溫和氣單胞菌毒力基因的檢測(cè)及其對(duì)鯽魚致病性試驗(yàn)

王海娟，王 利

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

溫和氣單胞菌（Aeromonassobria）屬弧菌科、氣單胞菌屬，是一種人、魚和其他動(dòng)物共患的條件性致病菌，可引起人類患細(xì)菌性腹膜炎、菌血癥、軟組織壞死、急性腸胃炎、闌尾炎、壞死性筋膜炎等疾?。?-3］，同時(shí)也可感染多種魚類。目前已從鱸魚、日本鰻鱺、羅非魚、中華鱉［4］、黃顙魚等分離鑒定出該菌。溫和氣單胞菌致病株的毒力與其產(chǎn)生的溶血素、腸毒素、細(xì)胞毒素及胞外酶等多種重要的致病因子有關(guān)。當(dāng)條件適宜時(shí)，該菌生長迅速，繁殖較快，其產(chǎn)生的毒素可引起機(jī)體復(fù)雜多樣的病理變化。

鯽魚（Cruciancarp）是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見淡水魚類。近年來，隨著水體惡化、養(yǎng)殖集約化等現(xiàn)象，細(xì)菌性疾病屢次發(fā)生，對(duì)鯽魚及整個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)人類的健康構(gòu)成了潛在的威脅。弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii）［5］、遲鈍愛德華菌（Edwardsiellatarda）、沙門菌（Salmonella）等相繼從發(fā)病鯽魚體內(nèi)分離出，但尚未見溫和氣單胞菌對(duì)鯽魚致病性研究的報(bào)道。本試驗(yàn)采用PCR方法對(duì)溫和氣單胞菌菌株A.S1進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，同時(shí)人工回歸感染鯽魚，旨在為進(jìn)一步研究溫和氣單胞菌在魚類中的致病機(jī)制提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 溫和氣單胞菌菌株A.S1由本校動(dòng)物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及儀器 普通營養(yǎng)瓊脂，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；DNA Marker D L 2 000，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和2×TaqPCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 制備DNA模板 將超低溫保存的溫和氣單胞菌菌株快速復(fù)蘇，接種于LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)過夜，簡(jiǎn)短離心，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的總DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的毒力基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)溫和氣單胞菌4種主要毒力因子溶血素基因（hly）、細(xì)胞興奮性腸毒素基因（alt）、黏附素基因（aha1）和氣溶素基因（aerA）的引物。引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 毒力基因擴(kuò)增 采用PCR方法對(duì)4種主要毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系（20μL）：ddH2O 7.4μL，上、下游引物各 0.8μL（引物濃度均為10μmol／L），2×TaqMix 10μL，DNA 模板1μL。PCR反應(yīng)程序：94℃3min；94℃30s，53s～60s（退火溫度見表1），72℃60s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。取PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

表1 溫和氣單胞菌毒力基因的引物序列Table 1 Primer sequences of virulence genes of Aeromonas sobria

1.2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將復(fù)蘇后的溫和氣單胞菌于LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180r／min培養(yǎng)過夜，簡(jiǎn)短離心，除去上層多余液體培養(yǎng)基。參考麥?zhǔn)媳葷岱?，?.5g／L的滅菌生理鹽水將該菌配置成濃度為1.5×108CFU／mL的菌懸液。將20條健康的鯽魚分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組分配10條，體長15cm～17cm，體重120g～150g。對(duì)照組每尾鯽魚注射0.3mL的無菌生理鹽水，試驗(yàn)組的每尾鯽魚腹腔注射等體積的菌懸液。每日觀察試驗(yàn)組鯽魚的癥狀并記錄死亡情況，連續(xù)觀察1周。及時(shí)對(duì)死亡鯽魚進(jìn)行剖檢，無菌條件下將其心、肝、脾等組織劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。應(yīng)用傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法和擴(kuò)增16SrDNA基因方法鑒定再次分離到的細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

溫和氣單胞菌的4種主要毒力基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，該菌株中擴(kuò)增到hly、alt和aha1 3種毒力基因，擴(kuò)增片段的長度分別為1 470、480、1 087bp，與預(yù)期片段長度基本相符。未擴(kuò)增出aerA基因。

2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將健康鯽魚腹腔注射溫和氣單胞菌菌懸液后，均在2d～5d發(fā)病死亡。發(fā)病鯽魚初期表現(xiàn)為行動(dòng)緩慢，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，眼周、下頜及鰭條基部輕微出血，鰓蓋周圍點(diǎn)狀出血。嚴(yán)重時(shí)魚體在水中失去平衡，體表大面積出血，且胸鰭、腹鰭和臀鰭出血加重，腹部腫大。解剖后發(fā)現(xiàn)，部分魚體腹腔有腹水，腸道充盈，肝臟質(zhì)地較脆，脾臟暗紅色。對(duì)照組的鯽魚在試驗(yàn)期間無發(fā)病及死亡情況。從人工回歸感染溫和氣單胞菌后的瀕死鯽魚的脾、肝和心組織中分離到形態(tài)與自然感染菌株一樣的細(xì)菌，該菌的16SrDNA基因比對(duì)結(jié)果顯示為溫和氣單胞菌。

圖1 菌株A.S1的毒力基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of virulence genes of strain A.S1

3 討論

3.1 毒力基因的檢測(cè)

氣單胞菌的致病機(jī)制是復(fù)雜的，是由多種毒力因子如腸毒素、溶血素、鞭毛A和B（fla）、脂肪酶（lip）、彈性蛋白酶（ela）、絲氨酸蛋白酶（ser）、ADP-轉(zhuǎn)移酶毒素（aexT）等相互作用的結(jié)果。檢測(cè)氣單胞菌屬的毒力基因?qū)Υ_定病原體潛在的致病性和后續(xù)可能的感染病原體的預(yù)防是至關(guān)重要的。

溫和氣單胞菌的溶血素對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞都具有細(xì)胞毒性和腸毒性。溶血素腸毒性作用的機(jī)制是可刺激培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生環(huán)腺苷酸。研究表明，溫和氣單胞菌的hly基因與嗜水氣單胞菌的氣溶素基因在氨基末端區(qū)域的序列是同源的，但在羧基端沒有同源性。程方俊等［6］從溫和氣單胞菌RC-07-KA菌株克隆擴(kuò)增出hly基因，并構(gòu)建了重組溶血素及檢測(cè)其活性。hly基因已從人源溫和氣單胞菌檢測(cè)到，本研究從魚源菌株A.S1中也檢測(cè)到了hly基因，這說明溶血素基因在多種不同來源的溫和氣單胞菌中存在。腸毒素包括細(xì)胞興奮性腸毒素、細(xì)胞毒腸毒素和細(xì)胞溶解性腸毒素。腸毒素前體是由488個(gè)氨基酸殘基合成，成熟的腸毒素其氨基末端的24個(gè)氨基酸殘基前體被移除。這些與抗原性相關(guān)的毒素被認(rèn)為在誘發(fā)機(jī)體腹瀉中起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞興奮性腸毒素可引起小鼠腸道液體的積累，但不會(huì)造成細(xì)胞損傷［7］。另外，溫和氣單胞菌腸毒素可使中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)乳糖脫氫酶（LDH）的釋放，當(dāng)增加葡聚糖時(shí)可抑制LDH的釋放和毒素對(duì)紅細(xì)胞的溶解作用。毒素可在紅細(xì)胞膜上形成膜孔，進(jìn)而形成滲透梯度造成紅細(xì)胞損傷。這與嗜水氣單胞菌的腸毒素致病機(jī)制很類似。Pablos M等［8］從分離自腹瀉患者和飲用水的800株氣單胞菌中，檢出毒力基因alt、hlyA、aerA、ast、laf攜帶率分別為 71.9%、28.1%、25.0%、18.8% 和9.4%。本研究中檢測(cè)到alt基因，這說明alt基因廣泛存在氣單胞菌屬中。

關(guān)于黏附素基因（aha1）報(bào)道的較少，在5株黃沙鱉源嗜水氣單胞菌中，毒力基因hly、aerA和act的檢測(cè)率為100%，ahal、alt和ahp 為80%［9］。13株致病性氣單胞菌中10株細(xì)菌同時(shí)攜帶毒力基因alt，ahal和aerA［10］。本試驗(yàn)菌株 A.S1中檢測(cè)出ahal基因。氣溶素aerA的致病機(jī)制是，其成熟蛋白可與宿主細(xì)胞表面的特異性糖蛋白受體相結(jié)合，植入脂質(zhì)雙分子層，形成膜孔，破壞細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，86株意大利氣單胞菌菌株（30%嗜水氣單胞菌、18.5%豚鼠氣單胞菌、23.7%殺鮭氣單胞菌）中83.7%菌株攜帶aerA基因［11］。109株墨西哥和西班牙人源氣單胞菌菌株中，檢測(cè)到攜帶aerA基因的菌株占89%［12］。本研究中沒有檢測(cè)到aerA基因，說明aerA毒力基因的分布是多樣性的，在不同宿主、不同地域和不同菌株間是存在差異的。

3.2 致病性研究

溫和氣單胞菌在河水和海水中也可以產(chǎn)生毒素，這說明自然界的溫和氣單胞菌的毒素可能會(huì)通過水體，食物源等途徑傳遞到人和動(dòng)物體，從而導(dǎo)致人和動(dòng)物體發(fā)病。關(guān)于溫和氣單胞菌的致病性已有部分研究。童桂香等［13］研究表明，溫和氣單胞菌對(duì)黃沙鱉具有較強(qiáng)的致病性，在人工感染30h后出現(xiàn)死亡。任紅梅等［14］發(fā)現(xiàn)，黃鱔在感染溫和氣單胞菌3h左右，其內(nèi)臟器官發(fā)生病變，12h～36h出現(xiàn)死亡高峰期。馬有智等［15］將溫和氣單胞菌分別感染小鼠和中華鱉發(fā)現(xiàn)，小鼠在感染24h內(nèi)全部死亡，健康鱉在感染6d～8d發(fā)病，17d出現(xiàn)死亡。本試驗(yàn)將溫和氣單胞菌感染鯽魚后發(fā)現(xiàn)，健康鯽魚在48h后出現(xiàn)發(fā)病癥狀，第3天出現(xiàn)死亡，這說明溫和氣單胞菌對(duì)鯽魚具有較強(qiáng)的致病性。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，應(yīng)加強(qiáng)水質(zhì)管理，同時(shí)采取積極的措施預(yù)防該病的發(fā)生。

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