腸道菌群失調(diào)對內(nèi)臟敏感性的影響及其機制

邵 琿，王進海，張 杰，楊龍寶，謝丹紅

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.消化內(nèi)科，陜西省腸胃動力疾病研究重點實驗室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心；2.核醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710004）

◇基礎(chǔ)研究◇

腸道菌群失調(diào)對內(nèi)臟敏感性的影響及其機制

邵 琿1，王進海1，張 杰2，楊龍寶1，謝丹紅1

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.消化內(nèi)科，陜西省腸胃動力疾病研究重點實驗室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心；2.核醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710004）

目的檢測腸道菌群失調(diào)大鼠的內(nèi)臟敏感性變化及緊密連接蛋白（ZO-1）、Toll樣4受體（TLR4）的表達(dá)，探討腸道菌群失調(diào)對內(nèi)臟敏感性的影響及其機制。方法SPF級SD大鼠30只，隨機分為正常對照組（12只）、菌群失調(diào)組（18只）。菌群失調(diào)組采用鹽酸林可霉素（300 mg/m L）灌胃，1 m L/（次·只），1次/d，連續(xù)給藥7 d；正常對照組采用等量生理鹽水灌胃。第8天隨機抽取菌群失調(diào)組和正常對照組大鼠各6只，檢測模型是否成功。模型建立成功后，將其余12只菌群失調(diào)組大鼠隨機分組：陰性對照組、益生菌干預(yù)組，每組6只。益生菌干預(yù)組給予雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊（培菲康）灌胃，1粒/3 m L生理鹽水，1 m L/（次·只），1次/d，連續(xù)給藥7 d；陰性對照組給予同等量生理鹽水灌胃。第8天進行糞便菌群培養(yǎng)、檢測內(nèi)臟敏感性、檢測結(jié)腸組織中ZO-1及TLR4的mRNA和蛋白表達(dá)、檢測血清中炎性因子IL-10、TNFα的表達(dá)。結(jié)果與正常對照組比較，菌群失調(diào)組大鼠結(jié)腸ZO-1的mRNA含量及蛋白表達(dá)顯著降低，而結(jié)腸TLR4的含量及蛋白表達(dá)顯著升高，且血清中促炎因子TNFα表達(dá)顯著升高，而抑炎因子IL-10的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與菌群失調(diào)組相比，益生菌干預(yù)組結(jié)腸ZO-1的m RNA含量及蛋白表達(dá)顯著升高，而結(jié)腸TLR4的mRNA含量及蛋白表達(dá)顯著降低，且血清中促炎因子TNFα表達(dá)顯著降低而抑炎因子IL-10的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論通過抑制結(jié)腸中ZO-1的表達(dá)及升高TLR4的表達(dá)，進而導(dǎo)致慢性低度炎癥的發(fā)生可能是腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感的作用機制之一，同時益生菌制劑可能通過恢復(fù)腸道菌群變化進而改善內(nèi)臟高敏感。

腸道菌群失調(diào)；內(nèi)臟高敏感；腸易激綜合征；低度炎癥；緊密連接蛋白（ZO-1）；Toll樣4受體（TLR4）；益生菌

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是以腹痛或者腹部不適伴排便習(xí)慣或大便性狀改變?yōu)樘卣?，癥狀持續(xù)或間歇發(fā)作，經(jīng)相關(guān)檢查無器質(zhì)性病變證據(jù)的綜合征。IBS發(fā)病機制復(fù)雜，其中內(nèi)臟高敏感是其最主要的病理機制之一［1］，也是評價IBS造模成功與否的重要標(biāo)志。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)在IBS的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用［2-4］。目前，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IBS患者原來穩(wěn)定的腸道菌群出現(xiàn)紊亂會影響感覺功能和內(nèi)臟敏感性［5-8］，部分IBS患者腸黏膜中存在低度炎癥［1，9-11］，而腸道菌群改變導(dǎo)致的感覺異常又由變化的生理性炎癥所調(diào)節(jié)，故其提議將“腸道菌群失調(diào)—腸道低度炎癥—內(nèi)臟高敏感”建立在一個新的概念模型里［10］，但尚沒有學(xué)者去驗證這一想法。因此，本課題建立了腸道菌群失調(diào)大鼠模型，通過觀察菌群失調(diào)組大鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白（tight junction protein，ZO-1）、Toll樣4受體（Tolllike receptor 4，TLR4）的表達(dá)水平，及血清中促炎因子TNFα、抑炎因子IL-10的表達(dá)水平，探索腸道菌群對內(nèi)臟敏感性的影響及可能的調(diào)控機制，從而為IBS的發(fā)病機制提供一個新的理論依據(jù)，為IBS的治療及藥物研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。德國Braun 8F導(dǎo)尿管；數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，西安交通大學(xué)實驗室提供；法國BioMerieux厭氧培養(yǎng)袋；雙歧三聯(lián)活菌膠囊（培菲康）購自上海信誼藥廠有限公司；Trizol、PrimeScript RT Master Mix試劑盒、SYBR Premic Ex TaqⅡ試劑盒均購自日本Ta KaRa公司；美國Bio-red公司熒光定量PCR儀；冷凍離心機（北京時代）；兔抗大鼠ZO-1抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠TLR4抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；日本Olympus光學(xué)顯微鏡；大鼠TNF-αELISA試劑盒、大鼠IL-10 ELISA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及指標(biāo)檢測 SPF級雄性SD大鼠30只，隨機分為正常對照組（12只）、菌群失調(diào)組（18只）。分籠飼養(yǎng)，每籠6只，適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后，采用鹽酸林可霉素（300 mg/m L）灌胃建立腸道菌群失調(diào)大鼠模型［12］，1 m L/（次·只），1次/d；正常對照組采用等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥7 d，第8天隨機抽取正常對照組及菌群失調(diào)組大鼠各6只，觀察大鼠一般行為，取新鮮糞便進行菌群培養(yǎng)［13］，用腹部回撤反應(yīng)（abdominal withdrawal reflex，AWR）檢測內(nèi)臟敏感性［14］，并處死取結(jié)腸組織以檢測ZO-1及TLR4的m RNA和蛋白表達(dá)，取靜脈血以檢測血清中炎性因子IL-10、TNFα的表達(dá)。模型建立成功后，將其余12只菌群失調(diào)組大鼠隨機分為陰性對照組、益生菌干預(yù)組，每組6只。益生菌干預(yù)組給予培菲康1粒溶于3 m L生理鹽水中灌胃，1 m L/（次·只），1次/d；陰性對照組給予同等量生理鹽水灌胃。7 d后同樣觀察大鼠的一般行為，糞便菌群培養(yǎng)，檢測內(nèi)臟敏感性及ZO-1、TLR4的m RNA和蛋白表達(dá)，檢測血清中IL-10、TNFα的表達(dá)。

1.2.2 腸道菌群檢測 取新鮮無污染大便0.5 g，加入4.5 mL無菌生理鹽水混勻，按10倍連續(xù)稀釋法用無菌生理鹽水稀釋至10-8，取10-4、10-5、10-6稀釋液各50μL分別接種在選擇性培養(yǎng)基上。選擇性培養(yǎng)基分別為腸桿菌（EMB）、腸球菌（EF）、雙歧桿菌（BS）、乳酸桿菌（LBS）。腸桿菌及腸球菌于需氧環(huán)境下，37℃培養(yǎng)24～48 h，雙歧桿菌及乳酸桿菌于厭氧環(huán)境下37℃培養(yǎng)48 h。觀察結(jié)果以每克糞便中菌落形成單位的對數(shù)值表示（log CFU/g），并計算雙歧桿菌和腸桿菌的比值（B/E值）代表腸道定植抗力［3］。公式：log CFU/g（m L）=同一稀釋度3次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種體積（m L）［15］。

1.2.3 內(nèi)臟敏感性的測定 AWR評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，大鼠對結(jié)直腸擴張無行為學(xué)反應(yīng)；1分，結(jié)直腸擴張時身體靜止不動，頭部運動減少；2分，結(jié)直腸擴張時腹肌輕微收縮，但腹部未抬離桌面；3分，結(jié)直腸擴張時腹肌明顯收縮并且腹部抬離桌面；4分，結(jié)直腸擴張時腹肌強烈收縮，骨盆抬起，身體呈弓形。AWR是一種半定量指標(biāo)，為盡可能減少主觀誤差，本實驗以AWR評分3分時球囊容量作為容量閾值［14］。

檢測前禁食24 h、不禁水，將清醒狀態(tài)下的大鼠放入固定器內(nèi)，限制大鼠的各項活動，但能觀察到腹壁收縮。將Braun 8F氣囊導(dǎo)尿管外涂石蠟油后經(jīng)肛門插入，導(dǎo)管末端距肛門1 cm，用膠布將導(dǎo)尿管固定于大鼠尾根部。15 min后大鼠適應(yīng)環(huán)境呈安靜狀態(tài)，經(jīng)導(dǎo)尿管外口向球囊內(nèi)注入常溫水（26～28℃生理鹽水）擴張，記錄大鼠出現(xiàn)AWR評分各分值時所需的最小注水量為最小容量閾值。重復(fù)擴張3次，每次間隔15 min，3次擴張數(shù)據(jù)均值作為該鼠直腸擴張引起AWR的最小容量閾值。休息30 min，分別測定注水量為0.8、1.2、1.6 m L時1 min內(nèi)大鼠腹部收縮反射的次數(shù)，每次間隔15 min。用引起大鼠AWR的最小容量閾值和直腸內(nèi)球囊不同容量擴張時1 min內(nèi)大鼠腹部收縮反射的次數(shù)，評價大鼠對直腸內(nèi)擴張刺激的內(nèi)臟敏感性［14］。

1.2.4 Real-time PCR測定結(jié)腸組織ZO-1、TLR4的m RNA表達(dá)水平 ①RNA提取及引物的設(shè)計合成。引物設(shè)計及合成由奧科鼎盛生物公司完成：ZO-1上游引物：AATGAATGATGGTTGGTATGG，下游引物：TGACAGGTAGGACAGACG；TLR4上游引物：AAGTTATTGTGGTGGTGTC，下游引物：CTGCTAAGAAGGCGATAC；內(nèi)參β-actin上游引物：CTATCGGCAATGAGCGGTTC，下游引物TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2μL RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：5×PrimeScript RT Master Mix 4μL，模板RNA 2μL，RNase free d H2O 14μL。其中5×PrimeScript RT Master Mix含有RTase，RNase Inhibitor，Oligo d T Primer，Random 6mers，d NTP Mixture和反應(yīng)buffer。反應(yīng)條件：37℃15 min，然后85℃5 s，降至4℃。③RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系及條件：SYBR?Premix Ex TaqⅡ（2×）10μL，PCR上游引物（10 μmol/L）0.8μL，PCR下游引物（10μmol/L）0.8μL，模板cDNA 2.0μL，DH2O（sterile distilled water）6.4μL?？傮w積為20μL。其中SYBR Premix Ex TaqⅡ含有Ex Taq HS，d NTP，Mg2+，Tli RNase H和SYBR?Green I。反應(yīng)條件：95℃30 s 1個循環(huán)；95℃5 s，60℃20 s 40個循環(huán)；95℃0 s，65℃15 s，95℃0 s。反應(yīng)結(jié)束后由電腦自動得出熒光曲線及CT值，采用2-△△CT計算出ZO-1、TLR4的相對表達(dá)量。

TLR4蛋白的免疫組織化學(xué)方法同上，一抗（TLR4）稀釋濃度為1∶300。

顯微鏡觀察，拍照。組織切片均以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，用計算機圖像分析系統(tǒng)計算蛋白表達(dá)的陽性面積。

1.2.6 ELISA法檢測血清中炎性因子IL-10、TNFα的表達(dá)水平 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對資料進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢測，滿足正態(tài)分布及方差齊性后，各組之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況與正常對照組相比，菌群失調(diào)組大鼠精神狀態(tài)略顯萎靡、反應(yīng)遲鈍、毛色光澤度降低、攝食減少，且大便較稀；益生菌干預(yù)組大鼠較模型組大鼠各方面狀態(tài)較好；而陰性對照組大鼠各方面一般情況不如益生菌干預(yù)組，但好于菌群失調(diào)組。

2.2 大鼠結(jié)腸組織觀察肉眼觀察：各組大鼠結(jié)腸組織的黏膜結(jié)構(gòu)完整，均無充血、水腫、潰瘍形成；常規(guī)HE染色顯微鏡下觀察正常對照組及益生菌干預(yù)組結(jié)腸組織的黏膜形態(tài)完好，上皮細(xì)胞排列整齊，炎癥細(xì)胞很少，無上皮細(xì)胞壞死、糜爛等；菌群失調(diào)組及陰性對照組的黏膜層及黏膜下層可見少量炎癥細(xì)胞，組織稍充血，但腺體排列尚整齊，無上皮細(xì)胞壞死、糜爛等（圖1）。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織的病理變化Fig.1 Pathological changes of colonic mucosa in rats of each group（HE，×40）

2.3 腸道菌群的檢測與比較如表1所示，與正常對照組相比，菌群失調(diào)組的有益菌即雙歧桿菌（BS）、乳酸桿菌（LBS）明顯減少（P＜0.05），而條件致病菌即腸桿菌（EMB）明顯增多（P＜0.05），腸道定植抗力（B/E值）＜1（P＜0.05）；益生菌干預(yù)組相比菌群失調(diào)組而言，腸道菌群有所恢復(fù)，表現(xiàn)為BS、LBS明顯升高（P＜0.05），EMB明顯減少（P＜0.05），B/E值＞1（P＜0.05）；陰性對照組的4種腸道細(xì)菌含量與菌群失調(diào)組相比，EMB、BS無明顯差異（P＞0.05），但EF、LBS相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），說明陰性對照組的大鼠腸道菌群還是有部分恢復(fù)的。菌群培養(yǎng)見圖2～圖4。

隨著與城鎮(zhèn)及工礦用地的距離增加各項指標(biāo)均有不同程度的減小，但趨勢各不相同。距離在2 000 m范圍內(nèi)的農(nóng)村居民點面積占比達(dá)64.8%，景觀所占比例高達(dá)5.26%，農(nóng)村居民點平均面積與標(biāo)準(zhǔn)差顯著高于其他區(qū)域，表明城鎮(zhèn)與工礦用地對于農(nóng)村居民點的規(guī)模特征有較大的影響。城鎮(zhèn)是區(qū)域發(fā)展的經(jīng)濟中心，聚集著區(qū)域大量的人口與公共服務(wù)，對農(nóng)村居民點產(chǎn)生較強的吸引。工礦用地所需大量勞動力且為農(nóng)村居民帶來的經(jīng)濟效應(yīng)高于農(nóng)業(yè)耕作，因此影響著農(nóng)村居民點的形成與發(fā)展。各區(qū)域內(nèi)農(nóng)村居民點數(shù)量、斑塊密度、景觀形態(tài)指數(shù)及形狀指數(shù)差異并不明顯，表明城鎮(zhèn)及工礦用地對于農(nóng)村居民點的數(shù)量分布及其形態(tài)影響程度相對較低。

圖2 各組大鼠糞便培養(yǎng)中的EMB菌落Fig.2 EMB colonies of fecal culture in rats of each group

圖3 各組大鼠糞便培養(yǎng)中的BS菌落Fig.3 BS colonies of fecal culture in rats of each group

圖4 各組大鼠糞便培養(yǎng)中的LBS菌落Fig.4 LBS colonies of fecal culture in rats of each group

表1 不同組別糞便培養(yǎng)菌落總數(shù)及B/E值Tab.1 The total number of colonies of fecal culture and the ratio of B/E in different groups（）

表1 不同組別糞便培養(yǎng)菌落總數(shù)及B/E值Tab.1 The total number of colonies of fecal culture and the ratio of B/E in different groups（）

與正常對照組相比，*P＜0.05；與菌群失調(diào)組相比，#P＜0.05。

2.4 內(nèi)臟敏感性的測定結(jié)果如表2所示，與正常對照組相比，菌群失調(diào)組有較高內(nèi)臟敏感性（P＜0.05）；益生菌干預(yù)組與菌群失調(diào)組相比，內(nèi)臟敏感性有所緩解（P＜0.05）；陰性對照組與菌群失調(diào)組比較，內(nèi)臟敏感性有所降低（P＜0.05），但與正常對照組相比仍有差異（P＜0.05），說明陰性對照組的大鼠內(nèi)臟敏感性有所恢復(fù)，但尚未達(dá)到正常。按照設(shè)計測定腹壁收縮次數(shù)應(yīng)在0.8、1.0、1.2 m L 3個容量下進行，但當(dāng)球囊容積達(dá)到1.0 m L及1.2 m L時，部分大鼠出現(xiàn)腹壁強直收縮，無法統(tǒng)計收縮次數(shù)，因此僅選用0.8 m L作為收縮次數(shù)的驗證容量。觀察到菌群失調(diào)組大鼠在球囊達(dá)到0.8 m L時，腹壁收縮次數(shù)明顯高于另外3組（P＜0.05）；益生菌干預(yù)組與正常對照組、陰性對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），內(nèi)臟敏感性有所恢復(fù)；陰性對照組與菌群失調(diào)組相比，內(nèi)臟敏感性有所恢復(fù)（P＜0.05）。

表2 各組AWR評分為3分時的球囊容量及相同容量時的收縮次數(shù)的比較Tab.2 The balloon capacity when AWR score was 3 points and the number of contractions at the same capacity in each group（）

表2 各組AWR評分為3分時的球囊容量及相同容量時的收縮次數(shù)的比較Tab.2 The balloon capacity when AWR score was 3 points and the number of contractions at the same capacity in each group（）

與正常對照組相比，*P＜0.05；與菌群失調(diào)組相比，#P＜0.05。

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織ZO-1、TLR4的mRNA的表達(dá)水平Real-time PCR結(jié)果顯示，各組大鼠的結(jié)腸組織均有ZO-1 mRNA的表達(dá)。與正常對照組相比，菌群失調(diào)組的ZO-1 mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；與菌群失調(diào)組相比，益生菌干預(yù)組的ZO-1 mRNA表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；陰性對照組與菌群失調(diào)組相比，ZO-1 mRNA表達(dá)有所增多，較正常對照組還是減少的，但均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

各組大鼠的結(jié)腸組織均有TLR4 mRNA的表達(dá)。與正常對照組相比，菌群失調(diào)組的TLR4 mRNA表達(dá)明顯增多（P＜0.05）；與菌群失調(diào)組相比，益生菌干預(yù)組的TLR4 mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.05）；陰性對照組與菌群失調(diào)組相比，TLR4 mRNA表達(dá)有所降低，較正常對照組還是有所增多的，但均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

表3 各組ZO-1 mRNA、TLR4 m RNA的表達(dá)量Tab.3 The expressions of ZO-1 m RNA and TLR4 m RNA in each group（）

表3 各組ZO-1 mRNA、TLR4 m RNA的表達(dá)量Tab.3 The expressions of ZO-1 m RNA and TLR4 m RNA in each group（）

與正常對照組相比，*P＜0.05；與菌群失調(diào)組相比，#P＜0.05。

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織ZO-1、TLR4的蛋白表達(dá)水平

2.6.1 ZO-1的蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示（圖5），各組ZO-1的表達(dá)均主要集中在結(jié)腸組織黏膜上皮細(xì)胞的胞膜頂端。正常對照組的ZO-1表達(dá)明顯最多，呈現(xiàn)棕黃色顆?；驁F塊；菌群失調(diào)組的ZO-1表達(dá)部位沒有明顯改變，但表達(dá)量明顯降低；益生菌干預(yù)組的ZO-1表達(dá)較菌群失調(diào)組有所恢復(fù)；陰性對照組的ZO-1表達(dá)仍明顯較少。陽性面積統(tǒng)計分析（表4），菌群失調(diào)組ZO-1表達(dá)陽性面積較正常對照組明顯降低（P＜0.05），益生菌干預(yù)組ZO-1表達(dá)陽性面積較菌群失調(diào)組明顯有所增多（P＜0.05），陰性對照組ZO-1蛋白陽性面積較菌群失調(diào)組無明顯差異（P＞0.05）。

表4 免疫組化檢測各組ZO-1、TLR4蛋白表達(dá)的陽性面積Tab.4 The positive area of ZO-1 and TLR4 protein expression in each group detected by immunohistochemical method（，%）

表4 免疫組化檢測各組ZO-1、TLR4蛋白表達(dá)的陽性面積Tab.4 The positive area of ZO-1 and TLR4 protein expression in each group detected by immunohistochemical method（，%）

與對照組相比，*P＜0.05；與菌群失調(diào)組相比，#P＜0.05。

圖5 各組大鼠結(jié)腸組織ZO-1的表達(dá)Fig.5 The expression of ZO-1 in the colon of rats in each group（Immunohistochemistry，×40）

2.6.2 TLR4的蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示（圖6），正常對照組結(jié)腸組織黏膜上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞胞質(zhì)有極少量的TLR4表達(dá)；菌群失調(diào)組結(jié)腸組織黏膜上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞胞質(zhì)均有TLR4表達(dá)，以固有層細(xì)胞的胞質(zhì)表達(dá)為著，明顯多于正常對照組；益生菌干預(yù)組的TLR4表達(dá)主要集中在固有層細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，但可看出表達(dá)量明顯低于菌群失調(diào)組；陰性對照組的結(jié)腸組織黏膜上皮細(xì)胞及固有層細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)尚有不少TLR4的表達(dá)，對比可見多于益生菌干預(yù)組和正常對照組。陽性面積統(tǒng)計分析（表4）：菌群失調(diào)組TLR4表達(dá)陽性面積較正常對照組明顯增多（P＜0.05），益生菌干預(yù)組ZO-1表達(dá)陽性面積較菌群失調(diào)組明顯有所減少（P＜0.05），陰性對照組ZO-1蛋白陽性面積較菌群失調(diào)組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)Fig.6 The expression of TLR4 in the colon of rats in each group（Immunohistochemistry，×40）

2.7 各組大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-10的表達(dá)水平如表5所示，與正常對照組相比，菌群失調(diào)組的TNF-α含量明顯增多（P＜0.05）；與菌群失調(diào)組相比，益生菌干預(yù)組的TNF-α含量明顯減少（P＜0.05）；陰性對照組與菌群失調(diào)組相比，TNF-α含量明顯減少（P＜0.05），較正常對照組也是較高的，但二者比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

血清中IL-10的表達(dá)，與正常對照組相比，菌群失調(diào)組的IL-10含量明顯減少（P＜0.05）；與菌群失調(diào)組相比，益生菌干預(yù)組的IL-10含量明顯增多（P＜0.05）；陰性對照組與菌群失調(diào)組相比，IL-10含量有所增多，而與正常對照組相比還是有所減少，但均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

3 討 論

目前，IBS的具體發(fā)病機制尚不明確。近年來，隨著研究的深入，腸道菌群失調(diào)在IBS發(fā)生發(fā)展中的作用已不容忽視［5-8］。

表5 各組血清中TNF-α、IL-10含量的比較Tab.5 The content of TNF-αand IL-10 in the serum in each group（，pg/m L）

表5 各組血清中TNF-α、IL-10含量的比較Tab.5 The content of TNF-αand IL-10 in the serum in each group（，pg/m L）

與對照組相比，*P＜0.05；與菌群失調(diào)組相比，#P＜0.05。

羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)糞便性狀，參照糞便Bristol分級，對IBS糞便性狀加以量化分型：①IBS腹瀉型（IBS-D）：＞25%糊狀或水樣糞便，＜25%塊狀或干硬糞便；②IBS便秘型（IBS-C）：＞25%塊狀或干硬糞便，＜25%糊狀或水樣糞便；③IBS混合型（IBSM）：塊狀或干硬糞便、糊狀或水樣糞便均＞25%；④IBS不定型（IBS-U）：糞便性狀不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者，還常伴有排便費力或排便不盡感。目前，針對IBS-D的研究居多。抗生素是引起菌群失調(diào)的主要因素之一，雖然其在治療某些疾病方面有著不可替代的作用，但是不合理的使用抗生素會使其在殺死敏感菌的同時引起非敏感菌的大量繁殖，導(dǎo)致菌群失調(diào)［1，10］。文獻(xiàn)報道，抗生素灌胃一般導(dǎo)致腹瀉癥狀及腸動力的改變，類似于IBS-D。本文目的即是驗證腸道菌群失調(diào)是否能夠產(chǎn)生IBS-D的相應(yīng)癥狀及表現(xiàn)。通過查閱大量文獻(xiàn)，本實驗選擇鹽酸林可霉素灌胃造模，用糞便菌群培養(yǎng)方法來判定模型成功與否［］。

緊密連接（TJ）是細(xì)胞間最重要的連接方式，Occludin蛋白是TJ的主要功能蛋白之一，可與ZOs蛋白連接，ZOs蛋白對于TJ的形成和屏障功能的維持具有重要作用，被認(rèn)為是免疫組織化學(xué)檢查時TJ的標(biāo)志性蛋白。ZOs是一種外周膜蛋白，屬膜相關(guān)鳥氨酸酶家族，有3種異構(gòu)體，即ZO-1、ZO-2、ZO-3。ZO-1蛋白可將occludin蛋白和肌動蛋白骨架系統(tǒng)連接在一起，構(gòu)成穩(wěn)定的連接系統(tǒng)。TJ結(jié)構(gòu)一旦受損，腸黏膜通透性就會增加，從而引發(fā)LPS入血，與TLR4發(fā)生反應(yīng)。Toll受體是炎癥信號傳遞的門戶蛋白，它主要參與機體的固有免疫，并在固有免疫和獲得性免疫之間起著橋梁作用，是引起機體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵受體。其中TLR4主要介導(dǎo)內(nèi)毒素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前國內(nèi)外已有不少研究報道IBS（主要是D-IBS）患者腸道黏膜存在高表達(dá)TLR4［7，16］，正常的腸上皮細(xì)胞（IEC）低表達(dá)TLR4，使IEC對共生菌保持免疫耐受，有利于腸道菌群與腸黏膜保持穩(wěn)態(tài)，當(dāng)有細(xì)菌入侵時，IEC迅速識別并誘導(dǎo)TLR4由基底側(cè)轉(zhuǎn)至腸腔側(cè)，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活其下游的NF-κB，進而調(diào)控各種基因的表達(dá)，如炎性因子等。

有研究報道，腹瀉型IBS（D-IBS）患者及各亞型IBS大鼠存在腸道菌群失調(diào)［4］及腸黏膜機械屏障不足，表現(xiàn)為ZO-1表達(dá)下降［7］，而腸道菌群失調(diào)可以通過破壞腸黏膜屏障、改變腸道通透性，進而使腸道內(nèi)毒素水平升高，促炎因子產(chǎn)生，從而導(dǎo)致慢性低度炎癥［17］。目前IBS腸道存在慢性低度炎癥已基本達(dá)成共識。有大量研究發(fā)現(xiàn)，部分IBS患者存在腸黏膜炎癥和免疫細(xì)胞功能活化，這種炎癥就被稱為低度炎癥，而且腸黏膜的低度炎癥可導(dǎo)致胃腸運動功能紊亂、并激活內(nèi)臟感覺系統(tǒng)，從而參與IBS的發(fā)生發(fā)展［1，10］。

本實驗造模后菌群失調(diào)組大鼠腸道內(nèi)的有益菌即雙歧桿菌和乳酸桿菌含量顯著下降，條件致病菌即大腸桿菌明顯增多，且腸道定植抗力＜1，說明腸道菌群失調(diào)模型建立成功，腸球菌無增多趨勢，這也與部分文獻(xiàn)結(jié)果保持一致［4］。再通過內(nèi)臟敏感性的比較，與正常對照組相比，菌群失調(diào)組有較高的內(nèi)臟敏感性，可以說腸道菌群失調(diào)在一定程度上可以引起內(nèi)臟高敏感，與文獻(xiàn)報道一致［2，9，18］。同時HE染色結(jié)果也顯示，菌群失調(diào)組大鼠的腸道并無明顯炎癥發(fā)生，只有少數(shù)炎性細(xì)胞的浸潤，屬低度炎癥，而且本實驗中進一步檢測血清中TNF-α、IL-10炎性因子的表達(dá)情況，菌群失調(diào)組相比正常對照組而言，TNF-α明顯升高（P＜0.05），IL-10明顯降低（P＜0.01），也更加印證了菌群失調(diào)組低度炎癥的存在。結(jié)合菌群失調(diào)、內(nèi)臟高敏感性及低度炎癥的改變，說明腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感模型的成功建立，這在以往國內(nèi)外研究中尚未見報道，可為以后內(nèi)臟高敏感動物模型的建立提供新的思路及方法。同時通過對TLR4和ZO-1的表達(dá)檢測，不管是蛋白水平還是m RNA水平，菌群失調(diào)組的TLR4表達(dá)明顯高于正常對照組，而ZO-1的表達(dá)明顯低于正常對照組，更加說明了腸黏膜屏障與低度炎癥參與到IBS的發(fā)病過程，也更加清楚地闡明了腸道菌群失調(diào)與內(nèi)臟高敏感的相關(guān)性及其可能機制。

再者有關(guān)益生菌干預(yù)組的各項檢測指標(biāo)結(jié)果表明，相比菌群失調(diào)組而言，益生菌干預(yù)組的腸道菌群失調(diào)及內(nèi)臟高敏感性明顯恢復(fù)，結(jié)腸ZO-1及TLR4 mRNA及蛋白的表達(dá)也均有不同程度地恢復(fù)和降低，同時血清中TNF-α、IL-10炎性因子的表達(dá)情況也有不同程度地改善。說明益生菌治療可以從一定程度上改善腸道微生態(tài)，同時可通過升高ZO-1、降低TLR4的表達(dá)，以及調(diào)節(jié)促炎因子與抑炎因子平衡的機制來進一步緩解內(nèi)臟敏感性，也與以往研究結(jié)果統(tǒng)一［1，2，6］。

基于上述理論，本課題即將“腸道菌群失調(diào)-腸道低度炎癥-內(nèi)臟高敏感”聯(lián)系在了一起，對IBS來講是一種新的理論模型［10］。我們推測，通過抑制結(jié)腸中ZO-1的表達(dá)及升高TLR4的表達(dá)，進而導(dǎo)致慢性低度炎癥的發(fā)生可能是腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感的作用機制之一，同時益生菌制劑可能通過恢復(fù)腸道菌群變化進而改善內(nèi)臟高敏感。這就為IBS的發(fā)病機制提供了新的理論指導(dǎo)，也為IBS的治療及藥物研發(fā)提供新的思路。

［1］AKIHO H，IHARA E，NAKAMURA K.Low-grade inflammation plays a pivotal role in gastrointestinal dysfunction in irritable bowel syndrome［J］.World J Gastrointest Pathophysiol，2010，1（3）：97-105.

［2］PONNUSAMY K，CHOI JN，KIM J，et al.Microbial community and metabolomic comparison of irritable bowel syndrome faeces［J］.J Med Microbiol，2011，60（Pt 6）：817-827.

［3］胡樂義，王巧民，姜彬言，等.腸易激綜合征患者腸道菌群的變化及意義［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，47（1）：86-89.

［4］MATTO J，MAUNUKSELA L，KAJANDER K，et al.Composition and temporal stability of gastrointestinal microbiota in irritable bowel syndrome—a longitudinal study in IBS and control subjects［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2005，43（2）：213-222.

［5］VERDU EF，BERCIK P，VERMA-GANDHU M，et al.Specific probiotic therapy attenuates antibiotic induced visceral hypersensitivity in mice［J］.Gut，2006，55（2）：182-190.

［6］EUTAMENE H，LAMINE F，CHABO C，et al.Synergy between Lactobacillus paracasei and its bacterial products to counteract stress-induced gut permeability and sensitivity increase in rats［J］.J Nutr，2007，137（8）：1901-1907.

［7］GHOSHAL UC，SHUKLA R，GHOSHAL U，et al.The gut microbiota and irritable bowel syndrome：friend or foe？［J］.Int J Inflam，2012：151085.

［8］GHOSHAL UC，PARK H，GWEE KA.Bugs and irritable bowel syndrome：The good，the bad and the ugly［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25（2）：244-251.

［9］LEE BJ，BAK YT.Irritable bowel syndrome，gut microbiota and probiotics［J］.J Neurogastroenterol Motil，2011，17（3）：252-266.

［10］COLLINS SM，DENOU E，VERDU EF，et al.The putative role of the intestinal microbiota in the irritable bowel syndrome［J］.Dig Liver Dis，2009，41（12）：850-853.

［11］MARSHALL JK，THABANE M，GARG AX，et al.Intestinal permeability in patients with irritable bowel syndrome after a waterborne outbreak of acute gastroenteritis in Walkerton，Ontario［J］.Aliment Pharmacol Ther，2004，20（11-12）：1317-1322.

［12］郝秀春，李麗秋，張曉波，等.雙歧桿菌對菌群失調(diào)大鼠血清NO及NOS的影響［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23（2）：101-103.

［13］BALSARI A，CECCARELLI A，DUBINI F，et al.The fecal microbial population in the irritable bowel syndrome［J］.Microbiologica，1982，5（3）：185-194.

［14］張芳芹，徐桂芳，趙東，等.微生態(tài)制劑對內(nèi)臟高敏感模型大鼠內(nèi)臟敏感性影響的研究［J］.胃腸病學(xué)，2012，17（4）：198-201.

［15］FLOWER RL，KAMHIEH S，MCLEAN L，et al.Human Borna disease virus infection in Australia：serological markers of infection in multi-transfused patients［J］.APMIS，2008，（124）：89-93.

［16］王雪梅，劉玉蘭.腸易激綜合征腹瀉型患者結(jié)腸黏膜Toll樣受體2和4的表達(dá)［J］.中華消化雜志，2009，29（2）：105-108.

［17］易園驪，姚萍.脂代謝與腸道菌群關(guān)系的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（6）：991-994.

［18］MENDALL MA，KUMAR D.Antibiotic use，childhood affluence and irritable bowel syndrome（IBS）［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，1998，10（1）：59-62.

（編輯 卓選鵬）

The influence of intestinal dysbacteriosis on visceral sensitivity and possible mechanisms

SHAO Hui1，WANG Jin-hai1，ZHANG Jie2，YANG Long-bao1，XIE Dan-Hong1
（1.Department of Gastroenterology，Shaanxi Key Laboratory of Gastrointestinal Motility Disorders，Shaanxi Clinical Research Center of Gastrointestinal Diseases；2.Department of Nuclear Medicine，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center，Xi’an 710004，China）

ObjectiveTo detect the changes of visceral sensitivity in rats presenting intestinal dysbacteriosis and the expressions of tight junction protein（ZO-1）and Toll-like receptor 4（TLR4）so as to explore the ef fect of intestinal dysbacteriosis on visceral sensitivity and the possible mechanisms.MethodsWe randomly divided 30 male SD rats of SPF grade into normal control group（n=12）and dysbacteriosis group（n=18）.Rats in dysbacteriosis group were administered with lincomycin hydrochloride（300 mg/m L），1 m L each time per rat once a day for 7 consecutive days；those in normal control group were fed with the same amount of saline.On the eighth day，six rats were randomly selected from normal control group and dysbacteriosis group respectively to detect whether the model was successful.After the model was successfully constructed，the remaining 12 dysbacteriosis rats were randomly divided into the negative control group and the probiotics intervention group with 6 in each.Rats in the intervention group were given probiotic bifidobacterium triple viable capsules（Bifico）orally，one capsule with 1/3 m L of saline，1 m L each time per rat once a day for 7 consecutive days；those in the negative control group

the same amount of saline.On the eighth day，fresh feces was cultured for flora to detect visceral sensitivity by abdominal withdrawal reflex（AWR），the m RNA and protein expressions of ZO-1 and TLR4 in the colon，and the expression of serum inflammatory cytokines IL-10 and TNFα.ResultsThe expression of ZO-1in the colonwas significantly lower in the rats of dysbacteriosis group than those in the control group，and the expression of TLR4 was also significantly increased.Correspondingly，the expression of pro-inflammatory factor TNFαin the serum of the rats in dysbacteriosis group was significantly increased，while that of anti-inflammatory factor IL-10 was significantly lower than in the control group（P＜0.05）.Furthermore，compared with dysbacteriosis group，the expression of ZO-1 was increased significantly and TLR4 was decreased in probiotics group in varying degrees. Similarly，the expression of TNFαwas obviously lower while that of IL-10 in the serum was higher（P＜0.05）.ConclusionInhibiting the expression of ZO-1 and increasing the expression of TLR4，thus leading to chronic lowgrade inflammation，may be one mechanism of visceral hypersensitivity caused by intestinal dysbacteriosis. Probiotics may restore the dysbacteriosis and thus improve visceral hypersensitivity.

intestinal dysbacteriosis；visceral hypersensitivity；irritable bowel syndrome；low-grade inflammation；tight junction protein（ZO-1）；Toll-like receptor 4（TLR4）；probiotics

R57

A

10.7652/jdyxb201506009

2014-12-16

2015-06-12

王進海.E-mail：jinhaiwang@hotmail.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150929.0855.008.html（2015-09-29）