低溫纖維素降解菌分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

李春艷，于琦，馮露，成毅，成小松，王雪，張平根（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱50030；.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，哈爾濱5000）

低溫纖維素降解菌分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

李春艷1，于琦1，馮露1，成毅1，成小松2，王雪1，張平根1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，哈爾濱150001）

采用富集培養(yǎng)方法在低溫條件下從生活垃圾土壤中分離得到1株能夠降解纖維素細(xì)菌，命名為FLX-1。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)和分子生物學(xué)16S rDNA序列分析，將菌株FLX-1鑒定為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）細(xì)菌。為探索菌株FLX-1生長特性和最佳產(chǎn)酶條件，利用響應(yīng)面分析方法考查培養(yǎng)時間、溫度、pH和接種量對菌株FLX-1產(chǎn)羧甲基纖維素（Carboxymethylcellulose，CMC）酶活特性影響情況。結(jié)果表明，菌株FLX-1最佳產(chǎn)酶條件為培養(yǎng)時間74.1 h，溫度10.5℃，pH 7.1，接種量2.1%。在最佳條件下，菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活值為14.12 U·mL-1。

纖維素；低溫降解菌；Arthrobacter sp.；CMC酶；響應(yīng)面分析法

我國北方嚴(yán)寒地區(qū)農(nóng)村有機生活垃圾種類和數(shù)量逐年增加。由于嚴(yán)寒地區(qū)冬季水量少、氣溫低、持續(xù)時間長，因此不適宜采用堆肥法處理有機生活垃圾，目前主要以單純填埋或野外堆放焚燒等方法處理，不僅效率低，且對大氣、河流和土壤等環(huán)境造成嚴(yán)重污染[1]。探索高效處理嚴(yán)寒地區(qū)農(nóng)村有機生活垃圾的新方法，是亟待解決問題。

86.8 %有機生活垃圾由餐廚垃圾、水果、蔬菜等組成，主要成分為難降解多糖纖維[2]。目前，已篩選出較多能夠降解纖維素的真菌和放線菌，如青霉屬（Penicillium sp.）[3]、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）[4]和漆斑霉屬（Myrothecium sp.）[5]等；對纖維素降解細(xì)菌研究相對較少，且主要集中在篩選高溫和中溫纖維素降解菌，廖青等從發(fā)酵床墊料中分離出1株纖維素降解細(xì)菌（Streptomyces sp.）F21，30°C培養(yǎng)4 d，CMC酶活值為72.5 U·mL-1[6]。朱軍莉等從袋裝降解筍干中分離出1株纖維素降解細(xì)菌（Bacillus subtilis）BSX5，50℃培養(yǎng)12 h，CMC酶活值為54.5 U·mL-1[7]。低溫纖維素降解細(xì)菌研究鮮見報道。

本文從生活垃圾土壤中篩選分離得到1株低溫條件下高效降解纖維素細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rDNA序列分析等對其鑒定，并對該菌株產(chǎn)CMC酶條件優(yōu)化。該菌株篩選獲得可充實低溫降解纖維素的菌種資源，為探索嚴(yán)寒地區(qū)有機生活垃圾處理新方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

土壤樣品源自黑龍江省哈爾濱市南崗區(qū)王崗鎮(zhèn)后興隆村垃圾站。

1.2 培養(yǎng)基

依姆歇涅茨基纖維素分解菌培養(yǎng)基[8]。

纖維素降解菌分離培養(yǎng)基:CMC-Na 5 g，（NH4）H2PO40.5 g，MnSO4·H2O 2.5 g，K2HPO42 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 7.5 mg，MgSO42 g，NaCl 0.3 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。

纖維素降解菌鑒別培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.25 g，（NH4）2SO41.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

無機鹽纖維素瓊脂平板培養(yǎng)基：CMC-Na 20 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl20.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.004 g，ZnCl20.007 g，CoCl20.002 g，（NH4）2SO41.4 g，K2HPO42.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.3 g，酵母膏0.5 g，CaC12·2H2O 0.3 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO4

4.0 g，CMC-Na 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min，在配制固體培養(yǎng)基時按2%添加瓊脂粉。

1.3 低溫纖維素降解菌富集與分離

取土壤樣品10.0 g加入100 mL LB液體培養(yǎng)基，25℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，取上清液梯度稀釋，分別取10-1～10-9稀釋液1 mL接種在10 mL依姆歇涅茨基纖維素分解菌培養(yǎng)基中，從濾紙條降解程度高的地方挑取菌落接種到分離培養(yǎng)基上，反復(fù)劃線純化直至獲得純菌。將分離純化得到的純菌在無機鹽纖維素瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3～5 d，從25℃起始以5℃為梯度降溫，最終獲得能在低溫條件下生長的菌株。將低溫菌株點種到纖維素鑒別培養(yǎng)基上，10℃倒置培養(yǎng)3～5 d，倒入1 mg·mL-1剛果紅染液染色1 h后[9]，用1 mol·L-1NaCl浸泡1 h脫色，觀察菌落周圍透明圈產(chǎn)生情況。

1.4 低溫纖維素降解菌的鑒定

將低溫纖維素降解菌采用平板劃線法接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，10℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察菌落形態(tài)，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行生理生化鑒定[10]。采用分子生物學(xué)16S rDNA序列分析方法[11]對菌株種屬鑒定，引物為通用引物，由大連寶生物有限公司合成，反應(yīng)體系及條件參考文獻(xiàn)[12]。測序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank中同源性比較，采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.5 低溫纖維素降解菌酶活測定

將產(chǎn)生透明圈的菌株接種于100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為陰性對照。10℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)72 h，取5 mL發(fā)酵液，4℃、3 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液，測定發(fā)酵液中CMC酶活力[14-15]。

1.6 低溫纖維素降解菌產(chǎn)酶活性研究

1.6.1 單因素試驗

分別以1%、2%、3%、4%、5%作為菌體接種量試驗組；分別以5、10、15、20和25℃作為溫度試驗組；分別以24、48、72、96、120 h作為培養(yǎng)時間試驗組；分別以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0作為pH試驗組。以上各試驗組均在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中恒溫?fù)u床160 r·min-1振蕩培養(yǎng)，以不加菌作為陰性對照，以蒸餾水作為空白對照，每隔24 h測定其CMC酶活和OD600。

1.6.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken design（BBD）模型設(shè)計四因素三水平試驗，以接種量（A）、溫度（B）、培養(yǎng)時間（C）、pH（D）為自變量，以CMC酶活為唯一響應(yīng)值，其中試驗設(shè)計因素水平見表1。二次回歸方程用以擬合自變量和響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系[16]，公式如下：

式中，Y-預(yù)期響應(yīng)值；A-常數(shù)；Aj-單因素直線系數(shù)；Ajj-單因素平方系數(shù)；Aij-兩個因素的交互系數(shù)。

表1 菌株FLX-1響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments ofstrain FLX-1

2 結(jié)果與分析

圖1 菌株FLX-1菌落及菌體形態(tài)Fig.1 Colony and thallus morphologicalcharacteristics of strain FLX-1

表2 菌株FLX-1形態(tài)特征Table 2 Morphologicalcharacteristics of strain FLX-1

2.1 低溫菌株分離純化

經(jīng)分離和純化獲得1株低溫高效纖維素降解細(xì)菌，命名為FLX-1。菌株FLX-1菌落培養(yǎng)特征、革蘭氏染色照片和透射電鏡照片如圖1所示。菌株FLX-1菌落和菌體形態(tài)特征分別見表2，生理生化指標(biāo)見表3。

表3 菌株FLX-1生理生化特征Table 3 Physiologicaland biochemicalcharacteristics of strain FLX-1

圖2 降解菌FLX-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree ofstrain FLX-1

2.2 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株FLX-1序列已在GenBank中注冊，登錄號為KM658453。菌株FLX-1與數(shù)據(jù)庫中同源性較高的9個細(xì)菌模式株比較，菌株FLX-1的16S rDNA序列與Arthrobacter sp.的9個種均有較高序列同源性，其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系見圖2。由圖2可知，菌株FLX-1與Arthrobacter sp.SS-2009-PA1（FN646598）及Arthrobacter sp.TSBY-63（DQ173019）相似性均為99. 0%。目前，細(xì)菌分類學(xué)家的共識是，當(dāng)兩個細(xì)菌的16S rDNA相似性大于95%時，可將其歸為同一屬。從系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知，菌株FLX-1屬于Arthrobacter sp.。

2.3 單因素試驗結(jié)果

由圖3可以看出，不同因素對菌株FLX-1生長量及產(chǎn)CMC酶活力影響情況。如圖3a所示，接種量為2%時，菌株FLX-1生長量和產(chǎn)CMC酶活力均達(dá)最大值，分別為1.63和13.22 U·mL-1，可知2%為最佳接種量。由圖3b可知，當(dāng)溫度為10℃時，菌株FLX-1生長量和產(chǎn)CMC酶活力均達(dá)最高點，產(chǎn)CMC酶活力最大值為13.67 U·mL-1。圖3c顯示，菌株FLX-1生長量及產(chǎn)CMC酶活力隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，當(dāng)培養(yǎng)時間為72 h，菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活力達(dá)最大值，為13.66 U·mL-1。由圖3d可知，菌株FLX-1生長量隨pH增加無明顯變化，當(dāng)pH 7.0～8.0時，菌株FLX-1生長量最佳，說明菌株FLX-1適合在中性偏堿性環(huán)境中生長。菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活力隨pH增加先增大后減小，當(dāng)pH 7.0時，菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活力達(dá)最大值，為13.64 U·mL-1。

綜上所述，影響菌株FLX-1生長量和產(chǎn)CMC酶活力最適條件為接種量2%、溫度10℃、培養(yǎng)時間72 h、pH 7.0。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

菌株FLX-1響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表4。利用Design-Expert8.0.6軟件，對BBD模型試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多項回歸分析得到二次擬合模型為：Y= 13.57-0.052A-0.54B-0.50C-0.43D+0.12AB-0.44AC+ 0.097A D-0.87BC+0.42BD+0.45C D-0.34 A2-1.50B2-1.58C2+0.087D2

此回歸方程中，Y為菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活；A、B、C、D分別為接種量、溫度、培養(yǎng)時間和pH的編碼值。

表5是利用Design-Expert8.0.6軟件分析得出菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活力響應(yīng)分析試驗的回歸分析結(jié)果。表中偏差平方和表示樣本值與平均值之間偏離量；均方差表示樣本值與平均值之間偏離程度；F值表示一個服從F分布的統(tǒng)計量，F(xiàn)值越大說明模型越顯著；P值為顯著性概率，當(dāng)P＞0.05時，表明變量對響應(yīng)值沒有顯著影響；當(dāng)P＜0.05時，表明變量對響應(yīng)值具有顯著影響；當(dāng)P＜0.01時，說明變量對響應(yīng)值有極顯著影響[15]。

圖3 各因素對菌株FLX-1生長量及產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of differentfactors on growth and enzyme production ofstrain FLX-1

由菌株FLX-1回歸分析結(jié)果可知，菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活模型P＜0.0001、F=50.84、失擬P= 0.3014、R2=0.9807，表明該模型與實際情況擬合良好[17]。B、C、D、AC、BC、BD、CD、A2、B2和C2的P＜0.05，說明這些獨立變量和交互組合對菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活影響顯著。在獨立變量中，B、C和D的P＜0.0001，但B的F值最大，即P值最小，說明在獨立變量中B對菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活發(fā)揮作用最顯著。在交互組合中，BC組合P值最小，說明BC對菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活發(fā)揮作用極顯著。

由上述結(jié)果可知，在產(chǎn)CMC酶活響應(yīng)曲面分析試驗中，各變量對CMC酶活影響作用由大到小依次為：溫度＞培養(yǎng)時間＞pH＞接種量。

不同交互組合對菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活影響的響應(yīng)曲面見圖4。響應(yīng)曲面圖是一個開口向下的曲面圖，通過觀察曲面傾斜度可確定交互組合對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高，即坡度越陡，說明兩個獨立變量交互作用越顯著。結(jié)合等高線圖

和響應(yīng)曲面圖能夠很好分析交互組合對響應(yīng)值影響情況。

表4 菌株FLX-1響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Experimentaldesign and results of RSMof strain FLX-1

表5 菌株FLX-1響應(yīng)分析試驗回歸分析結(jié)果Table 5 Results of the regression analysis of RSA ofstrain FLX-1

由圖4（a）可知，當(dāng)pH和培養(yǎng)時間固定在零水平（7.0，72 h）時，菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活較大值在接種量1.5%～2.5%和溫度9～11℃范圍內(nèi)獲得。圖4（b）為接種量-培養(yǎng)時間交互組合對CMC酶活影響情況。當(dāng)pH和溫度維持在零水平（7.0，10℃）時，菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶活較大值在接種量1.5%～2.5%和培養(yǎng)時間64～80 h范圍內(nèi)獲得。圖4（c）為溫度-培養(yǎng)時間交互組合對CMC酶活的影響情況。圖4（a）和圖4（b）相比可知，溫度-培養(yǎng)時間交互組合的曲面圖最陡峭，說明溫度-培養(yǎng)時間交互組合對CMC酶活作用顯著。

由上述分析結(jié)果可知，當(dāng)各因素固定在零水平時，較大的CMC酶活集中在曲面中心區(qū)域，并且在此區(qū)域內(nèi)均存在CMC酶活極值點。經(jīng)Design-Expert8.0.6軟件分析可得菌株FLX-1高產(chǎn)CMC酶活最優(yōu)條件為：接種量2.1%，溫度10.5℃，培養(yǎng)時間74.1 h，pH 7.1。

為驗證菌株FLX-1高產(chǎn)CMC酶活性響應(yīng)模型預(yù)測CMC酶活的準(zhǔn)確性和可靠性，在最佳條件下進(jìn)行3組平行驗證試驗，所得結(jié)果為（14.12± 0.055）U·mL-1，與模型預(yù)測值（14.24 U·mL-1）非常接近，表明該模型可預(yù)測試驗結(jié)果。

圖4 不同因素對菌株FLX-1的CMC酶活產(chǎn)生交互影響的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface plot of the mutualeffecton CMC ofstrain FLX-1

3 討論與結(jié)論

目前已篩選出較多能降解纖維素的真菌和放線菌，對纖維素降解細(xì)菌研究相對較少，但由于細(xì)菌繁殖快、發(fā)酵周期短，細(xì)菌產(chǎn)纖維素降解酶研究已引起關(guān)注[6-8]。按常規(guī)方法篩選獲得的纖維素降解細(xì)菌產(chǎn)CMC酶最適溫度多為45～65℃，而目前篩選到的低溫纖維素降解菌產(chǎn)CMC酶最適溫度為20℃，黃玉蘭等從若爾蓋高寒濕地距表層80 cm處土壤中篩選出1株低溫纖維素酶高產(chǎn)菌株（Brevundimonas sp.）XW-1，20℃培養(yǎng)3 d最高酶活為15.6 U·mL-1[18]；侯進(jìn)慧等從農(nóng)田、農(nóng)產(chǎn)品果實表面分離獲得1株低溫纖維素降解菌株（Bacillus sp.）T34，20℃培養(yǎng)48 h最高酶活為1.43 U·mL-1[19]。這種溫度條件無法達(dá)到北方有機生活垃圾降解處理要求。因此，篩選出低溫條件下具有高效產(chǎn)CMC酶能力的細(xì)菌對嚴(yán)寒地區(qū)有機生活垃圾處理尤為重要。

本試驗從生活垃圾土壤中篩選分離獲得1株低溫纖維素高效降解細(xì)菌Arthrobacter sp.FLX-1，pH 7.0、10℃、接種量2%條件下培養(yǎng)72 h，最高酶活為13.64 U·mL-1。同時，對菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶條件優(yōu)化[20-21]。本試驗采用響應(yīng)面分析方法對菌株FLX-1產(chǎn)CMC酶條件優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為溫度10.5℃，培養(yǎng)時間74.1 h，pH 7.1，接種量2.1%，最高酶活值達(dá)到14.12 U·mL-1，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后產(chǎn)CMC酶活力比優(yōu)化前提高0.45 U·mL-1，優(yōu)化率為3.29%。

后續(xù)研究將進(jìn)一步探索菌株FLX-1發(fā)酵條件及優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以獲得更高酶活性的細(xì)菌發(fā)酵液。探究多株低溫纖維素降解菌的復(fù)配并研究復(fù)配菌劑對生活垃圾的處理效果，為嚴(yán)寒地區(qū)有效降解農(nóng)村有機生活垃圾提供技術(shù)支持。

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Isolation and identification of low-temperature cellulose-degrading bacterium and optimization of enzyme production conditions

/
LI Chunyan1, YU Qi1,FENG Lu1,CHENG Yi1,CHENG Xiaosong2,WANG Xue1,ZHANG Pinggen1
(1.School of Resources and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.SchoolofFirstClinicalMedicine,Harbin MedicalUniversity,Harbin 15001,China)

A cellulose-degrading strain FLX-1 was isolated from domestic waste soil samples at low temperature by enrichment culture.According to morphologic and physiological-biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence analysis,strain FLX-1 was identified as Arthrobacter sp. The effects of culture time,temperature,pH and inoculation size on the carboxymethyl cellulose enzyme activity by strain FLX-1 were optimized using a response surface methodology(RSM).The results showed that the optimal enzyme production conditions were culture time 74.1 h,temperature 10.5℃,pH 7.1 and inoculation size 2.1%.At the best conditions,the carboxymethylcellulose enzyme activity ofstrain FLX-1 was 14.12 U·mL-1.

cellulose;low-temperature degradation bacterium;Arthrobacter sp.;carboxymethyl cellulose enzyme;response surface methodology

S789；S182

A

1005-9369（2015）10-0074-08

時間2015-10-29 13:40:55[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151029.1340.008.html

李春艷,于琦,馮露,等.低溫纖維素降解菌分離鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(10):74-81.

Li Chunyan,Yu Qi,Feng Lu,et al.Isolation and identification of low-temperature cellulose-degrading bacterium and optimization of enzyme production conditions[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(10):74-81.(in Chinese with English abstract)

2015-03-19

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAJ12B02-4）

李春艷（1970-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為環(huán)境微生物。E-mail:chunyanli@neau.edu.cn