三黃雞臨床血管瘤病例中分離出A亞群與J亞群禽白血病病毒

王培坤，畢玉彧，秦麗莉，鄒廣珍，彭 昊，韋 平

（廣西大學養(yǎng)禽與禽病學研究所，廣西南寧530004）

禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）能引起禽的各種造血細胞腫瘤性增生，是雞群中普遍存在著的一群反轉(zhuǎn)錄病毒［1］。其中 A、B、C、D、E、J 6個亞群能夠感染雞，A、J亞群較多在病雞中分離到，少見B、C、D亞群，E亞群為內(nèi)源性病毒，不具有致病性特征。J亞群病毒自Payne L N等［2］發(fā)現(xiàn)至今，該病在世界各國均有不同程度流行，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失［3］。我國多個省份都有ALV-J分離到的報道［4-8］，冷畢丹、張勝斌等［9-10］先后在廣西三黃雞、土雞等地方品種雞發(fā)現(xiàn)有ALV-J感染。國外報道在其他品系中發(fā)現(xiàn)有ALV-B和ALV-J的重組ALV［11］，在中國其他品種雞中也有ALV-A與ALV-J共感染的報道［12］，王桂軍、彭昊等［13-14］在廣西地方品種中發(fā)現(xiàn)有 MDV、ALV、REV等病毒的混合感染。而從廣西三黃雞雞群中分離到ALV-A和ALV-J共感染在國內(nèi)還屬首次。

為了解ALV在廣西雞群中的流行情況，本研究從同1只廣西臨床血管瘤型禽白血病三黃雞病雞分離到了2株毒株，并通過設(shè)計亞群特異性引物進行PCR確定分離到的是ALV-A與ALV-J兩個毒株，克隆了兩個毒株gp85基因，并與國內(nèi)外分離的毒株進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料及細胞 病料采自廣西容縣一個出現(xiàn)臨床血管瘤型禽白血病的三黃雞雞場送檢病雞；DF-1雞胚成纖維細胞由本實驗室保存。

1.1.2 試 劑 pMD18-T vector、大腸埃希菌DH5α、DNA Maker DL15 000、2×TapPCR mix，北京康為世紀公司產(chǎn)品；禽白血病病毒p27抗原試劑檢測試劑盒，Idexx公司產(chǎn)品；胎牛血清和DMEM，美國GIBCO公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病毒的增殖和前病毒DNA的提取 取發(fā)病病雞的病變肝臟、腳趾血管瘤組織，加入3倍病變組織體積的滅菌生理鹽水，研磨成漿凍融3次后離心取上清，經(jīng)0.22μm過濾器過濾后接種DF-1細胞進行病毒分離，9d后收集培養(yǎng)細胞及上清，按照DNA抽提試劑盒步驟說明提取前病毒DNA，置-20℃保存，作為PCR擴增用模板。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 參照文獻［15-16］分別設(shè)計合成A、J亞群特異性鑒定引物，用于擴增ALV-A 950bp以及 ALV-J 545bp特異性片段；A亞群gp85基因、J亞群gp85基因擴增序列引物，用于遺傳變異分析。引物由華大基因公司合成。引物序列名稱及序列以及目的片段大小見表1。

表1 A、J亞群鑒定以及擴增ALV-A env、ALV-J gp85基因所用引物Table 1 PrimerS for A，J subtype identification and amplification of ALV-A env，ALV-J gp85genes

1.2.3 病原鑒定 DF-1細胞接種病毒后培養(yǎng)9d取上清，用禽白血病病毒p27抗原試劑盒檢測禽白血病病毒p27抗原，驗證是否分離到禽白血病病毒。另以提取的前病毒DNA為模板，分別用鑒定引物P1／P2、H5／H7進行PCR擴增，反應(yīng)程序為：95℃5min；94℃30s，50℃45s，72℃1min 30s，35個循環(huán)；72℃5min；95℃5min，95 ℃ 30s，56 ℃45s，72℃1min 30s，35個循環(huán)；72℃5min。10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.4 gp85基因的擴增和測序 以提取的前病毒DNA為模板，分別用擴增引物P5／P6、P7／P8進行PCR擴增，反應(yīng)程序分別為：95℃5min；94℃45s，57 ℃ 45s，72 ℃ 1min，35 個 循 環(huán)；72 ℃5min。95℃ 5min；94 ℃ 40s，60 ℃ 30s，72 ℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行回收并與pMD18-T載體16℃連接2h后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，37℃培養(yǎng)2h后，涂板培養(yǎng)。過夜后挑取單個菌落擴大培養(yǎng)，菌液PCR鑒定陽性后送華大基因公司進行基因氨基酸的測序。

1.2.5 gp85氨基酸序列與其他參考株比較 利用DNA Star.Lasergene.7.1 等軟件對測序所得的gp85基因與GenBank中發(fā)表的不同亞群ALV的gp85氨基酸序列做同源性比較，根據(jù)同源性程度及系統(tǒng)進化樹進行同源性比較及遺傳變異分析。參考毒株見表2。

2 結(jié)果

2.1 禽白血病病毒p27抗原ELISA檢測結(jié)果

按照IDEXX公司禽白血病p27抗原ELISA檢測試劑盒說明書，對接種病料的實驗組和對照組DF-1成纖維細胞上清進行ALV-p27抗原檢測。結(jié)果表明，接種病料的DF-1成纖維細胞上清檢測結(jié)果為陽性，而對照組為陰性。

表2 用于gp85氨基酸序列比較所用不同亞群ALV的參考株Table 2 Reference ALV strains of different subgroups for comparison of gp85amino acid sequences

2.2 ALV-A、ALV-J特異性片段以及gp85基因擴增結(jié)果

以提取的DF-1細胞前病毒DNA模板，以P1／P2、H5／H7為引物，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，分別擴增出950bp、545bp的特異性片段（圖1），與預(yù)期片段大小相符，說明自送檢的同一只病雞同時分離到ALV-A、ALV-J，并命名為 HG01-A，HG01-J。以P3／P4、P5／P6為引物，進行g(shù)p85擴增，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示分別擴增出2 000bp、924bp的基因片段（圖2），與預(yù)期片段大小相符。再次說明自送檢的同一只病雞同時分離到ALV-A和ALV-J。

圖1 以H5／H7、P1／P2為引物的PCR擴增Fig.1 PCR amplifications with H5／H7，P1／P2primers

圖2 gp85，env基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of gp85and env genes

2.3 gp85基因測序與同源性分析

從ALV-A env基因序列中截取gp85片段命名為 ALV-A gp85，并分別把 ALV-A gp85、ALV-J gp85與GenBank登錄的ALV-A亞群7株毒株、ALV-J亞群7株gp85基因同源性分析。結(jié)果表明，ALV-A gp85與7株A亞群氨基酸同源性為85.8%～87.5%，與A亞群美國株MQNCSU同源性最高為87.5%，與法國株RSA同源性為86.9%。而ALV-J gp85與7株毒株核酸序列同源性為84.0%～93.8%，其中與廣東株XX2-08以及四川株SCSM01同源性最高為93.8%，與原型株同源性為90.2%（圖3、圖4）。

圖3 HG01-A gp85基因氨基酸序列同源性比較Fig.3 Comparison of amino acid sequence identity of HG01-A gp85gene

圖4 HG01-J gp85基因的氨基酸序列同源性比較Fig.4 Comparison of amino acid sequence identity of HG01-J gp85gene

2.4 序列進化分析

利用 DNA Star Lasergene.7.1軟件分析繪制遺傳進化樹（圖5、圖6）。系統(tǒng)進化樹表明，HG01-A與其他參考株處于不同的進化分支，說明他們之間的親緣關(guān)系較遠。HG01-J與四川株SCSM01處于同一個進化分支，說明他們之間的親緣關(guān)系較近，可能由同一株毒株變異而來。

圖5 HG01-A gp85基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis of amino acid of HG01-A gp85gene

圖6 HG01-J gp85基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree analysis of amino acid of HG01-J gp85gene

3 討論

禽白血病病毒（ALV）在雞群中普遍存在，能引起禽的各種造血細胞腫瘤性增生。作為引發(fā)雞群腫瘤的主要外源性亞群，A、J亞群在全國范圍內(nèi)對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失［17］。已有報道自來航雞中發(fā)現(xiàn)ALV-B和ALV-J的重組［11］；817肉雜雞肉瘤組織中同時分離出ALV-A、ALV-J亞群禽白血病病毒［12］。隨后，陸續(xù)有ALV-J與REV、MDV等共感染的報道。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)呈規(guī)?；s化發(fā)展，禽白血病的影響日益嚴重。

本研究利用DF-1成纖維細胞接種，成功自三黃雞分離到2株禽白血病病毒，經(jīng)過ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中的p27抗原以及特異性PCR擴增及gp85基因序列分析，確定在廣西首次自同一只臨床血管瘤型禽白血病的三黃雞分離到一株ALV-A，1株ALV-J。本文為進一步深入研究ALV-A亞群與ALV-J亞群共感染的機制提供了依據(jù)和參考，同時進一步完善了我國地方品種雞群中禽白血病的流行病學信息。

利用DNA Star軟件對 HG01-A gp85、HG01-J gp85基因分析，發(fā)現(xiàn)HG01-A gp85基因與國內(nèi)外已發(fā)表的7株ALV-A gp85基因的同源性為86.3%～87.8%，其中與A亞群美國株 MQNCSU同源性最高為87.5%，與A亞型經(jīng)典株法國株RSA同源性為86.9%。A亞群與參考株同源性存在較大差異，表明HG01-A gp85基因已經(jīng)發(fā)生了較大變異。系統(tǒng)進化樹表明HG01-A與其他參考株處于不同的進化分支，說明他們之間的親緣關(guān)系較遠。HG01-J gp85基因與7株參考株的同源性為84.0%～93.8%，其中與廣東株XX2-08以及四川株SCSM01同源性最高為93.8%，而與ALV-J亞群原型株HPRS103的同源性為90.2%。系統(tǒng)進化樹表明HG01-J與廣西株SCSM01處于同一個進化分支，說明他們之間的親緣關(guān)系較近。而HG01-A與HG01-J兩者是否發(fā)生基因重組還需要進一步證實。

HG01-A與HG01-J自同一只病雞分離到，說明在當?shù)仉u場中禽白血病病毒不是單一亞群存在，禽白血病的各亞群病毒在雞群內(nèi)、同一只雞體內(nèi)都可存在共感染。共感染加大了ALV的檢測難度，同時對養(yǎng)禽業(yè)也可能會帶來潛在的威脅。重組亞群ALV-J給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大損失，現(xiàn)在共感染現(xiàn)象越來越頻繁，共感染是否會帶來新的重組亞群，造成新的威脅，還有待于后續(xù)持續(xù)觀察研究。為了預(yù)防不同亞群共感染可能帶來的新的亞群病毒，以及新重組病毒可能帶來的影響，在我國開展ALV凈化工作，并制定更加完善可操作性強的凈化控制措施是必要的。

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