Anti-hEGFR輕、重鏈共表達及高表達細胞株快速篩選

李德山，劉春香，姜媛媛，劉銘瑤，張瑛杰，袁清艷，郭笑辰，任桂萍，吳強，李婷婷（.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱50030；.哈藥集團技術(shù)中心，哈爾濱5005）

Anti-hEGFR輕、重鏈共表達及高表達細胞株快速篩選

李德山1，劉春香1，姜媛媛2，劉銘瑤1，張瑛杰1，袁清艷1，郭笑辰1，任桂萍1，吳強1，李婷婷1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱150030；2.哈藥集團技術(shù)中心，哈爾濱150025）

為實現(xiàn)hEGFR全長抗體（anti-hEGFR）輕、重鏈共表達以及建立快速、高效篩選方法并獲得共表達細胞株。采用分子克隆技術(shù)獲得重鏈和輕鏈基因，將之連入peedual真核表達載體；經(jīng)GS-Neo加壓及流式細胞術(shù)篩選獲得穩(wěn)定表達細胞株；通過proteinA親和層析技術(shù)純化出目標抗體；應(yīng)用cck-8法、AnnexinV/PI法以及qPCR技術(shù)檢測anti-hEGFR對A431細胞增殖、凋亡影響。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，純化后抗體純度為95.0%、分子質(zhì)量約為150 ku。cck-8試驗中不同濃度anti-hEGFR對A431細胞增殖均有極顯著抑制作用，且與商品化Cetuximab效果相近；anti-hEGFR與Cetuximab均可誘導(dǎo)A431細胞產(chǎn)生凋亡，作用效果相近，均達極顯著。全長抗體輕、重鏈的共表達，省去分別表達的重組過程，保證抗體天然結(jié)構(gòu)；GS-Neo雙加壓結(jié)合流式篩選，實現(xiàn)陽性細胞株快速、高效分離；建立省時、高效抗體共表達平臺，為抗體類藥物真核構(gòu)建及篩選提供新思路。

anti-hEGFR；共表達載體；GS-Neo篩選；流式細胞術(shù)；抗腫瘤

表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是表皮生長因子（erbB）家族成員，具有酪氨酸激酶活性膜表面受體[1]，EGFR穩(wěn)定表達于許多上皮組織、間質(zhì)和神經(jīng)源性組織。不同器官發(fā)生的實體瘤也高表達EGFR，如頭頸部癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和食管癌等[2]，Janani等研究發(fā)現(xiàn)，EGFR通過與相應(yīng)配體結(jié)合實現(xiàn)RAS/RAF/MEK/ ERK和PI3K/AKT信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，兩個通路間通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)運行[3]。

目前，用于EGFR靶向性治療腫瘤的藥物主要有小分子化合物酪氨酸激酶拮抗劑和EGFR單克隆抗體（anti-hEGFR）兩類，藥物通過調(diào)節(jié)細胞周期、促進細胞凋亡、抑制細胞轉(zhuǎn)移殺傷腫瘤細胞。一系列癌癥類型臨床揭示，接受小分子化合物酪氨酸激酶拮抗劑治療的患者中約有50%發(fā)生獲得性EGFR耐藥突變[4-5]。抗體針對相應(yīng)抗原具有高特異性和高親和力特性，毒副作用較低，在疾病診斷和治療中有專一性。目前已上市抗腫瘤抗體藥物共20種，其中美國FDA批準17個[6]。

原核生物不含蛋白加工修飾細胞器，因此，大腸桿菌表達系統(tǒng)僅用于生產(chǎn)體積小、結(jié)構(gòu)簡單、不需要糖基化的抗體片段如Fab、Fab'、scFv等[7]；低等真核生物表達系統(tǒng)，如酵母及絲狀真菌，可用于全長抗體生產(chǎn)，但其糖基化類型與人類存在差異，此類型糖蛋白抗體半衰期較短、生理活性有限甚至對人體有毒性[8]。最接近于人體蛋白修飾的系統(tǒng)為哺乳動物表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以對蛋白進行適當折疊、裝配和翻譯修飾，在臨床應(yīng)用中占主導(dǎo)地位[9-10]。

抗體輕、重鏈同時表達并有效整合是載體構(gòu)建關(guān)鍵部分，高效篩選方法是蛋白藥物研發(fā)核心。本研究在載體中引入谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因，并在輕鏈下游插入增強型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因，在重鏈下游插入Neo基因，該方法不僅可保證輕、重鏈同時整合于表達細胞基因組，可通過兩種藥物加壓篩選并結(jié)合流式細胞儀分選，快速獲得高產(chǎn)細胞株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞株和載體

大腸桿菌E.coli DH5α，細胞株CHO-K1SV，真核表達載體Kozak-Pkappa、Pee6.4，Ires Neo均由東北農(nóng)業(yè)大學生命中心基因部保存；anti-EGFR抗體LC、HC由英濰捷基公司合成；皮膚鱗癌細胞株A431購自ATCC；IRES-EGFP購自美國Clontech，Pee12.4購自Lonza；pMD18-T simple載體，購自大連寶生物。

1.1.2 試劑

Taq DNA聚合酶，T4DNA連接酶，限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒，質(zhì)粒DNA小提試劑盒，去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；SDS-PAGE相關(guān)試劑購自Amersham Pharmacia Biotech公司；蛋白分子質(zhì)量標準購自Fermentas公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、G418購自GIBCO公司；MSX、L-谷氨酰胺購自Sigma Corporation；胰蛋白酶購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司；GS supplement，HT supplement購自Invitrogen；IMDM培養(yǎng)基購自M＆C corporation；cck-8試劑盒購自日本同仁化學研究所（Dojindo）；細胞凋亡檢測試劑盒購自寶賽生物公司；Quantitative Real-time PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司。

1.1.3 引物

引物均由Invitrogen公司合成，序列見表1、2。

1.2 方法

1.2.1 真核表達載體構(gòu)建

真核表達載體peedual-anti-hEGFR由Pee12.4、Pee6.4、Kozak-Pkappa載體及anti-hEGFR重鏈和輕鏈、PIRES-Neo、PIRES-EGFP基因序列經(jīng)多步PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化得到。

1.2.2 細胞的電轉(zhuǎn)及陽性細胞篩選

取對數(shù)生長期CHO-K1SV細胞以1∶3濃度傳代，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至匯合度為70%～80%，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min后用PBS洗細胞一次，將細胞用無血清IMDM培養(yǎng)基稀釋計數(shù)，使?jié)舛冗_1×107個·mL-1。將20μg質(zhì)粒DNA加入400μL細胞懸液中，250 V、1 000Ω、1 000μF參數(shù)下電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染后細胞轉(zhuǎn)入含有10%FBS的完全培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)30 h后更換含GS、G418培養(yǎng)基加壓篩選，只有轉(zhuǎn)入該載體的細胞可以存活，待細胞長至約90%后，用胰蛋白酶消化，PBS洗一次，再用PBS重懸細胞進行流式細胞儀（購自BD公司）分選。

1.2.3 Anti-hEGFR表達及純化

將未轉(zhuǎn)染空細胞及分選后陽性細胞分別接種六孔板，待細胞匯合度達90%時，用PBS洗一次，換成無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)約72 h后取培養(yǎng)上清，1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清與標準品Cetuximab同時做SDS-PAGE分析。

表1 基因擴增引物Table 1 Primers for gene amplification

表2 qPCR引物Table 2 Primers for qPCR

收集約400 mL細胞培養(yǎng)上清，使用AKTA Purifier 100蛋白層析系統(tǒng)抗體純化。純化后蛋白用SDS-PAGE分析，并用紫外分光光度計（ND-1000型Spectrophotometer）測定濃度。

1.2.4 cck-8試驗檢測anti-hEGFR對A431細胞增殖影響

收集處于對數(shù)生長期A431細胞，用新鮮完全培養(yǎng)基將其稀釋至5×104個·mL-1后，按每孔100μL體積接種于96孔板（邊孔以培養(yǎng)基填充），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至匯合度為60%～70%。將anti-hEGFR及Cetuximab分別用無血清DMEM稀釋到3 000 ng·mL-1后，經(jīng)倍比稀釋直至最小濃度為93.75 ng·mL-1，將各濃度藥品依次加入接好的細胞中，此時設(shè)置調(diào)零孔、對照孔、試驗孔及標準品試驗孔。72 h后取出培養(yǎng)板，向每孔中加入cck-8溶液10μL，將板放入培養(yǎng)箱中，培育1 h±10 min。使用酶標儀450 nm波長下測定吸光度值，計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=（對照組OD均值-試驗組OD均值）/對照組OD均值×100%

1.2.5 流式細胞儀檢測Anti-hEGFR蛋白對A431細胞凋亡影響

取對數(shù)生長期的A431細胞以1～5×105個·mL-1濃度接種于六孔板，分三組，分別為Control、anti-hEGFR和Cetuximab組，24 h后將anti-hEGFR和Cetuximab分別以3 000 ng·mL-1濃度稀釋，加入試驗組細胞中，48 h后收集細胞進行凋亡檢測，檢測方法參見寶賽生物凋亡試劑盒說明書。

1.2.6 qPCR技術(shù)檢測bax/bcl2 mRNA水平變化

取對數(shù)生長期的A431細胞以1～5×105個·mL-1濃度接種于六孔板，并分為三組，分別為Control、anti-hEGFR和Cetuximab組，24 h后將anti-hEGFR和Cetuximab以3 000 ng·mL-1濃度稀釋，加入試驗組細胞中。48 h后收集細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin表達量作為內(nèi)參，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)因子bax/bcl2相對表達情況。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 anti-hEGFR真核共表達載體構(gòu)建

該載體由pee6.4、pee12.4、Kozak-Pkappa真核表達載體及Ires EGFP、Ires Neo、anti-hEGFR的重鏈和輕鏈經(jīng)過多步酶切、PCR、連接、轉(zhuǎn)化而獲得。構(gòu)建成功載體如圖1所示。

圖1 peedual-anti-hEGFR真核共表達載體構(gòu)建Fig.1 Profiles of peedual-anti-hEGFR eukaryotic co-expression vector

2.2 陽性細胞株篩選

利用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將peedual-anti-hEGFR真核共表達載體轉(zhuǎn)入CHO-K1SV細胞中，經(jīng)GS、G418加壓篩選結(jié)合流式細胞術(shù)分選出穩(wěn)定、高效的表達anti-hEGFR細胞株（見圖2）。

2.3 Anti-hEGFR蛋白表達及純化

將空細胞及篩選出的陽性細胞分別用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)并收取上清，經(jīng)非還原性SDS-PAGE分析可見（見圖3A），空細胞不表達抗體，篩選到的細胞株可以表達抗體，大小與商品化的標準品Cetuximab相符。利用AKTA Purifier 100蛋白層析系統(tǒng)，通過proteinA親和層析技術(shù)純化出的全長抗體純度約為95.0%（見圖3B）。

2.4 cck-8法檢測anti-hEGFR對A431細胞抑制作用

cck-8檢測結(jié)果（見圖4）所示，與陰性對照組相比，不同濃度anti-hEGFR對A431細胞均有抑制作用，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），anti-hEGFR組與標準品相比，各濃度均差異不顯著。結(jié)果表明通過共表達方法獲得的anti-hEGFR對EGFR過表達型腫瘤細胞A431具有明顯抑制作用。

圖2 陽性細胞株分選Fig.2 Positive cells were identified and sorted by flow cytometry at 488 nm

2.5 Anti-hEGFR蛋白對A431細胞凋亡情況檢測

利用AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡情況，細胞總凋亡率為早期凋亡（Q2）與晚期凋亡（Q4）比率之和，結(jié)果（見圖5）可見，空白對照組凋亡率為12.0%，而anti-hEGFR組與Cetuximab組凋亡率分別為23.4%和23.6%，anti-hEGFR組與空白對照組相比促凋亡效果顯著（P＜0.01）。

2.6 anti-hEGFR對細胞凋亡相關(guān)因子mRNA表達水平影響

圖3 anti-hEGFR的表達及純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis the expression and purification of anti-hEGFR

圖4 cck-8法檢測anti-hEGFR對A431細胞增殖的抑制作用Fig.4 A431 cellinhibition caused by anti-hEGFR was determined with cck-8

圖5 anti-hEGFR對A431細胞凋亡的作用Fig.5 Effectof anti-hEGFR on apoptosis of A431 cells

Bcl2、Bax的qPCR檢測結(jié)果見圖6，與空白對照組相比，anti-hEGFR組中Bcl2基因在mRNA水平上顯著降低（P＜0.05），Bax基因mRNA水平顯著提高（P＜0.01），而anti-hEGFR組與Cetuximab組相比無顯著差異。Bax的上調(diào)表達可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生凋亡，同時Bcl2基因下調(diào)表達可抑制細胞增殖。結(jié)果表明，anti-hEGFR可以通過調(diào)節(jié)Bcl2、Bax表達促進由EGFR通路誘導(dǎo)的細胞凋亡。

圖6 anti-hEGFR對A431細胞中Bcl2和Bax基因mRNA水平的影響Fig.6 Effect of anti-hEGFR on Bcl2 and Bax mRNA expression in A431 cells

3 討論與結(jié)論

目前，F(xiàn)DA批準的抗體藥物多產(chǎn)自中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary cells，CHO），CHOK1SV細胞是可以懸浮生長的谷氨酰胺合成酶（GS）缺陷型細胞，因此可以在表達載體上游加入GS基因作為篩選標記，利用GS抑制物甲硫胺酸亞砜（L-Methionine sulfoxide，MSX）加壓篩選[11]；G418是一種氨基糖苷類抗生素，通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601和n5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中最常用的抗性篩選劑[12]。由于GS及Neo篩選標記不能直觀監(jiān)測及分選陽性細胞，因此，本試驗在輕鏈的下游引入EGFP基因，EGFP是GFP突變體，具有更高的熒光強度，在488 nm波長光激發(fā)下可產(chǎn)生綠色熒光，進而通過流式細胞儀檢測和分選[13-15]；本試驗在EGFP及Neo基因上游引入內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry sites，IRES），IRES來自腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV），能在真核細胞內(nèi)模擬mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)，招募核糖體進入并使其上游及下游的兩個轉(zhuǎn)錄子同時翻譯，被廣泛用于各類蛋白真核表達[16]。在陽性細胞篩選過程中，多數(shù)只在載體構(gòu)建時引入單一篩選標記，且只用一種篩選方法，使篩選時間長達數(shù)月甚至造成高表達細胞株丟失，最終無法達到預(yù)期效果。

本試驗對原有真核表達載體進行改造，通過亞克隆方法獲得EGFR單克隆抗體輕、重鏈基因，并將之連入同一真核表達載體，從而保證抗體基因同時表達。EGFR單克隆抗體輕、重鏈的共表達避免分別表達后的重組過程，省去摸索最佳重組條件的時間，保持抗體天然活性，在抗腫瘤方面與商品化的Cetuximab有相近作用。多篩選標記的加入使篩選工作可在一個月內(nèi)完成，節(jié)約共表達細胞株的篩選時間，加快研發(fā)進程。該研究可為抗體的真核表達及細胞分選提供可靠方法，為抗體大量制備奠定基礎(chǔ)。

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Co-expression of anti-hEGFR light and heavy chain and rapid screening of cell lines

LI Deshan1,LIU Chunxiang1,JIANG Yuanyuan2,LIU Mingyao1, ZHANG Yingjie1,YUAN Qingyan1,GUO Xiaochen1,REN Guiping1,WU Qiang1,LI Tingting1
(1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Harbin PharmaceuticalGroup Technology Center,Harbin 150025,China)

The aim of this study was to co-express hEGFR fulllength antibody(anti-hEGFR)light and heavy chains,also to establish a rapid screening method and obtain co-expressing cell lines.fulllength heavy chain and light chain were connected to peedual eukaryotic expression vector,which cloned by molecular cloning techniques.stably expressing cell lines were screened by GS-Neo pressure combining flow cytometry;the target antibody was purified by proteinA affinity chromatography;To validate the influence for cell proliferation and apoptosis of anti-hEGFR,cck-8 assay, AnnexinV/PImethod and qPCR were applicated to A431 cell.SDS-PAGE showed that molecular weight ofanti-hEGFR was about150 ku and relative purity was 95.0%.In cck-8 assay,the proliferation ofA431 cells were significantly inhibited,and anti-hEGFR had similar effects with Cetuximab.anti-hEGFR hadthe same effect with Cetuximab in terms of pro-apoptotic of A431 cells.Co-expression could eliminate the refolding process and ensure the activity;The method of GS-Neo pressure combining flow cytometry could achieve a fast and efficient separation of positive celllines;In this study,the province and efficient co-expression platform was established,which could offer new ideas for the production of antibody drugs.

anti-hEGFR;co-expression vector;GS-Neo screening;flow cytometry;anti-tumor

Q816

A

1005-9369（2015）10-0056-07

時間2015-10-28 16:14:39[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151028.1614.040.html

李德山,劉春香,姜媛媛,等.Anti-hEGFR輕、重鏈共表達及高表達細胞株快速篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(10):56-62.

Li Deshan,Liu Chunxiang,Jiang Yuanyuan,et al.Co-expression of anti-hEGFR light and heavy chain and rapid screening ofcelllines[J].Journalof NortheastAgriculturalUniversity,2015,46(10):56-62.(in Chinese with English abstract)

2015-02-11

國家自然基金東北農(nóng)業(yè)大學生物學理科基地科研訓(xùn)練及科研能力提高項目（J1210069/J0116）；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目（GC13C104）

李德山（1950-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為生物技術(shù)制藥。E-mail:deshanli@163.com