sh-Set7/9表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HepG2細(xì)胞中的功能

馬克君，施星臣，李 平，李曉強(qiáng)，任 雯，秦 龍，施鑫鶴

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室，甘肅蘭州 730030；2.蘭州市第二人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730030；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州 730030）

◇基礎(chǔ)研究◇

sh-Set7/9表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HepG2細(xì)胞中的功能

馬克君1，施星臣2，李 平1，李曉強(qiáng)3，任 雯1，秦 龍3，施鑫鶴1

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室，甘肅蘭州 730030；2.蘭州市第二人民醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730030；3.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州 730030）

目的構(gòu)建sh-Set7/9表達(dá)載體并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞株，考察其干擾效果，為后續(xù)研究Set7/9基因的功能及其在肝癌細(xì)胞系中的作用提供實驗基礎(chǔ)。方法尋找靶向序列，設(shè)計siRNA片段，構(gòu)建針對人Set7/9基因的sh RNA和對照載體，將干擾載體和載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，Real-time PCR檢測細(xì)胞中Set7/9基因的表達(dá)水平；同時利用Western blot方法在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測，確定該基因的干擾效果。結(jié)果成功構(gòu)建載體Set7/9-sh RNA；Real-time PCR結(jié)果顯示該基因表達(dá)水平明顯被抑制（P＜0.05），同樣Western blot檢測表明其蛋白表達(dá)也顯著下調(diào)。此外，與其相關(guān)的Sirt1蛋白表達(dá)水平提高8.4倍，Suv39h1蛋白表達(dá)水平升高1.1倍。結(jié)論構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株后，可以顯著下調(diào)Set7/9基因的表達(dá)，同時影響與其相關(guān)的Sirt1和Suv39h1蛋白表達(dá)水平，提示對肝癌HepG2細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。

Set7/9；Hep G2細(xì)胞；Western blot；甲基轉(zhuǎn)移酶；載體構(gòu)建；肝癌

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，在我國居惡性腫瘤死亡率第2位，嚴(yán)重危害群眾的身體健康［1-2］。因此，對其形成機(jī)制的研究報道較多。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，從相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶的角度對其成因和干預(yù)的研究也常有報道，但其中的具體關(guān)系和機(jī)制尚有待深入研究。

越來越多的研究涉及蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set7/ 9［3-4］，它含有SET結(jié)構(gòu)域，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM/Ado Met）為底物，是蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶（protein lysine methyltransferases，PLMTs或PKMTs）家族成員［5-6］。有研究表明，Set7/9介導(dǎo)Suv39h1甲基化，導(dǎo)致了異染色質(zhì)松散和基因組不穩(wěn)定［7］；還可以影響Sirtuin 1（Sirt1）去乙?；饔茫?］。Suv39h1與白血病、胃癌等一些癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。而對于Set7/9在肝癌細(xì)胞中是否能調(diào)控其細(xì)胞活性、細(xì)胞周期的變化，以及如何影響Sirt1和Suv39h1蛋白的表達(dá)和功能的實現(xiàn)仍有待研究。

本研究以人Hep G2細(xì)胞株為靶細(xì)胞，構(gòu)建了Set7/9-shRNA質(zhì)粒，通過慢病毒包裝，轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞系中，并篩選到Set7/9沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株HepG2，用以研究在肝癌細(xì)胞系HepG2中該基因的功能，并初步探索與其相關(guān)的基因Sirt1和Suv39h1的表達(dá)變化情況，從而為進(jìn)一步闡釋Set7/ 9、Sirt1和Suv39h1在肝癌細(xì)胞中的功能及其對肝癌細(xì)胞活性及細(xì)胞周期的影響提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑和儀器肝癌細(xì)胞株HepG2、大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室保存；質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；DNA內(nèi)切酶（Bam HⅠ、Eco RⅠ）、DNA連接酶、DNA marker購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖購自加拿大BBI公司；DMEM、胎牛血清FBS、雙抗（青鏈霉素）均購自GIBCO公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；Polybrene購自Sigma公司；PBS購自AMEROSCO公司；SET7/9的單克隆抗體SET7/9（sc-56774）、Sirt1的多克隆抗體Sirt1（sc-15404）、Suv39h1的單克隆抗體Suv39h1（sc-377112）購自Santa Cruz公司；生物安全柜購自上海上凈凈化設(shè)備有限公司；熒光顯微鏡購自Motic公司；MX3000P實時熒光定量PCR儀購自Stratagene公司。

1.2 SETD7-shRNA載體質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定將SET7/9 mRNA序列輸入在線軟件http：//genomics.jp/sidirect/，根據(jù)文獻(xiàn)報道，SET7/9基因設(shè)計的干擾序列為GGGCACCTGGACGATGACGGA，陰性對照選擇無意序列TTCTCCGAACGTGTCACGT。LV3-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號。兩端添加Bam HⅠ與Eco RⅠ酶切位點。將DNA oligo分別用TE（p H 8.0）溶解，濃度為100μmol/L。在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理：95℃、5 min；85℃、5 min；75℃、5 min；70℃、5 min；4℃保存。退火處理后得到濃度為10μmol/L的sh RNA模板。將所得模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 nmol/L，用于連接反應(yīng)。用Bam HⅠ與Eco RⅠ酶切載體，瓊脂糖電泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收。之后進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的Top10菌種中，挑選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，單酶切再測序鑒定。

1.3 慢病毒包裝取細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后，按照每個10 cm的培養(yǎng)皿5×106個細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)皿中，37℃、50 m L/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；次日加入5 m L新鮮的含100 mL/L血清DMEM培養(yǎng)液，DNA-Lipofectamine 2000復(fù)合物共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物。放置37℃、50 m L/L CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后48 h收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；加入10 mL新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72 h再次收集濃縮，測定滴度；分裝好的病毒放置-80℃保存。

1.4 重組慢病毒感染HepG2Hep G2在6 cm dish中培養(yǎng)至80%～90%融合時，傾去培養(yǎng)液，用3 mL D-Hank’s液洗滌細(xì)胞2次。加1 m L Trypsin-EDTA液，混勻后，小心吸去胰酶溶液，37℃放置3 min。再加入2 m L DMEM培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液。血球計數(shù)板計數(shù)，按10×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，混勻后37℃、50 m L/L CO2培養(yǎng)24 h。將慢病毒原液200μL，用100 m L/L FBS的DMEM培液5倍稀釋，并加入終濃度為0.5μg/m L的Polybrene。吸去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入上述1 mL稀釋的病毒液，同時設(shè)立空白對照組，于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)24 h。吸棄6孔板中的稀釋病毒液，每孔加入2 mL 100 mL/L FBS的DMEM培液于37℃、50 mL/L CO2繼續(xù)培養(yǎng)至72、96 h分別收樣。

1.5 SET7/9基因和蛋白表達(dá)效果的檢測用puromycin進(jìn)行選擇，獲得穩(wěn)篩株，并擴(kuò)增穩(wěn)篩株細(xì)胞，分別收樣，用于提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR實驗。GAPDH（內(nèi)參）F primer：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT，R primer：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT；SET7/9（目的）F primer：CACAGATGGGAGACTGATCTTCAAG，R primer：TTACTTCTCCTACAAGGCTTCCTCC。實驗擴(kuò)增條件為：95℃、3 min預(yù)變性；95℃、30 s；62℃、40 s；40循環(huán)；Western blot檢測干擾后SET7/9蛋白的表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以表示。進(jìn)行方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗。兩組以上的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Set7/9-sh RNA載體質(zhì)粒的鑒定和測序結(jié)果將p GLV3/H1/GFP/puro空載體進(jìn)行酶切，回收，與插入子連接，轉(zhuǎn)化Top10細(xì)菌株，挑取4個菌落抽提質(zhì)粒。所得質(zhì)粒用Eco RⅠ進(jìn)行單酶切鑒定，電泳后可以看到約8 000 bp的線性載體，挑取1、3號克隆進(jìn)行測序，證明SET7/9sh RNA載體構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 pGLV3/H1/GFP/puro-Set7/9質(zhì)粒克隆的鑒定Fig.1 Identification ofplasmid pGLV3/H1/GFP/puro-Set7/9

2.2 慢病毒載體的包裝及侵染細(xì)胞提取質(zhì)粒，將慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48 h后收集培養(yǎng)上清進(jìn)行濃縮；轉(zhuǎn)染后72 h再次收集濃縮。測定滴度為1×108TU/m L，重組后的病毒侵染HepG2細(xì)胞，并獲得最適puromycin濃度，經(jīng)過培養(yǎng)篩選獲得穩(wěn)篩株細(xì)胞（圖2）。

2.3 Real-time PCR及Western blot實驗證實SET7/9基因被沉默通過穩(wěn)篩株細(xì)胞擴(kuò)增，分別收樣，用于Real-time PCR、Western blot檢測。從基因和蛋白水平上對HepG2細(xì)胞中SET7/9基因的沉默效果進(jìn)行檢測，表明該基因表達(dá)水平明顯被抑制（P＜0.05）；同樣Western blot檢測顯示，其蛋白表達(dá)也顯著下調(diào)。以GAPDH和β-actin為內(nèi)參，檢測轉(zhuǎn)染72 h后SET7/9基因和蛋白表達(dá)情況（表1、圖3）。

圖2 病毒侵染HepG2細(xì)胞圖Fig.2 Virus infected Hep G2（×100）

圖3 SET7/9基因沉默后基因和蛋白的相對表達(dá)情況Fig.3 Relative expressions of gene and protein after SET7/ 9 knockdown

2.4 SET7/9基因影響Sirt1及Suv39h1的表達(dá)在SET7/9基因被成功沉默后，用Western blot實驗分別對Sirt1及Suv39h1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sirt1蛋白表達(dá)水平顯著增加8.4倍，Suv39h1蛋白表達(dá)水平也有上調(diào)1.1倍，但變化不明顯（圖4）。

表1 Real-time PCR檢測基因沉默后SET7/9表達(dá)Tab.1 Detection of SET7/9 expression after knockdown detected by Real-time PCR

圖4 Sirt1與Suv39h1蛋白表達(dá)水平變化Fig.4 Changes of Sirt1 and Suv39h1 protein expressions

3 討 論

Suv39h1是第1個被發(fā)現(xiàn)的特異性H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶，組蛋白H3K9的甲基化在異染色質(zhì)形成及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。近年的一些研究表明，H3K9甲基化失衡與白血病、胃癌等一些癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Set7/9介導(dǎo)Suv39h1甲基化，導(dǎo)致了異染色質(zhì)松散和基因組不穩(wěn)定。有研究人員確定了蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶Set7/9是Suv39h1活性的一個獨特調(diào)控因子，證實Set7/9介導(dǎo)了Suv39h1賴氨酸105和123位點特異性甲基化［7］。

此外，朱衛(wèi)國等［8］鑒別出Set7/9也是Sirt1的獨特調(diào)控因子，細(xì)胞內(nèi)Set7/9與Sirt1相互作用顯著增強(qiáng)，從而抑制了Sirt1與p53的相互作用，導(dǎo)致p53乙?；较鄳?yīng)增高，p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活增強(qiáng)。研究結(jié)果表明除甲基化作用依賴的機(jī)制，Set7/9還可通過Sirt1間接調(diào)控p53的功能。p53作為抑癌基因，與一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)，去乙?；谆缺碛^遺傳學(xué)修飾對其功能有影響［9-10］。

因此，有必要對Set7/9在肝癌細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究。shRNA是多種小分子干擾RNA制備方法中較好的可以進(jìn)行長期基因沉默研究的方法［11-13］。脂質(zhì)體介導(dǎo)的sh RNA進(jìn)入細(xì)胞的方法往往轉(zhuǎn)染效率低，而通過慢病毒包裝進(jìn)行轉(zhuǎn)染在基礎(chǔ)研究中得到廣泛應(yīng)用［14］。慢病毒是在人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的基礎(chǔ)上改造形成的逆轉(zhuǎn)錄病毒［15］，能夠?qū)⒛康幕蛘系饺旧w上，得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。

sh RNA為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)酶切產(chǎn)生小分子干擾RNA，后者的反義鏈在細(xì)胞內(nèi)與特定蛋白質(zhì)結(jié)合形成RISCs（RNA-induced silencing complexes），通過反義鏈與特異mRNA序列互補(bǔ)結(jié)合，剪切mRNA導(dǎo)致mRNA降解，從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生特定基因的沉默效果［16-17］。其具有抑制效果確切、嚴(yán)格序列特異性及針對性強(qiáng)等優(yōu)勢。有效干擾序列設(shè)計是sh RNA構(gòu)建的關(guān)鍵，本實驗設(shè)計的靶序列參考已有文獻(xiàn)報道，并進(jìn)行sh RNA構(gòu)建，實驗證明為有效干擾靶點。

總之，本研究立足近年來發(fā)現(xiàn)Set7/9催化的非組蛋白甲基化作用能引起蛋白穩(wěn)定性改變和基因表達(dá)變化等多種分子生物學(xué)效應(yīng)，這些分子效應(yīng)涉及到染色體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及凋亡等方面，構(gòu)建了Set7/9-shRNA質(zhì)粒，研究在肝癌細(xì)胞系Hep G2中該基因的功能，并初步探索與其相關(guān)的蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，Sirt1蛋白表達(dá)水平提高8.4倍，Suv39h1蛋白表達(dá)水平升高1.1倍。這兩種蛋白分別具有去乙?；图谆墓δ?，因此其表達(dá)水平的變化暗示在HepG2細(xì)胞系中Set7/9基因可能會對其活性和細(xì)胞周期等產(chǎn)生影響，這有待更深入的研究。

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（編輯 卓選鵬）

Construction of shSet7/9 vector and its function in HepG2

MA Ke-jun1，SHI Xing-chen2，LI Ping1，LI Xiao-qiang3，REN Wen1，QIN Long3，SHI Xin-he1
（1.Central Laboratory，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030；2.Department of Orthopaedics，Lanzhou Second Hospital，Lanzhou 730030；3.Pharmacy，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China）

ObjectiveTo silence human gene Set7/9 and screen out stable transfection cell line in hepatocellular carcinoma cell line Hep G2 so as to investigate the impact of down-regulation of Set7/9 in cell line HepG2 and provide experimental foundation for studies on the effect of set7/9 in HepG2.MethodsThe target oligo was designed and synthesized；sh RNA interference vector and the control vector were constructed and transfected into Hep G2 cells；the stable transfection cells were screened out.Then Real-time PCR and Western blot were performed to detect the silence of Set7/9 according to both gene expression and protein expression level.ResultsThe sh RNA interference vector was constructed and transfected into Hep G2 cells successfully.Compared with that in the negative control group，the expression of Set7/9 was dramatically downregulated（P＜0.05）. Meanwhile，the expression of related protein Sirt1 and Suv39h1 was upregulated 8.4 folds and 1.1 fold，respectively.ConclusionDownregulation of Set7/9 expression can upregulate Sirt1 and Suv39h1，suggesting that Set7/9 may af fect the activity of Hep G2 cell lines.

Set7/9；Hep G2 cell；Western blot；methyltransferase；vector construction；hepatocellular carcinoma

R735.7

A

10.7652/jdyxb201506008

2015-01-06

2015-05-06

2013年蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（No.lzujbky-2013-144）

Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities（No.lzujbky-2013-144）

施鑫鶴.E-mail：shixh@lzu.edu.cn

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150929.0859.010.html（2015-09-29）