Akt(P-Akt)、磷酸化糖原合酶激酶-3β(P-GSK3β)、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表達量，TUNEL法檢測各組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織凋亡神經元數(shù)量。結果 腦損傷組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h NSS評分高于假手術組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組，異氟烷預處理組和異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h NSS評分高于假手術組(P<0.05)。腦損傷組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織P-Akt蛋白和P-GSK3β蛋白表達量高于假手術組，異氟烷預處理組和異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織P-AktA蛋白和P-GSK3β蛋白表達量高于腦損傷組(P<0.05)。腦損傷組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織Bcl-2蛋白表達量低于假手術組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組，cleaved-caspase-3蛋白表達量及凋亡神經元數(shù)量高于假手術組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組，異氟烷預處理組和異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織cleaved-caspase-3蛋白表達量、凋亡神經元數(shù)量高于假手術組(P<0.05)。結論 異氟烷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠具有神經保護作用，其可能通過激活Akt/GSK3β信號通路而發(fā)揮神經保護作用。

腦損傷；異氟烷；大鼠

創(chuàng)傷性腦損傷在世界范圍內具有較高的發(fā)生率、致死率和致殘率，會給社會和家庭帶來沉重的經濟負擔，但目前臨床上尚缺乏治療創(chuàng)傷性腦損傷的有效藥物[1]。創(chuàng)傷性腦損傷主要包括原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷，其中原發(fā)性腦損傷是指暴力作用于頭部后立即發(fā)生的腦損傷；繼發(fā)性腦損傷是原發(fā)性腦損傷發(fā)生后數(shù)小時至數(shù)天發(fā)生的腦損傷，目前有效治療繼發(fā)性腦損傷是創(chuàng)傷性腦損傷研究的熱點[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷在腦缺血再灌注損傷和蛛網(wǎng)膜下腔出血導致的腦損傷中具有明顯的神經保護作用[3-4]。本研究通過探討異氟烷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經保護作用及作用機制，旨在為創(chuàng)傷性腦損傷的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 選擇成年健康雄性SD大鼠80只，體質量230～260 g，周齡7～8周，由河南大學實驗動物中心提供。主要試劑：異氟烷(由美國Baxter公司提供，產品批號GG522)，磷酸化Akt(P-Akt)、磷酸化糖原合酶激酶-3β(P-GSK3β)、Bcl-2、cleaved-caspase-3、β-actin(1∶1 000)均購自美國cell signaling公司，TUNEL檢測試劑盒購自美國羅氏生物公司，蛋白提取試劑盒購自南通碧云天生物公司。

1.2 分組及試驗方法 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組、腦損傷組、異氟烷預處理組和異氟烷后處理組，每組20只，實驗過程中出現(xiàn)死亡大鼠應及時補齊。假手術組大鼠僅做開窗處理；異氟烷預處理組大鼠在造模前12 h給予2%異氟烷持續(xù)麻醉60 min；腦損傷組和異氟烷后處理組大鼠造模成功后立即進行復蘇，異氟烷后處理組大鼠于造模后10 min通過氣管插管使用2%異氟烷持續(xù)麻醉60 min。

1.3 模型制備 采用改良Feeney自由落體法[5]制備大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型：將大鼠用純氧和2%異氟烷麻醉后固定于立體定向支架上，備皮消毒后于大鼠冠狀縫中線右側3 mm、矢狀縫后3 mm處使用骨科鉆做直徑為5 mm的骨窗，保持硬腦膜的完整，40 g重物自15 cm高處自由落體垂直撞擊于右側硬腦膜墊上，致傷深度為3 mm，直徑為4 mm。

1.4 觀察指標 比較各組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h神經功能評分，創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織P-Akt、P-GSK3β、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表達量及凋亡神經元數(shù)量。

1.4.1 神經功能評分 采用神經功能缺損評分表(neurological severity scores，NSS)評定創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經功能[6]，主要內容包括運動功能、感覺功能、平衡能力、生理反射缺陷和異常運動，最高分18分，不能執(zhí)行任務或缺乏相應反應者計為1分，其中1～6分為輕度損傷、7～12分為中度損傷、13～18分為重度損傷。

1.4.2 免疫印跡法檢測蛋白表達量 創(chuàng)傷性腦損傷后24 h，每組取10只SD大鼠使用2%異氟烷麻醉后，經心尖灌注0.9%氯化鈉溶液100 ml，取損傷灶周圍腦組織放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取損傷灶周圍腦組織100 mg加入蛋白裂解液，比例為每20 mg腦組織加150～250 μl裂解液，用玻璃勻漿器充分勻漿至完全裂解后，4 ℃恒溫離心機14 000×g離心10 min，取上清液后，采用Bradford法進行蛋白定量檢測，按1∶4的比例加入5×loading沸水中煮10 min進行蛋白變性，按每孔加入35 μg蛋白，電泳、轉膜后封閉1 h，加入P-Akt、P-GSK3β、Bcl-2、cleaved-caspase-3、β-actin一抗稀釋液，4 ℃搖床過夜，加入二抗后，洗膜，滴加ECL顯影液，Image J軟件進行灰度分析，記錄P-Akt、P-GSK3β、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表達量。

1.4.3 TUNEL法檢測細胞凋亡情況 創(chuàng)傷性腦損傷后24 h，每組取10只SD大鼠使用2%異氟烷麻醉后，經左心尖灌注0.9%氯化鈉溶液100 ml和10%多聚甲醛，斷頭取腦后，采用石蠟常規(guī)包埋腦組織，使用切片機將石蠟包埋的腦組織切成4 μm切片，采用TUNEL法檢測凋亡神經元數(shù)量，操作步驟按照TUNEL檢測試劑盒說明書和以往文獻進行[7]。計數(shù)方法：細胞核呈現(xiàn)棕黃色為TUNEL陽性細胞，在光學顯微鏡下觀察損傷灶周圍腦組織TUNEL陽性細胞個數(shù)，在400倍鏡下隨機選取10個視野，將TUNEL陽性細胞的平均數(shù)作為最終結果。

2 結果

2.1 4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經功能評分比較 本研究共使用88只雄性SD大鼠，假手術組未出現(xiàn)死亡，模型組死亡3只，異氟烷預處理組死亡2只，異氟烷后處理組死亡3只。4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h NSS評分比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腦損傷組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h NSS評分高于假手術組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組，異氟烷預處理組和異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后12 h、24 h NSS評分高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of NSS score after 12 hours and 24 hours of traumatic brain injury among the four groups of rats

組別只數(shù)創(chuàng)傷性腦損傷后12h創(chuàng)傷性腦損傷后24h假手術組201.20±0.021.20±0.02腦損傷組2015.03±3.98a15.12±4.01a異氟烷預處理組2012.58±3.41ab12.39±3.13ab異氟烷后處理組2012.67±3.07ab12.51±3.31abH值83.8083.47P值0.000.00

注：與假手術組比較，aP<0.05；與腦損傷組比較，bP<0.05

2.2 4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織P-Akt蛋白和P-GSK3β蛋白表達量比較 4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織P-Akt蛋白和P-GSK3β蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腦損傷組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織P-Akt蛋白和P-GSK3β蛋白表達量高于假手術組，異氟烷預處理組和異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織P-AktA蛋白和P-GSK3β蛋白表達量高于腦損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖1)。

2.3 4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表達量及凋亡神經元數(shù)量比較 4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表達量及凋亡神經元數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。腦損傷組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織Bcl-2蛋白表達量低于假手術組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組，cleaved-caspase-3蛋白表達量及凋亡神經元數(shù)量高于假手術組、異氟烷預處理組及異氟烷后處理組，異氟烷預處理組和異氟烷后處理組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織cleaved-caspase-3蛋白表達量、凋亡神經元數(shù)量高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3、圖1、圖2)。

注：P-Akt=磷酸化Akt，P-GSK3β=磷酸化糖原合酶激酶-3β，GAPDH=3-磷酸甘油醛脫氫酶；1為假手術組，2為腦損傷組，3為異氟烷預處理組，4為異氟烷后處理組

圖1 4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷病灶周圍腦組織P-Akt、P-GSK3β、Bcl-2和cleaved-caspase-3蛋白表達情況

Figure 1 Protein expression of P-Akt，P-GSK3β，Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury among the four groups of rats

Table 2 Comparison of protein expression of P-Akt and P-GSK3β in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury among the four groups of rats

組別只數(shù)P-Akt蛋白表達量P-GSK3β蛋白表達量假手術組100.09±0.020.16±0.04腦損傷組100.11±0.07a0.18±0.06a異氟烷預處理組100.98±0.13ab0.56±0.19ab異氟烷后處理組101.01±0.17ab0.61±0.18abF值418.3662.84P值0.000.00

注：P-Akt=磷酸化Akt，P-GSK3β=磷酸化糖原合酶激酶-3β；與假手術組比較，aP<0.05；與腦損傷組比較，bP<0.05

3 討論

異氟烷是臨床上常用的鹵族吸入性麻醉劑，其作用靶點廣泛分布于大腦皮質、間腦、腦干和脊髓等中樞神經系統(tǒng)，近年研究發(fā)現(xiàn)異氟烷對多種中樞神經系統(tǒng)急性損傷(如腦缺血再灌注損傷、腦缺氧性損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血)有良好的神經保護作用，其神經保護作用機制主要通過抗凋亡、抗炎作用實現(xiàn)[8-10]。本研究結果表明，異氟烷可以明顯減輕創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經功能損傷、抑制凋亡蛋白——cleavage-caspase-3蛋白的表達、減少創(chuàng)傷性腦損傷后凋亡神經元數(shù)量，提示異氟烷在創(chuàng)傷性腦損傷中具有良好的神經保護作用。以往研究發(fā)現(xiàn)，異氟烷的神經保護作用可能與激活Akt/GSK3β信號通路有關，因此，在證實異氟烷可以明顯改善創(chuàng)傷性腦損傷程度后，本研究對其神經保護作用機制進行進一步探討。

Table 3 Comparison of protein expression of Bcl-2 and cleaved-caspase-3 and apoptotic nerve cell amount in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury among the four groups of rats

組別只數(shù)Bcl-2蛋白表達量cleavage-caspase-3蛋白表達量凋亡神經元數(shù)量(個)假手術組100.45±0.120.11±0.0115.0±3.6腦損傷組100.13±0.05a0.78±0.18a72.0±8.9a異氟烷預處理組100.41±0.13b0.32±0.12ab36.0±5.6ab異氟烷后處理組100.49±0.15b0.21±0.09ab35.0±5.1abF值37.89127.47301.19P值0.000.000.00

注：與假手術組比較，aP<0.05；與腦損傷組比較，bP<0.05

圖2 4組大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后24 h損傷灶周圍腦組織細胞凋亡情況(TUNEL染色，×400倍)

Figure 2 Apoptosis of nerve cell in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury of the four groups of rats

Akt由三個不同的功能區(qū)域構成：氨基末端的pleckstrin同源性(PH)結構域、中間的一個催化結構域和C-末端的調節(jié)性結構域，該區(qū)域的絲/蘇氨酸殘基的磷酸化是Akt完全活化所必需的物質。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)下Akt主要位于細胞質，當細胞受到外界信號刺激時，磷脂酰肌醇-3激酶被激活后在質膜上生成第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，PIP3與Akt蛋白中的PH結構域結合，結合后的Akt從細胞質轉移到細胞膜上，從而導致Akt的Ser473位點同時發(fā)生磷酸化而被激活，而活化后的Akt會轉移到細胞質或細胞核內。研究發(fā)現(xiàn)，活化的Akt通過與GSK3β結合而使Bcl-2家族成員發(fā)生磷酸化，從而發(fā)揮抗凋亡作用，且抑制凋亡執(zhí)行關鍵蛋白cleaved-caspase-3的表達；阻止線粒體釋放凋亡因子細胞色素c從線粒體到細胞質，阻斷或下調線粒體凋亡的發(fā)生[11]。以往研究已明確，Akt在創(chuàng)傷性腦損傷的病理損傷機制中發(fā)揮著重要作用，使用Akt特異性激活劑可以明顯加重創(chuàng)傷性腦損傷的病理損傷程度，加重腦損傷后神經功能缺損[12]；相反，使用Akt失活劑可以明顯減輕腦損傷的病理損傷程度，減輕神經功能缺損[13-15]，以上研究結果提示Akt可能成為創(chuàng)傷性腦損傷的治療靶點。本研究結果表明，異氟烷可以明顯上調Akt/GSK3β信號通路的活性，增加抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達，減少cleaved-caspas-3蛋白的表達和凋亡神經元數(shù)量，提示這可能是異氟烷在創(chuàng)傷性腦損傷中發(fā)揮神經保護作用的機制之一。

綜上所述，異氟烷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠有良好的神經保護作用，其機制可能與激活Akt/GSK3β信號通路有關。但未來還需要深入研究異氟烷發(fā)揮神經保護作用的詳細機制及異氟烷治療的理想劑量和時間窗，以期為異氟烷治療腦損傷打下堅實的理論基礎。

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(本文編輯：謝武英)

Neuroprotective Effect of Isoflurane in Rats with Traumatic Brain Injury and Its Mechanism

ZHANGRui，YANGZu-ti，ZHANGTong-yin，etal.

DepartmentofAnesthesiology，NanshiHospitalAffiliatedtoHe′nanUniversity，Nanyang473000，China

Objective To investigate the neuroprotective effect of isoflurane in rats with traumatic brain injury and its mechanism.Methods A total of 80 healthy male adult S-D rats were selected and divided into groups A，B，C，D，each of 20 rats.Modified Feeney freely falling body method was used to prepare rat model of traumatic brain injury，rats of A group were given open-window operation，rats of B group were given continue anesthesia of isoflurane before prepartion，rats of C group and D group were given CPR after preparation，and rats of D group were given extra continue anesthesia of isoflurane after CPR.NSS was used to evaluate the neurologic deficits after 12 hours and 24 hours of traumatic brain injury，immunoblotting was used to detect the protein expression of P-Akt，P-GSK3β，Bcl-2 and cleaved-caspase-3 in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury，and TUNEL was used to detect the apoptotic nerve cell amount in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury.Results NSS score after 12 hours and 24 hours of traumatic brain injury of C group was statistically significantly higher than that of A group，B group and D group，respectively，and that of B group and D group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.05).Protein expression of P-Akt and P-GSK3β in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury of B group，C group and D group were statistically significantly higher than those of A group，those of B group and D group were statistically significantly higher than those of C group(P<0.05).Protein expression of Bcl-2 in brain tissues around nidus after 24 hours of traumatic brain injury of C group was statistically significantly lower than that of A group，B group and D group，respectively，while protein expression of cleaved-caspase-3 and apoptotic nerve cell amount of C group were statistically significantly higher than those of A group，B group and D group，protein expression of cleaved-caspase-3 and apoptotic nerve cell amount of B group and D group were statistically significantly higher than those of A group(P<0.05).Conclusion Isoflurane has certain neuroprotective effect in rats with traumatic brain injury，it may play a role of neuroprotection by activating the Akt/GSK3β signal pathway.

Brain injuries；Isoflurane；Rats

國家自然科學基金資助項目(81172415)；河南省科技廳資助項目(0624410104)

473000河南省南陽市，河南大學附屬南石醫(yī)院麻醉科(張睿)；南陽醫(yī)學高等?？茖W校藥理教研室(楊祖悌，張同寅，宋海軍，王斌)

張睿，楊祖悌，張同寅，等.異氟烷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經保護作用及作用機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(8)：38-42.[www.syxnf.net]

R 651.15

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.08.012

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