阿羅洛爾、普萘洛爾和卡維地洛對肝硬化大鼠門脈高壓癥的療效比較

王曉艷，萬曉龍，郭曉燕，董 蕾，秦 斌，李 晶

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院消化內科，陜西省腸胃動力疾病研究重點實驗室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心，陜西西安 710004）

◇基礎研究◇

阿羅洛爾、普萘洛爾和卡維地洛對肝硬化大鼠門脈高壓癥的療效比較

王曉艷，萬曉龍*，郭曉燕，董 蕾，秦 斌，李 晶

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院消化內科，陜西省腸胃動力疾病研究重點實驗室，陜西省胃腸疾病臨床研究中心，陜西西安 710004）

目的探討阿羅洛爾、普萘洛爾和卡維地洛降低肝硬化門脈高壓癥大鼠門靜脈壓力的療效及相關機制，并對此3種藥物的作用優(yōu)劣作綜合評估。方法CCl4誘導大鼠肝硬化門脈高壓癥模型，于模型穩(wěn)定后分別給予阿羅洛爾、普萘洛爾、卡維地洛灌胃2周；插管法測平均動脈壓（MAP）、心率（HR）及門靜脈壓力（PVP），免疫組織化學法測定肝組織中α-SMA表達；Masson染色法測膠原纖維面積。結果阿羅洛爾組和卡維地洛組PVP較模型組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），且兩組PVP均低于普萘洛爾組（P＜0.001，P=0.032）；和模型組比較，阿羅洛爾組及卡維地洛組的MAP和HR均明顯下降（P＜0.05）；卡維地洛組MAP較阿羅洛爾組更低（P=0.011）；普萘洛爾組僅MAP較模型組顯著下降（P=0.003），而HR變化無統(tǒng)計學差異（P=0.143）。阿羅洛爾組和普萘洛爾組僅TBIL較模型組顯著下降（P＜0.001），而卡維地洛組ALT、ALB、TBIL均較模型組明顯改善（P＜0.001，P＜0.001，P= 0.045）；阿羅洛爾、卡維地洛、普萘洛爾組α-SMA表達及膠原纖維面積均較模型組減少，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論阿羅洛爾能夠顯著降低肝硬化門脈高壓癥大鼠的門靜脈壓力，療效與卡維地洛類似；在改善肝功能方面阿羅洛爾不及卡維地洛，但阿羅洛爾對MAP的影響要小于卡維地洛。

阿羅洛爾；卡維地洛；普萘洛爾；門脈高壓癥；大鼠

食管-胃底靜脈曲張出血是肝硬化患者最常見的致死性并發(fā)癥，年發(fā)病率為5%～15%［1］。降低門脈壓力，預防和治療肝硬化的并發(fā)癥具有重要的臨床意義。

非選擇性β受體阻斷劑被推薦用于預防靜脈曲張患者的首次出血及再出血［2］。普萘洛爾是目前公認有效的降門脈壓藥物，但患者對其反應性低，使其臨床應用受限?？ňS地洛和阿羅洛爾同為第3代非選擇性β受體阻滯劑，并具有微弱的α1受體拮抗作用。已有不少研究表明，卡維地洛可顯著降低肝硬化患者門脈壓力，且比普萘洛爾更加有效［3-7］。然而，目前關于阿羅洛爾對門脈壓力作用的研究甚少。因此，本實驗通過大鼠肝硬化門脈高壓癥模型中血流動力學指標、肝功能及肝纖維化指標的比較，探討阿羅洛爾的降門脈壓作用，并評價其與普萘洛爾、卡維地洛在肝硬化大鼠門脈高壓癥中的作用優(yōu)劣，為臨床尋求新的更加合理有效地降門脈壓藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及材料健康成年雄性SD大鼠54只［體質量（200±20）g］，購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心。

普萘洛爾（山西臨汾云鵬藥業(yè)有限公司生產）、卡維地洛（寧波市天衡制藥有限公司生產）、阿羅洛爾（住友制藥有限公司生產）均購自西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院。α-SMA免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔IgG多克隆抗體購自北京博奧森生物工程有限公司，Masson染色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。血流動力學指標采用Power Lab4/ 20T（AD Instruments，由西安交通大學醫(yī)學部機能實驗中心提供）數據采集分析系統(tǒng)記錄并分析。

1.2 造模及分組給藥54只大鼠隨機選取8只作為正常對照組，給予普通飼料、自由飲水，適應性飼養(yǎng)2周后取標本處死；余46只用于造模，普通飼料，自由飲水，并給予400 mL/L四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）橄欖油溶液腹腔注射，首次5 mL/kg，此后3 mL/kg，每周2次，共8周。造模期間死亡12只，于造模第6周將余下34只大鼠隨機分為4組，模型組8只、普萘洛爾組8只、卡維地洛組9只、阿羅洛爾組9只，分別給予蒸餾水2 mL、普萘洛爾3.0 mg/kg、卡維地洛2.5 mg/kg、阿羅洛爾2.0 mg/kg，總量分2次每日灌胃，共2周。

1.3 血流動力學指標的測定由專人操作，術前禁食12 h，禁飲4 h，以200 g/L烏拉坦（1 g/kg，腹腔注射）麻醉，右頸總動脈插管（5號頭皮針）測定平均動脈壓和心率，上腹正中切口，門靜脈插管（7號頭皮針）測門靜脈壓力。待各觀測指標穩(wěn)定后由Power-Lab數據采集系統(tǒng)記錄并分析。測壓完畢后立即從門靜脈采血，離心后取血清，-20℃貯存；取肝右葉組織，40 g/L多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋。

1.4 血清生化指標的測定將離心所得血清送檢西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院檢驗科，測定谷丙轉氨酶（alanine transaminase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）。

1.5 肝組織病理學檢查肝右葉組織常規(guī)石蠟包埋，4μm厚度連續(xù)切片，行HE染色和Masson三色染色。普通顯微鏡下觀察HE染色后肝組織形態(tài)學變化。采用Image pro plus 6.0軟件進行Masson染色結果的分析。Masson染色每張切片選取5個視野（×100），每個視野1 447 680μm2視場面積，結果表示為：膠原纖維面積百分比=膠原纖維著色面積/視場面積×100%，取平均值。

1.6 肝組織α-SMA免疫組化染色肝組織石蠟包埋塊4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，30 m L/L過氧化氫去除內源性過氧化物酶，室溫置20 min，PBS沖洗，高壓鍋120℃修復4 min，PBS沖洗，滴加一抗（1∶800），4℃過夜，室溫復溫30 min，PBS沖洗，滴加生物素化二抗，37℃水浴30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Image pro plus 6.0軟件進行免疫組化結果分析，每張切片選5個視野（×400），每個視野選取1 447 680μm2視場面積，測定陽性面積百分比=陽性著色面積/視場面積×100%，平均吸光度值=累積吸光度（IA）/視場面積，取其平均值。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0軟件處理數據。實驗結果以表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗，兩組間比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組血流動力學指標的比較共7只大鼠因穿刺不成功或麻醉過深未測出，余結果如下：阿羅洛爾組PVP較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；阿羅洛爾組PVP較普萘洛爾組更低（P＜0.001），而與卡維地洛組相比無統(tǒng)計學差異（P= 0.456）；和模型組比較，阿羅洛爾組及卡維地洛組的MAP和HR均明顯下降（P＜0.05）；卡維地洛組MAP較阿羅洛爾組更低（P=0.011）；普萘洛爾組僅MAP較模型組顯著下降（P=0.003），而HR變化無統(tǒng)計學差異（P=0.143，表1）。

表1 各組門靜脈壓力（PVP）、平均動脈壓（MAP）及心率（HR）的測定結果Tab.1 The results of PVP，MAP and HR in each group（）

表1 各組門靜脈壓力（PVP）、平均動脈壓（MAP）及心率（HR）的測定結果Tab.1 The results of PVP，MAP and HR in each group（）

與模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與普萘洛爾組比較，&P＜0.05，ΔP＜0.01；與卡維地洛組比較，ψP＜0.05，θP＜0.01。

2.2 各組血清ALT、TBIL、ALB的測定結果比較卡維地洛組ALT、TBIL、ALB均較模型組明顯改善（P＜0.01，P＜0.01，P=0.045）；阿羅洛爾組和普萘洛爾組僅TBIL較模型組顯著下降（P＜0.05），兩組間ALT、TBIL、ALB相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。

2.3 各組肝臟組織病理形態(tài)的改變①HE染色結果。正常對照組肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，結構完整，無變性、壞死及炎性細胞浸潤（圖1 A）。模型組肝索排列紊亂，肝細胞可見脂肪變性、壞死，大量粗細不均的纖維條索分割包繞肝組織，廣泛假小葉形成（圖1B）。普萘洛爾組匯管區(qū)及肝小葉內可見較多淋巴細胞浸潤，纖維組織增生明顯，假小葉形成（圖1C）?？ňS地洛組和阿羅洛爾組肝細胞脂變、空泡形成較明顯，部分假小葉消失（圖1D）。②Masson染色結果。正常對照組膠原纖維僅見于管壁結構（圖2A）；模型組膠原纖維增生明顯，包繞假小葉周圍（圖2B）。普萘洛爾組假小葉結構明顯，仍可見較多纖維沉積，但明顯少于模型組（P＜0.001，圖2C）；阿羅洛爾組及卡維地洛組膠原纖維沉積均較模型組和普萘洛爾組明顯減少（P＜0.001）；卡維地洛組膠原纖維面積較阿羅洛爾組明顯降低（P=0.01，表3）。③α-SMA表達的比較。正常對照組大鼠肝臟中α-SMA表達僅見于血管壁平滑肌細胞胞質，在肝竇及匯管區(qū)等均無表達（圖3A）；模型組和各干預組α-SMA染色陽性細胞在纖維間隔中的細胞質和血管壁中均可見較多表達（圖3）。阿羅洛爾組、卡維地洛組和普萘洛爾組α-SMA表達均較模型組明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；阿羅洛爾組α-SMA的表達高于卡維地洛組（P=0.01），但較普萘洛爾組明顯減少（P＜0.001，表3）。

表2 各組血清ALT、TBIL、ALB的測定結果Tab.2 The results of serum ALT，TBIL and ALB in each group（）

表2 各組血清ALT、TBIL、ALB的測定結果Tab.2 The results of serum ALT，TBIL and ALB in each group（）

與模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與阿羅洛爾組比較，&P＜0.05，ΔP＜0.01。

表3 各組α-SMA的表達及Masson染色的結果Tab.3 The results ofα-SMA expression and Masson staining in each group（）

表3 各組α-SMA的表達及Masson染色的結果Tab.3 The results ofα-SMA expression and Masson staining in each group（）

與模型組比較，*P＜0.01；與普萘洛爾組比較，#P＜0.01；與卡維地洛組比較，&P＜0.05，ΔP＜0.01。

圖1 肝臟組織HE染色病理形態(tài)的變化Fig.1 Liver histopathological differences by HE staining（×100）A：正常對照組；B：模型組；C：普萘洛爾組；D：阿羅洛爾組。

圖2 Masson染色各組膠原纖維的分布Fig.2 Distribution of collagen fibers in each group by Masson staining（×100）A：正常對照組；B：模型組；C：普萘洛爾組；D：阿羅洛爾組。

圖3 各組α-SMA在肝臟組織中的表達Fig.3 The expression ofα-SMA in liver tissues in each group（×400）A：正常對照組；B：模型組；C：阿羅洛爾組；D：卡維地洛組。

3 討 論

非選擇性β受體阻滯劑是預防食管靜脈曲張患者首次出血及再出血的一線藥物。但是，目前認為僅1/3～1/2的患者對其反應良好［8］。研究表明，肝硬化門脈高壓癥患者單獨服用α1受體阻滯劑哌唑嗪后能夠明顯降低肝靜脈壓力梯度，但循環(huán)低血壓、腹水的發(fā)生率增加，腎功能惡化［9］。當哌唑嗪與普萘洛爾聯(lián)用后不僅有更強的降門脈壓作用，而且對腎功能沒有不良影響［10］，這為第3代非選擇性β受體阻滯劑的臨床應用提供了依據。已有不少研究證明阿羅洛爾用于治療高血壓患者降壓療效好，且沒有腎功能損害［11-13］，對糖代謝無不良影響［14-15］。然而，阿羅洛爾降門脈壓效果如何尚未可知。本實驗通過動物模型測定阿羅洛爾干預后肝硬化門脈高壓大鼠的門靜脈壓力，結果表明阿羅洛爾不僅能顯著降低門靜脈壓力，且效果與卡維地洛相似，二者均優(yōu)于普萘洛爾。

國內外較多研究［16-19］表明阿羅洛爾用于治療輕、中度高血壓療效確切，有效率高。阿羅洛爾同時具有α1和β受體阻滯的作用，阻斷β1受體使心率減慢，心輸出量下降，循環(huán)血容量下降，血壓降低；阻斷α1受體，使血管舒張，外周阻力減小，血壓進一步下降。本實驗結果中阿羅洛爾組和卡維地洛組MAP均較模型組明顯下降，但以卡維地洛對MAP的影響較大?？赡茉驗榭ňS地洛對α1受體的阻滯作用強于阿羅洛爾，其擴張血管作用更顯著。TRIPATHI等［9］研究表明，卡維地洛12.5 mg/（kg·d）能夠維持有效的降低門脈壓力的作用，且不引起低血壓，耐受性較好，而給患者服用卡維地洛25 mg/（kg·d）時，則引起明顯的低血壓，說明卡維地洛對血壓的效應呈劑量依賴性。報道稱阿羅洛爾對血壓也具有相似的效應［20］。提示我們臨床用藥時應從小劑量開始，盡量減少副作用。

樊曉明等［21］研究稱卡維地洛可以改善CCl4致大鼠的肝纖維化，可能機制為抑制肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化與增殖，抗氧化改善氧應激［22］，阻滯β受體等。目前，普遍認為HSC的活化與增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)［23-24］。研究資料表明交感神經系統(tǒng)的興奮性增強可以促進肝纖維化的發(fā)生，且交感神經系統(tǒng)可能是通過作用于HSC而實現(xiàn)其對肝纖維化的調節(jié)［25-26］。本研究結果顯示，阿羅洛爾組和卡維地洛組血清肝功能指標較模型組有所改善，Masson染色膠原纖維面積較模型組明顯減少，說明非選擇性β受體阻滯劑可能是通過降低交感神經系統(tǒng)的活性而抑制肝纖維化的形成。此外，阿羅洛爾、卡維地洛和普萘洛爾組α-SMA的表達均較模型組明顯減少，提示三者均能夠抑制HSC的活化，從而減少細胞外基質的沉積，達到改善肝纖維化的作用。而且，非選擇性β受體阻滯劑還能抑制HSC的收縮［27-28］，降低肝竇內壓，改善門靜脈高壓。

綜上，本研究表明阿羅洛爾具有顯著降低門靜脈壓力的作用，且優(yōu)于普萘洛爾。在改善肝功能及肝組織學纖維化指標方面阿羅洛爾不及卡維地洛，但阿羅洛爾對MAP的影響要小于卡維地洛。目前仍需較多研究證實阿羅洛爾應用于門脈高壓癥患者的有效性和安全性，為臨床上食管靜脈曲張出血的治療提供更多選擇。

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（編輯 韓維棟）

Therapeutic effects of arotinolol，propranolol and carvedilol on portal hypertension in cirrhotic rats

WANG Xiao-yan，WAN Xiao-long，GUO Xiao-yan，DONG Lei，QIN Bin，LI Jing
（Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center；Shaanxi Key Laboratory of Gastrointestinal Motility Disorders；Shaanxi Clinical Research Center of Gastrointestinal Disease，Xi’an 710004，China）

ObjectiveTo study the effects of arotinolol，propranolol and carvedilol on rat portal hypertension and make a comprehensive evaluation of the three drugs.MethodsPortal hypertension was induced with CCl4in rats.Arotinolol，propranolol，and carvedilol were administered for 2 weeks after the model was stable.Mean arterial pressure（MAP），heart rate（HR）and portal venous pressure（PVP）were measured at intubation；α-SMA expression was measured by immunohistochemistry；Masson staining was used to test collagen fibers area.ResultsCompared with model group，both arotinolol and carvedilol could significantly reduce PVP level（P＜0.001），which was lower than that in propranolol group（P＜0.001，P=0.032）.Compared with those in model group，both MAP and HR in arotinolol group and carvedilol group were significantly reduced（P＜0.05），MAP in carvedilol group was lower than in arotinolol group（P=0.011）.MAP was obviously decreased in propranolol group compared with model group（P=0.003），but HR had no sighificant difference between the two groups（P=0.143）.Only TBIL in arotinolol and propranolol groups reduced significantly compared with model group（P＜0.001）.However，ALT，ALB and TBIL were obviously ameliorated in carvedilol group compared with model group（P＜0.001，P＜0.001， P=0.045）.The expression ofα-SMA and the area of collagen fibers in arotinolol，carvedilol and propranolol groupssignificantly declined compared with those in model group（P＜0.05）.ConclusionArotinolol can significantly reduce cirrhotic rats'portal pressure，with effects similar to those of carvedilol.The effect of arotinolol in improving liver function is weaker than that of carvedilol，but the side effects on MAP are milder than those of carvedilol.

arotinolol；carvedilol；propranolol；portal hypertension；rat

R575.2

A

10.7652/jdyxb201506003

2014-11-12

2015-03-30

“十二五”國家科技支撐計劃子課題資助項目（No.2012BAJ18B03-03）

Supported by the sub-program of“Twelve Fifth”National Science and Technology Plan Project（No.2012BAJ18B03-03）

董蕾.E-mail：dong556@126.com；*萬曉龍并列第一作者.

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150720.1132.004.html（2015-07-20）