禽流感病毒H5、H7和H9亞型一步法多重RT-PCR檢測方法的建立

屈素潔，莫勝蘭，鄒聯(lián)斌，胡 杰，張步嫻，梁 媛，粟艷瓊，施開創(chuàng)，李 軍

（廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科 （Orthomyxoviridae）A 型流感病毒屬中不同亞型病毒引起的禽類感染和疾病的總稱。禽流感病毒（AIV）為單股負鏈RNA病毒，基因組有8個獨立的RNA節(jié)段組成，根據(jù)其表面血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，可分為16個HA亞型和9個NA亞型［1-2］，AIV抗原變異性強，宿主范圍廣泛，且亞型之間無交叉保護性，使得禽流感頻繁暴發(fā)。高致病性禽流感主要是由H5或H7亞型AIV引起的，潛伏期極短，突然暴發(fā)，多不見任何臨床癥狀而突然死亡，發(fā)病率和病死率高達100%［3］，另外還可感染人，甚至導致死亡［4-5］。目前，我國部分地區(qū)以H9亞型為主的中低致病性禽流感的流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失，已引起國內(nèi)各界學者的廣泛關注［6］。早期快速檢測無疑是預防、控制禽流感的關鍵。

禽流感的診斷，包括病原的分離鑒定、瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗、免疫熒光法和ELISA等常規(guī)方法發(fā)揮了重要作用，但這些方法操作比較繁瑣，費時、費力。聚合酶鏈反應（PCR）方法不僅特異、敏感，而且簡易、快速。多重PCR是一種特殊PCR形式，其最突出特點是可同時檢測、鑒別出多種病原體［7-9］，極大地縮短禽流感病毒的檢出時間，為AIV早期快速診斷提供了敏感、快速、實用的方法。本試驗采用了多重RT-PCR技術，建立了能同時檢測H5、H7和H9亞型AIV的一步法多重RT-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和質粒 禽流感病毒（AIV-H1毒株、AIV-H3毒株、AIV-H5毒株、AIV-H6毒株、AIVH9毒株）、雞新城疫病毒（NDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞毒支原體（MG）及雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）均由廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心保存；AIV-H7亞型質粒由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、膠回收試劑盒、pMD18-T載體，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DH5α感受態(tài)細胞，Tiangen公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank中公布的 H5、H7和H9亞型AIV的HA基因序列，通過MegAligen軟件進行比對，應用Primer 5.0軟件設計3對引物（表1），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA的提取 參照RNA提取試劑盒操作說明書進行。

表1 多重RT-PCR引物Table 1 Multiplex RT-PCR primers

1.2.3 一步法多重RT-PCR反應 參照一步法RT-PCR試劑盒操作說明，RT-PCR反應體系，即PrimeScript 1step Enzyme Mix 2μL，2×step buffer 25μL，上、下游引物各1μL（10μmol／L），RNA模板10μL，加ddH2O至50μL。反應條件，即50℃30min；95℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，共35個循環(huán)。反應結束后取產(chǎn)物5μL～10μL用12g／L瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察擴增結果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 用膠回收試劑盒，從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉化DH 5α感受態(tài)細胞后，送寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定。

1.2.5 特異性試驗 用上述方法對禽流感病毒（AIV-H1毒株、AIV-H3毒株、AIV-H6毒株）、雞新城疫病毒（NDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞毒支原體（MG）及雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的病毒材料進行進行特異性檢測試驗。

1.2.6 敏感性測定 將 H5、H7和 H9亞型AIV的RNA做10倍系列稀釋后進行多重RT-PCR，測定該一步法多重RT-PCR對RNA的最低檢測量。

2 結果

2.1 RT-PCR擴增結果

禽流感病毒H5、H7和H9型擴增后獲得的片段與預期大小完全一致，分別為380、501、732bp（圖1）。

2.2 測序鑒定

分別將測得的H5亞型序列同GenBank登錄號為HM172455、JX534549等5株，H7亞型序列同GenBank登錄號為KJ415825、KF420296等5株，H9亞型序列同GenBank登錄號為DQ064366、DQ064366等5株亞型序列同源性比較，結果都大于80% ，證明PCR所擴出的片段分別為H5、H7和H9亞型的特異性片段。

圖1 一步法多重RT-PCR擴增結果Fig.1 The results of one step-multiplex RT-PCR

2.3 特異性試驗

H5、H7、H9亞型 AIV RNA經(jīng)一步法多重RT-PCR擴增，在380、501、732bp分別出現(xiàn)了擴增條帶，而 H1、H3、H6亞型 AIV，NDV、MG、IBV和ILTV均無擴增條帶出現(xiàn)，即為陰性（圖2），表明H5、H7和H9亞型AIV與其他亞型AIV和禽呼吸道病原體的核酸不存在交叉反應，特異性強。

圖2 一步法多重RT-PCR的特異性試驗Fig.2 Specificity test of the one step-multiplex RT-PCR

2.4 敏感性試驗

經(jīng)測定，該一步法多重RT-PCR對H5、H7和H9亞型AIV RNA的最低檢測量分別為10-4、10-4、10-2拷貝／μL（圖3）。

3 討論

圖3 一步法多重RT-PCR敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of the one step-multiplex RT-PCR

傳統(tǒng)禽流感診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)和血清學試驗，這些方法操作繁瑣，時間長，重復性不好［10］。AIV血清型眾多，且新的變異株不斷出現(xiàn)，而制備血清型特異性單克隆抗體相對困難。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，接種雞胚進行A型流感病毒增毒過程中，發(fā)生了介導變異［11］，所有這些限制了傳統(tǒng)方法在實際中的應用。RT-PCR作為一種靈敏、快速簡便而且經(jīng)濟實用的檢測方法已經(jīng)在許多領域得到廣泛應用，尤其是多重RT-PCR倍受青睞，當樣品數(shù)量大、病原亞型多時，多重RT-PCR顯示出獨特的優(yōu)勢，能夠高通量、低成本進行批量快速檢測多個亞型［12-13］。

本研究引物是根據(jù)禽流感病毒亞型決定片段HA片段進行的引物設計，建立了H5、H7和H9亞型禽流感病毒一步法多重RT-PCR檢測方法。可對H5、H7和H9亞型進行一次性區(qū)分，避免了二次檢驗，省時、省力，而且節(jié)約了資源。建立多重RTPCR對引物的要求相當高。在同一體系中同時加入多對引物，同時擴增多個基因，引物對之間的匹配與否對多重RT-PCR的擴增結果影響很大，尤其是體系的特異性。因此，在設計PCR引物時要考慮多個因素，如引物的退火溫度應大致相近，基因片段大小有一定梯度，以便于電泳分辨等。

以H5、H7和H9亞型流感病毒RNA作為模板進行一步法多重RT-PCR擴增，能夠擴增出大小為380、501、732bp的3個條帶，而以 AIV H1亞型、AIV H3亞型、AIV H6亞型、NDV、MG、IBV、IBDV和ILTV總RNA作為模板，卻不能擴增出任何條帶，表明該檢測方法特異性強。將抽提并測定含量的病毒RNA進行10倍稀釋，分別作為模板進行一步法多重RT-PCR擴增。結果表明，該多重RT-PCR對H5、H7和H9亞型AIV RNA的最低檢出量分別為10-4、10-4、10-2拷貝／μL，表明該檢測方法敏感度高。

本研究建立的一步法多重RT-PCR同時鑒別H5、H7和H9亞型AIV的方法，為禽流感的防控提供了有效的早期快速檢測手段奠定了基礎，因此在維護公共衛(wèi)生安全方面具有十分重要的意義。

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