玉米單倍體誘導率的優(yōu)化研究

姜 龍，慈佳賓，南 楠，崔學宇，田 敬，楊偉光

(1吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春130118;2東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024; 3吉林省前郭縣農(nóng)業(yè)局，吉林松原138000)

玉米單倍體誘導率的優(yōu)化研究

姜 龍1，慈佳賓1，南 楠2，崔學宇1，田 敬3，楊偉光1

(1吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，吉林長春130118;2東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024; 3吉林省前郭縣農(nóng)業(yè)局，吉林松原138000)

【目的】提高玉米單倍體誘導率.【方法】2011—2012年采用大田試驗，分析母本基因型材料、種質和世代的選擇、生態(tài)環(huán)境、授粉時期、果穗部位等5個處理因素對玉米單倍體誘導率的影響.【結果和結論】不同材料同一因素下以及同一材料不同因素下單倍體誘導率均存在差異.母本基因型間單倍體的誘導率差異顯著，尚未發(fā)現(xiàn)不同雜交模式與誘導率之間存在明顯的相關性;5大種質類群S1代為單倍體最佳誘導世代;三亞與長春相比更有利于提高單倍體的誘導率;早期授粉的玉米單倍體誘導率高于晚期授粉;果穗底部的單倍體誘導率低于頂部.

玉米;單倍體;誘導率

1959年Coe在玉米田中發(fā)現(xiàn)了孤雌生殖誘導系Stock6，利用Stock6作父本與其他玉米材料進行雜交，可在其子代中獲得一定數(shù)量的單倍體［1］.基于該方法發(fā)展起來的單倍體育種技術［玉米DH(Doubled haploid)育種技術］與分子標記輔助育種技術、轉基因技術形成了現(xiàn)代玉米育種技術的新體系［2］.國內外各大公司、科研院所和高等院校相繼開展了玉米DH育種，并用于實踐［3］.

采用常規(guī)技術獲得一個配合力高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的玉米自交系，需進行連續(xù)7～8代的人工自交與選擇，并且耗時耗力［4］.利用單倍體技術可大大縮短產(chǎn)生純合品系(DH系)的時間，一般只需要2～3代，選育純合材料的效率遠遠超過常規(guī)育種方法.但Stock6本身存在著誘導率偏低、花粉量偏少、抗病性差等嚴重缺陷［5］.為此，國內外研究者對其進行了改良.Lashermes等［6］從Stock6×W23(ig)后代中選育出誘導系SW14;Geiger等［7］從KEMS×SW14雜交后代中選育出了RWS，誘導率為8.1%;Sarkar等［8］從Sock6回交后代中獲得了誘導率超過5%的新材料;劉志增等［9］從Stock6×BHO(高油群體)后代中獲得誘導率達5.34%的農(nóng)大高誘1號;才卓等［10］以Stock6×M278為基礎材料進行遺傳改良，選育出誘導率在10%以上的吉高誘系3號.德國KWS公司、法國利馬格蘭公司和美國杜邦先鋒公司選育出誘導率6%以上的誘導系，并已開始商業(yè)化應用［11］.

玉米單倍體育種的首要條件是孤雌生殖誘導系的選育，加快育種進程要求高的單倍體誘導率.玉米單倍體誘導率的提高可以大大提高單倍體育種的效率，也可節(jié)約育種成本.Sarkar等［12］研究發(fā)現(xiàn)玉米單倍體的誘導率受諸多因素影響.本研究旨在分析和探討玉米單倍體育種實踐中影響誘導率的一些因素，進而提出相應的解決措施，為玉米單倍體育種實踐提供參考.

1 材料與方法

1.1 母本基因型效應

2011年夏選擇10個自交系、10個雜交組合為誘導材料種植于吉林農(nóng)業(yè)大學長春玉米育種基地，每個試驗材料種植1行，行距65 cm，密度為 6萬株·hm-2，無區(qū)組重復，試驗材料見表1，基礎材料涵蓋了東北地區(qū)常用的自交系及主要的雜種優(yōu)勢模式.父本為JS6-1.

母本吐絲后授粉，雜交誘導10～20個果穗，收獲后選擇結實較好的果穗混合脫粒，進行單倍體的初步鑒定，確定擬單倍體(胚乳紫色且胚無色)，所有擬單倍體于2012年春種植于吉林農(nóng)業(yè)大學長春玉米育種基地進行田間鑒定，根據(jù)田間鑒定結果統(tǒng)計不同基礎材料的單倍體誘導率.

表1 供試玉米自交系和雜交組合Tab.1 The tested maize inbred lines and hybridized combinations

1.2 不同種質的世代選擇效應

母本材料為吉林農(nóng)業(yè)大學作物遺傳教研室經(jīng)過多輪選擇不同世代的4大種質類群和熱帶種質群(表2).父本為JS6-1，雜交誘導試驗于2011年夏季在吉林農(nóng)業(yè)大學長春玉米育種基地進行，秋季共獲得不同世代的5個基礎種質群250個雜交果穗48 642粒種子，其中擬單倍體2 806粒.2012年春對收獲不同種質類群、不同世代的單倍體種子采用完全隨機試驗設計方法進行田間播種，單倍體鑒定方法同1.1.

表2 供試母本材料Tab.2 The tested female parentmaterials

試驗原始數(shù)據(jù)先在Excel軟件中進行處理，再用DPS［13］軟件進行數(shù)據(jù)分析.計算群單倍體誘導率，方法同李國良等［14］的方法.

1.3 不同生態(tài)環(huán)境條件效應

以JNY301、JNY611和JNY886(以上3品種為吉林農(nóng)業(yè)大學玉米育種課題組選育品種)以及生產(chǎn)上種植面積較大的先玉335(XY335)和鄭單958(ZD958)共5個雜交種作母本分別和誘導系JS6-2(農(nóng)大高誘1號改良系)進行雜交誘導，試驗材料見表3.2011年在長春和三亞兩地進行雜交誘導，從雜交組合中選擇10個結實性好的果穗對單倍體誘導率進行測定.其中長春基地行距65 cm，密度為9萬株·hm-2;三亞基地行距90 cm，密度為12萬株·hm-2，單倍體的具體鑒定方法同1.1.

表3 不同生態(tài)環(huán)境效應供試材料Tab.3 Experim entalmaterials for testing under different ecological conditions

1.4 不同授粉時期效應

2011年夏、2012年夏在吉林農(nóng)業(yè)大學長春玉米育種基地分別以鄭單958(ZD958)、JNY986、農(nóng)華101 (NH101)、JNY701為母本，以誘導系JS6-1為父本，選擇不同的授粉時期進行授粉，根據(jù)母本吐絲后的天數(shù)劃分授粉時期，即將吐絲時剪開苞葉授粉定義為0 d，剛吐絲時定義為1 d，依次往后記錄吐絲后的天數(shù)，具體分為以下3個處理:早期授粉0～2 d;中期授粉3～5 d;晚期授粉6～8 d.單倍體的鑒定方法同1.1.

1.5 果穗不同部位的誘導率

選擇鄭單958(ZD958)、先玉335(XY335)、利民33(LM33)、JNY986和農(nóng)華101(NH101)5個雜交種于2011年冬天種植于吉林農(nóng)業(yè)大學三亞育種基地，見表4.以誘導系JS6-3(吉高誘3號改良系)作父本和各雜交種雜交30穗，收獲后選擇結實性好的果穗按底部和頂部分開脫粒(各占果穗長1/2)，挑出擬單倍體，2012年夏在吉林長春進行單倍體的田間鑒定，具體鑒定方法同1.1.

表4 果穗不同部位效應供試材料Tab.4 Experim entalmaterials for testing different parts of them aize ear

2 結果與分析

2.1 母本基因型材料、種質和世代的選擇對單倍體誘導率的影響

由表5可知，誘導系JS6-1對各材料均具有誘導孤雌生殖單倍體的能力.不同母本基礎材料經(jīng)誘導后誘導率存在顯著差異，誘導率最高的是 J-18 (PH6WC×S122)，為10.13%，最低的是J-17(PHGJ4×丹340)，為4.97%，平均誘導率為8.42%.

由表6可知，在JS6-1誘導下，5個種質類群和5個種質世代均能產(chǎn)生單倍體，不同種質類群和種質世代的群單倍體誘導率的平均值差異明顯，由此可以列出不同種質類群、不同種質世代單倍體誘導率的二因素方差分析表，見表7.二因素方差分析表明:不同種質類群間P=0.006 4，達到極顯著水平，不同世代間P=0.018，達到顯著水平.

由表8可知，在不同類群單倍體誘導率的多重比較中，誘導系JS6-1對Lancaster(4.94%)和Reid類群(4.88%)授粉所產(chǎn)生平均群單倍體誘導率比較高;對塘四平頭和旅大紅骨類群單倍體誘導率為4.16%和4.08%，對熱帶種質群單倍體誘導率最低(2.12%).在玉米不同類群單倍體誘導率的多重比較中，JS6-1對4大類群授粉所產(chǎn)生的單倍體誘導率差異不顯著，其中對塘四平頭和旅大紅骨類群比熱帶處質群平均單倍體誘導率高，差異顯著(P＜0.05);對Lancaster和Reid類群授粉所產(chǎn)生平均群單倍體誘導率比熱帶種質平均單倍體誘導率高，差異顯著(P＜0.01).JS6-1對同一群體不同世代間誘導率表現(xiàn)為一般高世代S4、S5代單倍體誘導率高、每株單倍體粒數(shù)較低.S1、S2、S3代誘導率低、每株單倍體粒數(shù)較高，S1代單倍體誘導率較低，但材料種穗大、結實率高，實際得到的單倍體數(shù)量最多.JS6-1對S4、S5代平均群單倍體誘導率為5.14%，S4、S5代是S1～S3代平均單倍體誘導率(3.30%)的1.56倍.S4、S5代間單倍體誘導率差異不顯著，S1～S3代間差異也不顯著，但S4、S5代與S1～S3代單倍體誘導率差異顯著(P＜0.05).

表5 母本誘導基礎材料的單倍體誘導率比較Tab.5 Comparisons of the haploid induced rates of different female parentmaterials

表6 不同種質類群、不同世代的單倍體誘導率統(tǒng)計結果Tab.6 Statistical results of the haploid induced rates of different germplasms and generations

表7 不同種質類群、不同世代的單倍體誘導率方差分析表Tab.7 Variance analysis of the haploid induced rates of different germplasms and generations

表8 不同種質群、不同世代間單倍體誘導率的多重比較1)Tab.8 M ultip le com parisons of the haploid induced rates of the different germp lasm and generations

誘導系JS6-1對S1每株單倍體平均誘導數(shù)是12.36粒，比S4～S5平均每株單倍體誘導粒數(shù)(8.30粒)多4粒，即S1每株單倍體粒數(shù)顯著高于S4～S5代(P＜0.05)，S2～S3代每株單倍體粒數(shù)差異不顯著，S4～S5代間亦如此.

2.2 生態(tài)環(huán)境、授粉時期和果穗部位對單倍體誘導率的影響

三亞冬季單倍體誘導率高于長春夏季，其中XY335、ZD958、JNY611在三亞的誘導率(4.87%、4.35%、3.80%)顯著高于長春的(3.95%、3.37%、2.09%)(P＜0.05)，JNY886和JNY301在2個地點間的誘導率差異不顯著.三亞的單倍體誘導率極顯著高于長春(P＜0.01)，其中三亞冬季的平均誘導率為3.15%，而長春夏季的誘導率僅為1.99%(表9).

表9 2010—2013年長春和三亞兩地點間的誘導率比較Tab.9 Comparisons of the haploid induced rates between Changchun and Sanya from 2010 to 2013

由表10可知，延遲授粉一般有降低玉米單倍體誘導率的趨勢，除2011年以JNY701為母本，2012年以ZD958、JNY701為母本，晚期授粉時的單倍體誘導率高于中期授粉的誘導率.此外，早期授粉的單倍體平均誘導率最高(1.99%)，其次是中期授粉(1.87%)，晚期授粉的平均誘導率最低(1.59%).

表10 不同母本誘導基礎吐絲后不同天數(shù)和JS6-1雜交后的單倍體頻率比較Tab.10 Comparisons of the haploid induced rates under different pollination stages after silking

由表11可知，除NH101之外，其余4個雜交果穗中頂部出現(xiàn)的單倍體頻率均高于底部，其中頂部單倍體平均誘導率為4.33%，底部的為3.51%.

3 討論與結論

表11 果穗頂部和底部的誘導率比較Tab.11 Comparisons of the haploid induced rates between top and bottom parts of ear

3.1 誘導系與母本基因型的互作

本研究表明單倍體誘導率高低與母本基因型有關，彼此間差異顯著，這與Rober等［15］、劉志增等［9］等的研究結果相一致.Chase［16］認為這種影響是由于母本基因型所產(chǎn)生的雌配子中有害基因的頻率不同造成的.本研究結果表明Lancaster、Reid類群材料的單倍體誘導率顯著高于塘四平頭類群、旅大紅骨類群、地方種質群和熱帶種質群.

3.2 誘導世代的選擇

Lashermes等［17］以 Stock6作父本，以 169wx/ Syn421等3個組合作母本，比較了F2及F3世代的單倍體誘導率，得出兩世代間的相關性只有0.59.李國良等［14］研究得出早代S1為最佳的單倍體誘導世代.本研究表明也得出了類似結論:在不同類群的高世代中S4～S5單倍體誘導率高于S1～S3，但每株獲得的單倍體粒數(shù)卻低于后者;S1單倍體誘導率較低，但收獲的材料果穗大，實際得到的單倍體數(shù)量最多.S1是植株性狀急劇分離的世代，可以通過植株抗病性、株高等田間農(nóng)藝性狀去除一些偽單倍體植株，選擇一些比較優(yōu)良的單株進行誘導獲得單倍體，可以大大減少工作量，提高優(yōu)良DH系出現(xiàn)的概率，因此本研究認為早代S1為單倍體最佳誘導世代.

綜合考慮，如果雙親差異大，后代分離的基因較多，則僅靠1次重組就需要很大的群體才可能獲得優(yōu)良重組基因型.從玉米育種角度來說建議此類材料可以在S1代或更高世代誘導，而對于窄基群體則可以在S0代誘導.

3.3 誘導環(huán)境的優(yōu)化

Prigge等［17］在熱帶地區(qū)進行單倍體誘導得出2個環(huán)境下單倍體的誘導率具有顯著差異，但Eder等［18］對12份基礎材料在2種不同的生態(tài)環(huán)境下誘導并沒有發(fā)現(xiàn)單倍體誘導率存在顯著差異.黎亮等［19］多年試驗結果也證實了在海南冬季進行單倍體誘導的效率顯著高于北京夏季.本研究發(fā)現(xiàn)三亞冬季的誘導率顯著高于長春夏季.長春夏季氣溫較高，三亞冬季氣溫較低且晝夜溫差大，而氣溫較低的情況下可能更適合籽粒發(fā)育及色素標記基因的表達.

3.4 誘導時期的優(yōu)化

Chase［16］和Seaney等［20］的研究結果都表明延遲授粉可以提高玉米單倍體誘導率.本研究發(fā)現(xiàn)果穗頂部籽粒的單倍體誘導率高于底部，這與 Sarkar等［12］、Chalyk等［21］的研究結果相似.這可能與卵細胞成熟的不同步、營養(yǎng)功能的變化、某些外界因子的局部影響等有關.本研究發(fā)現(xiàn)早期授粉的單倍體誘導率高于晚期授粉，此現(xiàn)象尚無法用花絲長短進行解釋.Rotarenco等［22］認為這與異雄核受精有關，由于吐絲時間長的花絲直徑更大，可以容納更多的花粉管生長，單受精的概率可能降低，進而影響單倍體出現(xiàn)的概率.不同生態(tài)環(huán)境下單倍體誘導率的差異也可能與花絲自身結構以及花粉的活力有關.

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【責任編輯 霍 歡】

Studies on the optim ization ofmaize haploid induced rates

JIANG Long1，CI Jiabin1，NAN Nan2，CUIXueyu1，TIAN Jing3，YANGWeiguang1
(1 College of Agronomy，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;2 School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China;3 Agricultural Bureau of Qianguo County in Jilin Province，Songyuan 138000，China)

【Objective】To optimize the technical measures to improve maize haploid induced rates.【Method】Effects of five factors，including parent genotypes，selection of germplasm and generations，environments，pollination period，parts ofmaize ear on the rates ofmaize haploid were conducted in the field from 2011 to 2012.【Resultand conclusion】The haploid induced rateswere differentamong different materialswith the same factor and different among different factorswith the samematerials.The haploid induced rates in female parent genotypeswere significantly different.There was no significant correlation between the crossing pattern and the induced rate.The optimal induced haploid generation of five germplasmswas S1.Compared to Changchun，Sanya wasmore conducive to improve the induced rate of haploid.The haploid induced rate of early pollination maize was higher than that of the late ones.The haploid induced rate at the top of themaize ear was higher than that at the bottom.

maize;haploid;induced rate

S513.032

A

1001-411X(2015)02-0019-06

姜 龍，慈佳賓，南 楠，等.玉米單倍體誘導率的優(yōu)化研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2015，36(2):19-24.

2014-09-18 優(yōu)先出版時間:2015-01-21

優(yōu)先出版網(wǎng)址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20150121.0927.005.html

姜 龍(1988—)，男，博士研究生;通信作者:楊偉光(1960—)，男，教授，博士，E-mail:ywg789@126.com

國家863計劃(2011AA10A103);農(nóng)業(yè)部948項目(2011-G1-21);“十二五”國家科技計劃(2011BAD35B00)