自制中藥復(fù)方片劑對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)

王 靜，蔣 萬，何生虎，李志紅，葛 松，郭澍強(qiáng)

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

母牛在產(chǎn)犢后，氣血虧損，生殖器官受到損傷，機(jī)體抵抗力減弱，消化機(jī)能降低，而乳腺機(jī)能卻在逐漸恢復(fù)，泌乳量逐日上升，體質(zhì)的恢復(fù)和泌乳之間的矛盾較為突出［1］，極易引起各種疾病，特別是在臨床上奶牛產(chǎn)后疾病較為常見，其發(fā)病率高、治愈率低。奶牛產(chǎn)后疾病包括奶牛產(chǎn)后癱瘓、胎衣不下、子宮內(nèi)翻及脫出、子宮內(nèi)膜炎、乳房炎等［2］。若不能及時(shí)進(jìn)行合理的診治，會(huì)直接影響奶牛的生產(chǎn)性能，降低奶牛繁殖能力和受胎率［3］，延續(xù)發(fā)情，奶牛胎間距延長(zhǎng)甚至?xí)?dǎo)致奶牛死亡［4］。因此，奶牛產(chǎn)后保健對(duì)奶牛業(yè)的發(fā)展具有極其重要的意義。

目前，有關(guān)奶牛產(chǎn)后疾病的治療，國(guó)內(nèi)外學(xué)者總結(jié)出了很多的治療方法，但存在諸多問題。奶牛產(chǎn)后疾病的治療主要是以抗生素療法為主，而長(zhǎng)期使用抗生素不僅會(huì)對(duì)奶牛機(jī)體產(chǎn)生許多副作用，損傷機(jī)體內(nèi)臟器官，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生和藥物殘留等問題，從而降低了抗生素的治療效果，且對(duì)食品安全及人和動(dòng)物健康都產(chǎn)生著不同程度的影響［5］，其經(jīng)濟(jì)效益也值得懷疑，并且某些抗生素還會(huì)使奶牛的免疫功能受到抑制，容易造成重復(fù)感染［6］?，F(xiàn)在越來越多的學(xué)者注重中草藥療法，對(duì)奶牛產(chǎn)后疾病的療效進(jìn)行各方面的研究，常用中藥制劑主要有散劑、湯劑、針劑、子宮灌注劑等劑型。本試驗(yàn)從中藥黃芪、當(dāng)歸、枸杞子、益母草、炙甘草等提取有效成分，研制出一種具有含藥量高，服用劑量小，使用方便，吸收快，能提高奶牛機(jī)體免疫力等特點(diǎn)的中藥復(fù)方口服片劑，從而達(dá)到預(yù)防奶牛產(chǎn)后疾病的作用。為了驗(yàn)證該中藥復(fù)方片劑的安全性，確定其中藥配方提取后制成的片劑的安全性，試驗(yàn)采用小鼠急性毒性試驗(yàn)方法測(cè)定小鼠半數(shù)致死量（LD50），對(duì)該復(fù)方中藥制劑進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)，為該藥在防治奶牛產(chǎn)后疾病中的臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR系小鼠160只，約7周齡，雌雄各半，體重18g～22g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)入。在通風(fēng)良好的情況下，飼養(yǎng)在室溫20℃～25℃的鼠籠中，觀察5d，預(yù)試驗(yàn)隨機(jī)分成5組，8只／組，其中1組小鼠為空白對(duì)照組；正式試驗(yàn)隨機(jī)分成10組，10只／組，其中1組為小鼠空白對(duì)照組。自由飲水及采食。試驗(yàn)前禁食12h～16h，給藥后4h內(nèi)禁食，但不禁水。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 復(fù)方中藥制劑由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院臨床獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室研制，復(fù)方中藥片是由50%的藥液和50%的不同輔料配比制備而成；本試驗(yàn)原藥采用黃芪、當(dāng)歸、枸杞子、靈芝、黨參、益母草等有效成分提取物，按一定濃度配制而成，1mL相當(dāng)于原藥物2g，經(jīng)除雜質(zhì)過濾后為紅棕色透明澄清液體。

1.1.3 試驗(yàn)器材 D228-1電子計(jì)數(shù)秤為上海高致精密儀器有限公司產(chǎn)品；1mL注射器；小鼠籠；小燒杯；外科器械等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠口服（灌胃）急性毒性預(yù)試驗(yàn) 選取30只ICR系小鼠，隨機(jī)分成5組，雌雄各半，6只／組，其中一組小鼠為空白對(duì)照組。試驗(yàn)組小鼠用12號(hào)灌胃針進(jìn)行灌服，灌服劑量分別為20 000、40 000、80 000、160 000mg／kg體重，給藥后籠邊觀察。先觀察30min，在給藥后的4h再觀察1次，以后每天早晚各觀察1次，連續(xù)觀察7d，對(duì)動(dòng)物的全身精神狀態(tài)觀察的主要內(nèi)容有被毛組織光滑度、眼角膜是否有血絲、紅腫現(xiàn)象、小鼠活動(dòng)是否有異常行為，以及小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等，并記錄各組小鼠死亡數(shù)和存活數(shù)，試驗(yàn)過程中對(duì)中毒死亡后的小鼠進(jìn)行剖檢，觀察小鼠各組織器官的變化。

1.2.2 小鼠腹腔注射急性毒性預(yù)試驗(yàn) 選取30只ICR系小鼠，隨機(jī)分成5組，雌雄各半，6只／組，其中一組小鼠為空白對(duì)照組，以2倍稀釋的藥物濃度，即各組劑量為10 000、20 000、40 000、80 000mg／kg體重腹腔注射小鼠，觀察時(shí)間及內(nèi)容同小鼠灌胃方法。根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)和存活數(shù)，確定出大致死亡濃度，即估計(jì)致死量（Dmin和Dmax）。當(dāng)出現(xiàn)LD100時(shí)，若前一組劑量不為L(zhǎng)D100時(shí)，則該劑量為Dmax；當(dāng)出現(xiàn)LD0時(shí)，若后一組劑量不為L(zhǎng)D0時(shí)，則該劑量為Dmin。腹腔注射后觀察小鼠中毒癥狀和死亡數(shù)量，根據(jù)公式i＝（logDmax-logDmin）／（n-1），計(jì)算出來組間距i值（i值即組間距，劑量的對(duì)數(shù)值等差分布，劑量成等比分布），根據(jù)Dmin和Dmax設(shè)計(jì)出正式試驗(yàn)各組的劑量分布，即D1＝Dmin，D2＝D1（1＋i）、D3＝D2（1＋i）、D4＝D3（1＋i）......D9＞Dmax，以此類推即可得到正式試驗(yàn)組各組的劑量值。

1.2.3 小鼠腹腔注射急性毒性正式試驗(yàn) 隨機(jī)抽取100只ICR系小鼠（18g～22g），雌雄各半，隨機(jī)分為10組，10只／組，其中1組小鼠為空白對(duì)照組。各組分別按照上述預(yù)試驗(yàn)計(jì)算出來結(jié)果，將自制的復(fù)方中藥液以不同濃度梯度劑量為準(zhǔn)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射給藥，按每只小鼠的體重計(jì)算給藥量（mg／kg體重），在給藥前18h和給藥后4h內(nèi)禁食，自由飲水，給藥后籠邊先觀察30min，在給藥后的4h再觀察1次，以后每天早晚各觀察1次，連續(xù)觀察7d，并記錄7d內(nèi)小鼠的各體征動(dòng)態(tài)、給藥前后體重變化、行為活動(dòng)及小鼠的死亡數(shù)。對(duì)中毒后的小鼠剖檢各組織器官的變化。按改良寇氏法計(jì)算出半數(shù)致死量［7］（LD50）。

2 結(jié)果

2.1 小鼠口服（灌胃）急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

用灌胃針灌服復(fù)方中藥提取液之后，在10min后觀察小鼠，大部分小鼠表現(xiàn)很興奮，個(gè)別小鼠蜷縮在角落，眼睛微閉，呼吸頻率加快，活動(dòng)量減少；用藥4h后觀察小鼠，注射20 000mg／kg劑量組的小鼠小鼠精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常，小鼠的采食量、飲水量、活動(dòng)均正常，并且小鼠被毛平整，反應(yīng)靈敏，與對(duì)照組相比較糞便形態(tài)無區(qū)別，但是尿液呈現(xiàn)黃色。18h后觀察40 000mg／kg劑量組的小鼠小鼠精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常，小鼠的采食量良好、飲水量、活動(dòng)均正常，小鼠被毛平整，反應(yīng)靈敏，但80 000mg／kg劑量組的各別小鼠被毛松弛，活動(dòng)懶散，有個(gè)別呈嗜睡狀態(tài)。42h后觀察，40 000mg／kg劑量組的小鼠死亡1只，80 000mg／kg劑量組的小鼠死亡3只，而160 000mg／kg劑量組的小鼠全部死亡，剖檢死亡后小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟腫大表面呈現(xiàn)紫紅色，切面呈暗紅色，質(zhì)地軟易碎，腎臟無明顯眼觀變化，預(yù)試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 小鼠口服注射急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The pre-experimental resullts of the injection oral acute toxicity in mice

由表1可知，預(yù)試驗(yàn)中估計(jì)致死量Dmin為40 000mg／kg，Dmax為80 000mg／kg，按照毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，LD50＞10 000mg／kg時(shí)藥物屬于無毒性物質(zhì)，而本試驗(yàn)的最小致死量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超于10 000mg／kg，說明復(fù)方中藥制劑對(duì)小鼠安全無毒。

2.2 小鼠腹腔注射急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠腹腔注射急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，預(yù)試驗(yàn)中估計(jì)致死量Dmin為10 000mg／kg，Dmax為80 000mg／kg。按寇氏法設(shè)計(jì)根據(jù)公式i＝（logDmax-logDmin）／（n-1），計(jì)算出來組間距i＝0.113，組間劑量比為1∶0.77，所以正式試驗(yàn)各組劑量，分別為10 000、12 970、16 822、21 818、28 297、36 703、47 604、61 742、80 079、103 862mg／kg體重。

表2 小鼠腹腔注射急性毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The pre-experimental resullts of acute toxicity in mice by intraperitoneal injection

2.2.2 小鼠腹腔注射急性毒性正式試驗(yàn)結(jié)果 腹腔注射復(fù)方中藥提取液制劑6min后，大部分小鼠表現(xiàn)出興奮不安，痙攣，縮成一團(tuán)，眼睛微閉，嗜睡，被毛粗亂，平滑肌松弛，呼吸急促，對(duì)外界刺激略微遲鈍，部分小鼠飲食飲水量少。用藥4h后觀察小鼠以上癥狀仍持續(xù)，注射10 000mg／kg～21 818mg／kg組個(gè)別小鼠有恢復(fù)跡象，有采食飲水行為；注射28 297mg／kg～47 604mg／kg組個(gè)別小鼠蜷縮在角落，被毛松散，呼吸頻率加快，活動(dòng)量減少；用藥8h后觀察小鼠，注射61 742mg／kg～80 079mg／kg組個(gè)別小鼠有瀕死跡象，呈極度嗜睡狀態(tài)，呼吸呈深度腹式呼吸，翻正反射遲鈍甚至消失，對(duì)外界刺激無反應(yīng)。18h后觀察注射10 000mg／kg～218 18mg／kg組的小鼠逐漸恢復(fù)，活躍程度不如空白對(duì)照組，采食量減少，尿液呈黃色，糞便形狀良好，但相比空白對(duì)照組顏色略黃且濕潤(rùn)。注射36 703mg／kg～61 742mg／kg組的小鼠被毛無光澤、松弛，活動(dòng)量少，平滑肌松弛，采食飲水量相對(duì)于對(duì)照組明顯減少，并有死亡跡象。其中，80 079mg／kg組的小鼠死亡只數(shù)為3只，解剖后小鼠肝臟腫大，顏色呈紫紅色，嘴角并有血跡現(xiàn)象。46h后觀察注射80 079mg／kg的小鼠全部死亡，除此之外，其他各組劑量的小鼠均有死亡；隨著劑量組劑量的增大，ICR小鼠的死亡率也是逐漸增加，臟器病變也隨之顯著，直到用藥后的108h后，存活的小鼠采食、飲水均正常，活動(dòng)自如，各項(xiàng)體征和各系統(tǒng)情況與對(duì)照組相比無差別。針對(duì)死亡小鼠剖解發(fā)現(xiàn)，小鼠肝脾臟腫大、被膜緊張、邊緣鈍圓，尤其以肝臟腫大最為明顯，顏色呈暗紫紅色，縱切面呈暗紅色，肝臟質(zhì)地變軟易碎，腸系膜略有充血現(xiàn)象，其他臟器未見有異常情況。各劑量組死亡統(tǒng)計(jì)表見表3。

表3 小鼠腹腔注射急性毒性正式試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The experimental results of acute toxicity in mice by intraperitoneal injection

結(jié)果表明，小鼠的最大耐受量LD0＝12 970mg／kg，最小致死量 MLD＝16 822mg／kg，根據(jù)改良寇氏法計(jì)算公式：LD50＝lg-1［Xm-i（∑P-0.5）］，式中Xm為最大劑量的對(duì)數(shù)，P為各組動(dòng)物的死亡率，∑P為各組動(dòng)物死亡率總和，i為組間距（相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值），根據(jù)表3計(jì)算出LD50＝42 884mg／kg。 根據(jù)公式 Slog LD50＝式中d為對(duì)數(shù)組距，p為各組死亡率，n為每組動(dòng)物數(shù)，得出標(biāo)準(zhǔn)誤Slog LD50＝0.039 7，LD50的 95% 的可信限范圍 為35 222.77mg／kg～50 545.23mg／kg。根據(jù)毒理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，LD50＞10 000mg／kg屬于無毒性物質(zhì)，本試驗(yàn)中復(fù)方中藥片對(duì)小鼠安全無毒。各組小鼠用藥前后體重變化情況見表4（1組為空白對(duì)照組，2組～10組為試驗(yàn)組）。

表4 小鼠腹腔注射急性毒性試驗(yàn)給藥前后體重變化情況Table 4 Weight changes before and after intraperitoneal injection in acute toxicity test in mice

由表4可知，1組為對(duì)照組，小鼠體重明顯增加，2組～3組在給藥前后小鼠的體重變化明顯，在小鼠一切行為活動(dòng)恢復(fù)正常的同時(shí)，且小鼠的體重較給藥前有所增加；4組～10組在給藥前后小鼠的體重明顯減輕，并且隨著劑量的增加，小鼠給藥前后的體重減輕趨勢(shì)也愈加明顯。

3 討論

現(xiàn)在越來越多的學(xué)者注重采用中草藥療法對(duì)奶牛產(chǎn)后疾病的效果研究。從中醫(yī)學(xué)的角度來看［8］，奶牛產(chǎn)后疾病主要在由于氣血不暢或者氣血不足而引起的，經(jīng)產(chǎn)奶牛大多氣虛血虛，中氣不足，或有中氣下陷，導(dǎo)致外感風(fēng)寒風(fēng)熱，會(huì)繼發(fā)各種產(chǎn)科疾病，使得脾胃虛弱，導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低。中藥具有清熱解毒、抑菌消炎、活血化淤、收斂止血、改善血液循環(huán)、增強(qiáng)子宮收縮［9］，以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效［10］，并且藥物殘留低，無毒、刺激性低，并兼有藥物與營(yíng)養(yǎng)劑的雙重功效。本試驗(yàn)用的復(fù)方中藥制劑，原藥主要是黃芪、當(dāng)歸、枸杞子、靈芝、黨參、益母草等有效成分提取物，按一定濃度配制而成，具有抑菌消炎、改善微循環(huán)、增加機(jī)體免疫力，提高機(jī)體非特異和特異性免疫的功能和興奮子宮等的作用。中草藥在臨床中的應(yīng)用，首先要保證安全可靠，而急性毒性試驗(yàn)是藥物安全性評(píng)價(jià)的重要環(huán)節(jié)，是任何一類新藥都不可缺少的試驗(yàn)項(xiàng)目之一，其試驗(yàn)結(jié)果將為藥物后續(xù)的毒理學(xué)試驗(yàn)和藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供可靠的依據(jù)。

3.1 關(guān)于藥物毒性

根據(jù)中草藥制劑的有關(guān)規(guī)定［11］，每種中藥在兩部以上古籍中記載無毒，便視為無毒性作用，該配方中的單味中藥在文獻(xiàn)《本草》、《別目》、《本草綱目》均未見有毒性記載，說明選取的藥物安全可靠。

因藥物與毒物之間并不存在絕對(duì)的界限，而只能根據(jù)動(dòng)物中毒劑量的大小做相對(duì)比較。若劑量過大，會(huì)引起動(dòng)物中毒，用量適當(dāng)對(duì)疾病起到一定的良好療效。本試驗(yàn)對(duì)復(fù)方中藥制劑進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)。口服給藥時(shí)，劑量達(dá)到40 000mg／kg體重與對(duì)照組差異不顯著，且無不良臨床癥狀和死亡。按照藥物學(xué)急性毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)［12］，在小鼠急性毒性口服試驗(yàn)中，口服劑量＞10 000mg／kg體重，在觀察108 h后，小鼠健活，則認(rèn)為該藥物安全無毒，由此可證實(shí)本試驗(yàn)Dmin＝40 000mg／kg復(fù)方中藥制劑對(duì)小鼠安全無毒。而腹腔注射后，由于小鼠腹腔面積相對(duì)較大，藥物直接以原型的形式進(jìn)入血液循環(huán)［11］，其吸收幾乎不受吸收部位的影響，并且藥物的毒性也不會(huì)被機(jī)體的消化酶等降解。因此本試驗(yàn)中小鼠會(huì)因注射劑量的增大，其死亡率也會(huì)隨之增大，中毒癥狀也愈加明顯，肝、腎臟的病理變化也隨著劑量的增大而增強(qiáng)，這與牛建榮等報(bào)道的一致［13］。

3.2 關(guān)于急性毒性試驗(yàn)小鼠給藥體積及前后體重變化

在急性毒性試驗(yàn)中給藥體積的也是非常重要的。嚙齒類動(dòng)物口服給藥和腹腔注射的最大體積對(duì)水溶性或混懸液一般不超過20mL／kg，小鼠腹腔的最大容積應(yīng)不超過50mL／kg［14］。因此對(duì)給藥體積較大的不便一次給完的應(yīng)將給藥劑量等量分配，每隔6h～8h給藥一次，在24h內(nèi)給完。根據(jù)藥物毒理學(xué)急性毒性試驗(yàn)相關(guān)規(guī)定，此種給藥方法安全可行，符合藥物毒理學(xué)研究規(guī)定，基本不影響試驗(yàn)效果。

在急性毒性試驗(yàn)前、中、后（包括試驗(yàn)中死亡動(dòng)物）應(yīng)各稱取體重一次，以觀察給藥后的變化。一般認(rèn)為在保持動(dòng)物正常飲食及生長(zhǎng)環(huán)境的條件下，出現(xiàn)體重下降應(yīng)看做是藥物毒效應(yīng)的一種表現(xiàn)。而引起動(dòng)物體重減輕的原因比較復(fù)雜，譬如藥物引起腹瀉而影響動(dòng)物食欲，從而進(jìn)一步影響了食物的吸收和被利用，或?qū)C(jī)體消化機(jī)能造成障礙而引起動(dòng)物厭食或絕食、絕飲，造成腎功能及其他組織臟器的急性損傷，都可能會(huì)使動(dòng)物體重下降。本試驗(yàn)小鼠的體重隨藥物劑量的增加而出現(xiàn)減輕的趨勢(shì)，在剖檢后發(fā)現(xiàn)藥物毒性作用于肝臟、腎臟變化較為明顯，可認(rèn)為小鼠的體重減輕可能與肝臟、腎臟的損傷有關(guān)。

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