利用Gibson Assembly技術(shù)構(gòu)建乙型肝炎病毒1.1倍體復(fù)制子

方琳琳,宋瀏偉,楊 林,吳 勇,袁 權(quán),夏寧邵

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心,福建廈門361101)

利用Gibson Assembly技術(shù)構(gòu)建乙型肝炎病毒1.1倍體復(fù)制子

方琳琳,宋瀏偉,楊 林,吳 勇,袁 權(quán)*,夏寧邵

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心,福建廈門361101)

乙型肝炎病毒(HBV)基因組各開放閱讀框高度重疊,因此構(gòu)建可在體外細(xì)胞模型中復(fù)制的HBV DNA質(zhì)粒至少要包含1.1倍以上的HBV基因組.構(gòu)建HBV1.1倍體復(fù)制子的傳統(tǒng)克隆方法涉及多步DNA酶切/連接,操作復(fù)雜,耗時較長.本研究發(fā)展了基于新型克隆技術(shù)Gibson Assembly構(gòu)建HBV1.1倍體復(fù)制子質(zhì)粒的新方法,在獲得HBV基因組DNA后僅需1步體外裝配即可完成,利用這一方法,本研究成功從4份HBV感染者標(biāo)本中獲得HBV1.1倍體復(fù)制子,并通過瞬時轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,證明其能夠支持HBV的體外復(fù)制.本研究為從臨床標(biāo)本中快速獲得HBV復(fù)制子克隆以研究病毒表型功能提供了更為高效的新方法.

乙型肝炎病毒;Gibson Assembly;1.1倍體

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題之一[1].它通過血液、體液等傳播,HBV感染可導(dǎo)致急性或者慢性感染,急性感染有可能引起暴發(fā)性肝病,導(dǎo)致死亡,而對于慢性感染人群,則患肝硬化或肝癌的概率大大上升,全球慢性乙肝患者已經(jīng)超過2億4千萬人,每年大約有60萬人死于HBV感染相關(guān)疾病[2].中國是HBV高流行區(qū),有近1億HBV攜帶者,其中每年新發(fā)HBV感染達(dá)10萬以上,慢性乙型肝炎患者高達(dá)3 000萬人[3],多種肝臟疾病與HBV的持續(xù)感染相關(guān),例如,原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),其發(fā)病率和死亡率分別位于全球惡性腫瘤的第五位和第三位,在我國癌癥死亡率中排名第二[4-5].因此,對HBV的預(yù)防和治療研究任重而道遠(yuǎn).

HBV為正嗜肝DNA病毒屬[6],其基因組大小約3.2 kb,為部分雙鏈的松弛環(huán)狀DNA,共包含4個開放閱讀框(open reading frames,ORF),即S-ORF、PORF、C-ORF、X-ORF,4種ORF分別有各自的啟動子.其中S-ORF分別編碼3個包膜蛋莊:L-HBsAg (編碼序列:nt2854-nt3221/1-nt832)、M-HBs Ag(編碼序列:nt3211-nt3221/1-nt832)和S-HBsAg(編碼序列:nt155-nt832);C-ORF編碼Pre-Core蛋莊(HBe Ag,編碼序列:nt1814-nt2456)和Core蛋莊(HBc Ag,編碼序列:nt1901-nt2456),HBe Ag是一種分泌型蛋莊,在慢性感染中起到耐受宿主免疫應(yīng)答的作用,Pre-Core組成病毒Capsid,并包裹病毒基因組.由于HBV基因組結(jié)構(gòu)緊密,高度壓縮,重復(fù)利用,不同編碼基因相互重疊,啟動子和增強(qiáng)子等調(diào)控序列又位于編碼基因之內(nèi),ORF分布于全長DNA,某個部位的基因突變將影響多個基因的表達(dá),因此需要含大于3.2 kb的HBV基因序列的載體才能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)建立HBV的復(fù)制狀態(tài)[7].通常需要構(gòu)建HBV1.1或者以上倍體復(fù)制子用于病毒功能的研究.

本實(shí)驗(yàn)利用新型克隆技術(shù)“Gibson Assembly”[8],從臨床標(biāo)本中構(gòu)建了HBV1.1倍體復(fù)制子,并轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞驗(yàn)證其功能;避免了傳統(tǒng)方法中多步酶切等繁復(fù)的實(shí)驗(yàn)步驟,大大提高了克隆構(gòu)建的效率,為HBV臨床研究和病毒功能研究提供了更快速高效的方法.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 HBV陽性血清

4份HBs Ag陽性標(biāo)本來自西藏林芝醫(yī)院(血清樣本的處理及病毒DNA提取均在P2級病毒室操作).標(biāo)本的基本信息如表1所示.

1.1.2 質(zhì)粒、菌株及主要試劑

真核表達(dá)載體p TT22E由實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建; PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase為大連寶生物(TaKaRa)公司產(chǎn)品;QIAamp DNA Blood MiniKit試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;感受態(tài)細(xì)胞DH5α、質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(離心柱型)均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品(TIANGEN);Gibson Assembly?Master Mix為紐英倫(NEW ENGLAND Bio Labs)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Turbofect Transfection Reagent為MBIFermentas公司的產(chǎn)品.

1.1.3 細(xì)胞內(nèi)顆粒中DNA提取所需試劑

除了QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品以外,還需以下試劑:PBS溶液:20 mmol/L NaCl,2.68 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.76 mmol/L KH2PO4;細(xì)胞裂解液:10 mmol/L TB8.0,1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖,1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))非離子變性劑乙基苯基聚乙二醇(NP40).

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中HBV全基因序列設(shè)計(jì)PCR所需引物.另外,根據(jù)Gibson Assembly的引物設(shè)計(jì)原則,為了保證引物特異性,特異性結(jié)合區(qū)設(shè)為18～25個堿基,在引物的5′端加入交疊序列.交疊序列與臨近序列的末端同源,交疊序列的長度≥20 bp.

引物Ec1816F/n224R用于擴(kuò)增A片段,引物n199F/Hd2049R用于擴(kuò)增B片段.p TT1369F、p TT1342R分別為擴(kuò)增載體的上下游引物,S3、S4分別為鑒定上下游引物,所有引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.引物序列如表2(下劃線部分為相應(yīng)酶切位點(diǎn)).

1.2.2 標(biāo)本的處理及血清HBV DNA提取

標(biāo)本于ˉ20℃保存,檢測前取出自然化凍,去血清標(biāo)本200μL,用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取,按照核酸提取試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作,最后得到100μL血清DNA提取物溶液.

表1 臨床樣本具體信息Tab.1 Sample demographic and clinical characteristics

表2 PCR分段擴(kuò)增HBV基因組所用引物(I)、擴(kuò)增載體所用引物(II)以及鑒定引物(III)Tab.2 Primers used for HBV DNA amplification(I),primers used for vector amplification(II)and primers for identification(III)

1.2.3 A、B片段的擴(kuò)增

以血清中提取的HBV DNA為模板,以Ec1816F、n224R為引物擴(kuò)增A片段,以n199F、Hd2049R為引物擴(kuò)增B片段.采用高保真性聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR反應(yīng)體系為50μL,反應(yīng)體系包括5×Prime-STAR GXL Buffer 10μL,d NTP混合液(2.5 mmol/ L)4μL(終濃度0.2 mmol/L),引物各1μL(終濃度0.4μmol/L),PrimeSTAR?GXL酶1μL,HBV DNA 5μL,補(bǔ)加超純水至50μL;擴(kuò)增條件:98℃預(yù)變性10 min;98℃變性30 s,58℃退火30 s,68℃延伸2 min,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min.用1.5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的瓊脂糖凝膠于TAE緩沖液中電泳回收PCR產(chǎn)物,采用TIANGEN公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒,按其說明書使用回收.

1.2.4 載體的制備

用PCR擴(kuò)增出線性載體再用Dpn1處理的方法制備.以p TT22E質(zhì)粒作為模板,以p TT1369F、p TT1342R為引物,采用高保真性聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase擴(kuò)增載體,擴(kuò)增條件:98℃預(yù)變性10 min;98℃變性30 s,58℃退火30 s,68℃延伸6 min,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min.之后,用Dpn1處理,1μL Dpn1+1μL Dpn1 Buffer/50μL的比例,37℃反應(yīng)60 min,80℃5 min使Dpn1失活.用1%的瓊脂糖凝膠于TAE緩沖液中電泳回收PCR產(chǎn)物,采用TIANGEN公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒,按其說明書使用回收.

1.2.5 pTT22E-1.1HBV克隆的構(gòu)建

Gibson Assembly是Dr.Daniel Gibson發(fā)展出的體外高效快速合成DNA的新方法,現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于分子克隆的構(gòu)建,尤其是大片段及多片段的分子克隆構(gòu)建.其原理如圖1(a)所示,Gibson Assembly的體系主要由T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase、Taq DNA ligase 3種核心酶組成.T5 exonuclease具有5′-3′DNA外切酶活性,制造載體與片段或片段與片段之間的互補(bǔ)末端;Phusion DNA polymerase具有3′-5′DNA聚合酶活性,互補(bǔ)單鏈退火后將缺口補(bǔ)齊; Taq DNA ligase具有連接酶活性,將兩條單鏈間切口連接.利用這3種酶和緩沖液按一定比例配成預(yù)混液,即可實(shí)現(xiàn)50℃一步反應(yīng)的目的[8].同時,Gibson Assembly合成的DNA沒有缺口或切口,不依賴大腸桿菌(Escherichia coli)的修復(fù),因此效率高,可在轉(zhuǎn)化前跑膠鑒定組裝是否成功.

根據(jù)圖1(b)中所示的流程圖,在獲得片段和載體之后,將片段1、2與載體進(jìn)行Gibson Assembly,體系為:2×Gibson mix為4μL,片段A、B分別為1.5μL,載體為1μL,50℃反應(yīng)1 h.連接產(chǎn)物直接做轉(zhuǎn)化,用TIANGEN公司的DH5α感受態(tài).挑取單菌落,接種于5 m L LB/AMP+液體培養(yǎng)基中,180 r/min,37℃過夜培養(yǎng).用引物S3、S4進(jìn)行菌液PCR鑒定,挑選菌液PCR陽性的提質(zhì)粒,電泳,通過質(zhì)粒大小鑒定是否插入了外源片段.

1.2.6 核苷酸測序鑒定

將PCR鑒定陽性的克隆送上海Invitrogen公司進(jìn)行核酸序列測定.在美國Applied Biosystem公司生產(chǎn)的3730自動測序儀上分段進(jìn)行測序.

1.2.7 轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞來自于本實(shí)驗(yàn)室,轉(zhuǎn)染前,將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM),于轉(zhuǎn)染前1 d轉(zhuǎn)至十二孔板培養(yǎng),按照Turbofect的轉(zhuǎn)染方法說明,將上述HBV體外重組質(zhì)粒與GFP質(zhì)粒(m(HBV質(zhì)粒)∶m(GFP質(zhì)粒)=9∶1)共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Huh7.4 d后收集細(xì)胞上清,利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液的HBs Ag與HBe Ag水平.

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒中DNA的定量檢測

根據(jù)之前的報(bào)道,用PEG8000沉淀HBV core,提取core DNA[9],并用實(shí)時熒光定量PCR檢測HBV DNA[10].

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用Gibson Assembly的方法構(gòu)建1.1倍體時,一些重要步驟所對應(yīng)的結(jié)果如圖2所示,先用PCR的方法獲取載體,然后用Dpn1消化后,采用柱法回收.處理完的載體,與回收好的2個片段,一起進(jìn)行50℃Gibson Assembly后,轉(zhuǎn)化、涂板、挑菌并鑒定即可獲得目的克隆.

2.1 兩片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

按前述PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件,獲得PCR產(chǎn)物,將其在1.5%和1%的瓊脂糖凝膠中電泳,藍(lán)光燈下觀察到約1.6和1.9 kb的條帶(片段1和2),以及6 kb的條帶(載體).結(jié)果與預(yù)期片段大小相符(圖2(a)和(b)).

圖1 Gibson Assembly原理示意圖(a)和Gibson Assembly構(gòu)建1.1倍HBV感染性克隆流程圖(b)Fig.1 Overview of the Gibson Assembly method(a)and diagram for process of the cloning(b)

2.2 Gibson Assembly質(zhì)粒鑒定

2.2.1 PCR鑒定結(jié)果

以p TT22E-1.1HBV為模板,PCR擴(kuò)增S片段,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,可得到500 bp的片段,與預(yù)計(jì)片段大小相符,說明從臨床樣本中PCR得到的1.1倍的HBV DNA已和載體連接,亦即HBV1.1倍體復(fù)制子已經(jīng)構(gòu)建成功.如圖2(c)所示。

2.2.2 測序分析

測序結(jié)果經(jīng)核對后完全正確,也進(jìn)一步證實(shí)插入的基因片段方向及核昔酸序列正確.

測序結(jié)果已提交GenBank后獲得的收錄號分別為:KP276253、KP276254、KP276255、KP276256(分別來自表1中的編號1874、1887、1888、1925).

2.3 構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7

根據(jù)測序結(jié)果,選擇沒有突變的質(zhì)粒,將此HBV體外重組質(zhì)粒與GFP共轉(zhuǎn)到人肝癌細(xì)胞株Huh7中,轉(zhuǎn)染2 d后熒光顯微鏡觀察,結(jié)果如圖3(a)所示,另單轉(zhuǎn)GFP質(zhì)粒用以質(zhì)控轉(zhuǎn)染效率,如圖3(b)所示.轉(zhuǎn)染4 d后收集細(xì)胞上清,檢測其HBs Ag與HBe Ag,結(jié)果發(fā)現(xiàn)均呈陽性,如圖4(a)和(b)所示;并裂解細(xì)胞,提取胞內(nèi)的HBV病毒顆粒中的DNA,進(jìn)行HBV DNA的定量.

再經(jīng)過細(xì)胞數(shù)量及轉(zhuǎn)染效率的標(biāo)化后獲得如圖4 (c)所示的每個細(xì)胞中的病毒拷貝量的結(jié)果.結(jié)果顯示,除編號1874對應(yīng)的樣本相對較低外,其余3株1.1倍克隆均能在細(xì)胞中有效復(fù)制.

圖2 用Gibson Assembly方法構(gòu)建HBV 1.1倍體復(fù)制子Fig.2 Construction of 1.1-fold-overlength genome plasmids by Gibson Assembly

圖3 1.1倍HBV重組質(zhì)粒與GFP共轉(zhuǎn)Huh7 2 d后得到的常光拍攝圖和熒光圖(a);單轉(zhuǎn)GFP指征每一孔細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(b)Fig.3 GFP channel and phase contrast channel were recorded at 48 h after co-transfection(a)and GFP transfection only(b)

3 討 論

從感染機(jī)制上來看,HBV感染宿主細(xì)胞后,基因組DNA進(jìn)入細(xì)胞核,經(jīng)DNA聚合酶修復(fù)缺失部分,形成共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)[11].HBV基因組DNA在復(fù)制過程中至少轉(zhuǎn)錄5種主要的mRNA,其中pregenomic (pg)RNA,長約3.5 kb,由Core Promoter啟動,包含HBV基因組的全部序列,是HBV用作病毒復(fù)制的RT模板,并可以翻譯Core和Pol蛋莊,長度約為HBV全基因組的1.1倍.形成正確的pgRNA是HBV DNA重組質(zhì)粒支持體外HBV復(fù)制的必要條件[12-13],所以在體外可復(fù)制的HBV DNA重組體至少要包含1.1倍以上的HBV基因組,而由于HBV基因組的特殊結(jié)構(gòu),構(gòu)建體外可復(fù)制重組體比較困難.

圖4 轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后檢測上清的HBsAg水平(a)和HBeAg水平(b)和細(xì)胞內(nèi)的顆粒中DNA水平(c)Fig.4 Detection of HBs Ag(a)and HBeAg(b)in supematants 96 h after transfection and the quantity of HBV DNA in cells 96 h after transfection(c)

有效HBV體外感染模型的缺乏,極大地限制了HBV的研究.據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道,多數(shù)與HBV相關(guān)的體外研究都是通過HBV DNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞系(如HepG2和Huh7細(xì)胞)來進(jìn)行.而現(xiàn)有的HBV體外重組體基本是通過多步復(fù)雜的酶切連接過程對標(biāo)準(zhǔn)病毒株進(jìn)行片段置換而形成,這些方法會受制于HBV高度異質(zhì)性[15-16],因此通用性較差,而且,酶切方法具有序列依賴性,對酶切位點(diǎn)有嚴(yán)格的要求,也會造成通用性差,因此難以用于多樣本的臨床試驗(yàn)研究.

此外,為了防止PCR過程中HBV序列發(fā)生變異,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們應(yīng)用了高保真性聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠.相比于r Taq DNA聚合酶,具有高保真性、適合于“熱啟動”PCR、可用于高GC含量模板等優(yōu)點(diǎn),它還配有最佳的緩沖液,對多種的目標(biāo)物都可進(jìn)行長鏈PCR.但是此高保真性聚合酶也有缺點(diǎn),即其PCR產(chǎn)物為平末端,需要另外加A尾才能進(jìn)行T克隆的連接,但是本文用的Gibson Assembly的方法避免了T克隆連接這一步,所以用此高保直性聚合酶非常合適.

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也可以看出4份HBs Ag陽性的標(biāo)本,都能有HBeAg的表達(dá),但是HBsAg與HBeAg沒有呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性.在臨床中,不同的病人中HBs Ag和HBe Ag是有差異的,因?yàn)椴煌∪梭w內(nèi)感染的HBV的復(fù)制表達(dá)能力并不相同,同時一些常見突變,例如HBs Ag MHR區(qū)突變,前C區(qū)/C區(qū)基本核心啟動子突變等可以顯著影響HBs Ag和HBe Ag的分泌.血清中HBsAg與HBeAg的水平有一定的相關(guān)性,在臨床病例中,一般HBe Ag陽性的病人HBs Ag定量水平相對HBe Ag陰性的病人普遍較高,但HBeAg的定量水平目前由于缺乏臨床意義而極少研究,另外由于HBs Ag和HBe Ag由HBV基因組不同的ORF分別編碼,所以二者并不是絕對的相關(guān).

4 結(jié) 論

本研究從HBV感染者血清中直接提取DNA作為模板,應(yīng)用分子生物學(xué)新技術(shù)Gibson Assembly的方法快速構(gòu)建HBV全基因組1.1倍體,能夠盡量避免復(fù)雜的酶切和連接過程,并且得到的HBV DNA序列完全來自臨床樣本病毒株基因組,能夠支持HBV體外復(fù)制.僅需3個步驟就可以將臨床血中的基因組構(gòu)建為1.1倍基因組克隆,周期僅僅只有2 d.我們采取的這種新型的基于Gibson Assembly的1.1倍基因組克隆構(gòu)建方法,獲得的產(chǎn)物效率高、操作簡便、實(shí)驗(yàn)周期短,可以作為一種簡單快速的方法驗(yàn)證分析臨床調(diào)取的HBV表型,例如復(fù)制能力和病毒抗原表達(dá)水平.

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Using Gibson Assembly to Construct Replication-competent 1.1 Copies of Hepatitis B Virus Genome

FANG Lin-lin,SONG Liu-wei,YANG Lin,WU Yong,YUAN Quan*,XIA Ning-shao
(National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, School of Public Health,Xiamen University,Xiamen 361101,China)

:Hepatitis B virus(HBV)has a highly compact genetic organization,that is why the replication-competent genome which can fulfill the entire HBV lifecycle in vitro is arranged as an over 100%head to tail DNA genome,at least 1.1 copies of HBV genome.There always concludes several times of restriction enzyme digestion and connection in the traditional construction methods, leading to the steps of previous methods are cumbersome and time consuming.In this report,we develop a novel strategy based on Gibson Assembly and result in a fast and convenient method which just needs one step to complete the construction after HBV DNA obtained.In this method,we successfully constructed 4 1.1-fold-overlength genome plasmids directly extracted from serum specimens and confirmed the plasmid is replication-competent by transfecting in Huh7 cells.This new strategy simplifies the construction procedures and results in a fast and high-efficiency method that is especially suitable to be applied in clinical samples.

hepatitis B virus;Gibson Assembly;1.1 copies

R 373.2+1,Q 785

A

0438-0479(2015)03-0324-07

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.005

2014-07-26 錄用日期:2015-01-04

*通信作者:yuanquan@xmu.edu.cn

方琳琳,宋瀏偉,楊林,等.利用Gibson Assembly技術(shù)構(gòu)建乙型肝炎病毒1.1倍體復(fù)制子[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2015,54(3):324-330.

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