H3N2亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測(cè)方法的建立

劉婷婷，謝芝勛，宋德貴＊，羅思思，謝麗基，李 孟，謝志勤，鄧顯文

（1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541000；2.廣西獸醫(yī)研究所畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是危害禽類養(yǎng)殖的一類重要傳染病，其病原禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為單股負(fù)鏈的RNA病毒，分8個(gè)節(jié)段，分別編碼 HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白［1］。在AIV 8個(gè)基因片段中，M基因是最保守的基因片段，所有亞型AIV的PCR檢測(cè)均選擇M基因作為靶基因。HA、NA是變異最大的兩個(gè)基因節(jié)段，兩者之間存在的某種平衡對(duì)病毒的致病性有很大關(guān)系［2］。根據(jù)HA、NA基因抗原性差異，AIV可進(jìn)一步分為不同的亞型，目前已鑒別出18種HA（H1-H18）亞型和11種NA（N1-N11）亞型［3-4］。H3亞型AIV屬于低致病性AIV，其在低致病性AIV中占有較重要地位［5］。研究表明，H3亞型AIV在家禽中分離率較高，且在不同家禽中分布的季節(jié)性與我國(guó)人群中流感流行的季節(jié)性比較一致［6-8］，這就為兩種宿主的流感病毒在豬這個(gè)“混合器”中發(fā)生基因重排提供了條件。1968年暴發(fā)的香港流感病毒 A／HongKong／68（H3N2）經(jīng)研究推測(cè)是由H3亞型AIV與H2N2亞型人流感病毒在豬體內(nèi)發(fā)生基因重排而產(chǎn)生的［9-10］。此外，N2亞型（H9N2）AIV是感染家禽并能致病的常見NA亞型，其可與大多數(shù)HA亞型AIV組合形成不同血清型的AIV。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)AIV且能同時(shí)鑒別H3N2亞型AIV的方法對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生都有重要意義。

長(zhǎng)期以來，針對(duì)AIV的檢測(cè)主要依靠傳統(tǒng)的病原分離鑒定與血清學(xué)試驗(yàn)，這些方法耗時(shí)較長(zhǎng)，給診斷帶來了一定的局限性。隨著分子生物學(xué)和生物試劑的不斷發(fā)展，PCR（RT-PCR）檢測(cè)方法已成為病毒檢測(cè)的重要部分。而多重RT-PCR以其同一反應(yīng)中可同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸片段的優(yōu)勢(shì)已應(yīng)用于多種病毒和基因的同時(shí)檢測(cè)［11-15］。目前專門針對(duì)H3N2亞型AIV的PCR檢測(cè)方法未見報(bào)道，本研究根據(jù)AIV最保守的M基因和H3、N2亞型AIV HA、NA基因保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，建立了可以檢測(cè)AIV且能同時(shí)進(jìn)行H3、N2亞型AIV分型檢測(cè)的三重RT-PCR方法，旨在為AIV的檢測(cè)提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒 株 H1N1 、H1N2、H3N6 、H3N8、H4N2、H4N6、H6N1 、H6N2、H6N6、H9N2亞型AIV及6株H3N2亞型AIV分離株由廣西獸醫(yī)研究所畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存；H5N2、H7N2亞型AIV RNA為美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研究室惠贈(zèng)；新城疫病毒 （NDV）F48E9株、傳染性支氣管炎病毒（IBV）H52株、傳染性喉氣管炎病毒 （ILTV）北京株、雞毒支原體 （MG）S6株及禽呼腸病毒（ARV）S1733株由廣西獸醫(yī)研究所畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 試劑 DNA／RNA抽提試劑盒、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、5×AMV buffer、dNTP和RNA酶抑制劑為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master MIX為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.3 其他 SPF雞胚為北京梅里亞公司產(chǎn)品；DU 800紫外分光光度計(jì)為Beckman Coulter公司產(chǎn)品；PCR儀為Biometra公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中 H3、N2亞型AIV HA、NA基因序列及AIV M基因序列，用DNA Star進(jìn)行比對(duì)，篩選出保守序列，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，并通過Blast驗(yàn)證。引物由Invitrogen公司合成（表1）。

表1 引物序列信息Table 1 Nucleotide sequences of H3and N2primers

1.2.2 病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄 參照DNA／RNA抽提試劑盒使用說明書抽提AIV、NDV、ARV和IBV RNA及ILTV和 MG的DNA，AIV用流感病毒12堿基反轉(zhuǎn)錄通用引物（序列為5′-AGCAAAAGCAGG-3′），NDV、ARV 和IBV 用隨機(jī)引物，將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 采用25.0μL反應(yīng)體系：12.5μL 2×PCR Master Mix、2μL cDNA、引物 H3-F、H3-R、N2-F、N2-R、M-F、M-R（25pmol／μL）各加入0.1μL～0.5μL 5個(gè)梯度進(jìn)行引物濃度優(yōu)化，最后加水至25μL。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)PCR退火溫度、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)程序。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化后的三重RT-PCR反應(yīng)體系及程序，分別以各亞型AIV及NDV、IBV、ILTV、MG和ARV的cDNA（DNA）為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用15g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其特異性。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 利用Beckman UV800紫外分光光度計(jì)測(cè)定H3N2亞型AIV RNA濃度，并進(jìn)行10倍倍比稀釋后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以不同濃度cDNA為模板，利用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其敏感性。

1.2.6 臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用所建立的三重RTPCR方法，對(duì)96份從廣西南寧市活禽市場(chǎng)采集的口腔和糞便拭子樣品進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品重復(fù)3次。同時(shí)對(duì)這96份樣品進(jìn)行抗生素處理后，用雞胚法分離病毒，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 三重PCR條件的優(yōu)化

通過對(duì)H3、N2亞型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因3對(duì)引物濃度及退火溫度等條件的優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系25μL包括：2×PCR Master Mix 12.5μL，H3亞型 AIV HA 基因、N2亞型AIV NA基因及AIV M基因上、下游引物（25pmol／μL）均為0.5μL，模板cDNA 2μL，加水補(bǔ)足25μL。反應(yīng)模式為：94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；然后再72℃延伸10min，最后4℃結(jié)束反應(yīng)。利用上述條件擴(kuò)增H3、N2及H3N2亞型AIV核苷酸，結(jié)果顯示均得到與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的擴(kuò)增條帶（圖1）。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，H3N2亞型AIV可擴(kuò)增出3條特異性條帶，分別為518、418、271bp；H3N6和H3N8亞型AIV均有2條特異性條帶出現(xiàn)，片段大小分別為271bp、518bp；H1N2、H4N2、H5N2、H 6N2、H7N2和H9N2亞型AIV均有2條特異性條帶出現(xiàn)，片段大小為418bp、518bp；其他亞型AIV可擴(kuò)增出1條特異性條帶，片段大小為518bp；常見禽病病原體均未擴(kuò)增出任何條帶（圖2），說明該方法有較好的特異性。

圖1 三重RT-PCR體系與條件優(yōu)化后擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of triplex RT-PCR

圖2 三重RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity results of triplex RT-PCR

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

利用本研究?jī)?yōu)化好的三重RT-PCR反應(yīng)條件，對(duì)濃度為100ng～100fg的H3N2亞型AIV cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，對(duì)濃度為100ng～100pg的 H3N2亞型AIV cDNA均有3條明顯的擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，片段大小分別為271、418、518bp，對(duì)濃度為10pg～100fg的H3N2亞型AIV cDNA無擴(kuò)增條帶。因此，該三重RT-PCR方法最低能檢測(cè)到100pg的H3N2亞型AIV cDNA。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

在廣西南寧市活禽市場(chǎng)96份樣品中，三重RTPCR檢測(cè)結(jié)果有4份呈現(xiàn)H3N2亞型AIV陽(yáng)性，1份為H3亞型AIV陽(yáng)性，17份為N2亞型AIV陽(yáng)性，與病毒分離鑒定結(jié)果一致。圖4為部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果。

圖3 三重RT-PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivity results of triplex RT-PCR

圖4 部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The detection results of clinical samples by triplex RT-PCR

3 討論

AIV在自然界中是廣泛存在的，不僅感染禽類，在豬、馬、人等哺乳動(dòng)物體內(nèi)也可以分離到。野生水禽被認(rèn)為是AIV的天然儲(chǔ)存庫(kù)，可感染所有亞型的AIV。被感染的野生水禽通過糞便將病毒排出體外，污染水系和周邊環(huán)境，后經(jīng)直接接觸或候鳥南北遷移進(jìn)一步將病毒擴(kuò)散［3，16］。AIV是分節(jié)段的病毒，由于聚合酶保真性低，其基因組變異率很高，當(dāng)同一宿主同時(shí)感染多種亞型的AIV，不同毒株間可能會(huì)發(fā)生基因片段的重排，產(chǎn)生新的AIV亞型的病毒。H3N2亞型AIV是低致病性禽流感中較常見亞型之一，在豬流感、人流感中H3N2亞型流感都為較常見流行的亞型之一，3種不同宿主的H3N2亞型流感病毒極可能在豬這個(gè)“混合器”中發(fā)生基因重排，致使H3N2亞型AIV獲得直接感染人的能力。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)AIV且能同時(shí)鑒別H3N2亞型AIV的方法顯得十分重要。

多重RT-PCR是一種特殊的PCR形式，其特點(diǎn)是在同一PCR反應(yīng)中加入2對(duì)或2對(duì)以上引物可同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸片段，節(jié)約了試劑，簡(jiǎn)化了程序，加快了檢測(cè)診斷速度，因此，多重RT-PCR方法在臨床多種病原混合感染的鑒別診斷上具有很高的實(shí)用價(jià)值。本研究針對(duì)AIV最保守的M基因和H3、N2亞型AIV HA、NA基因保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，建立了可以檢測(cè)AIV且能同時(shí)進(jìn)行H3、N2亞型AIV分型檢測(cè)的三重RT-PCR，特異性結(jié)果顯示，該多重RT-PCR對(duì)H3N2亞型AIV可同時(shí)擴(kuò)增出3條特異性條帶，分別為518bp的M基因條帶、418bp的NA基因條帶、271bp的HA基因條帶；H3亞型和N2亞型AIV均可擴(kuò)增出2條特異性條帶，分別為518bp、271bp和518bp、418bp；其他亞型AIV只能擴(kuò)增出1條大小為518bp的M基因條帶，而常見禽病病原體均未擴(kuò)增出任何條帶，表明本研究建立的多重RT-PCR方法具有較好的特異性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該法最低能檢測(cè)到100pg的H3N2亞型AIV cDNA。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致，證明了該法的有效性和實(shí)用性。因此，本研究建立的AIV H3N2亞型和M基因三重RT-PCR是一種簡(jiǎn)便、快速、有效的檢測(cè)技術(shù)，具有較好的應(yīng)用前景。

［1］彭 宜，謝芝勛，郭 捷，等.利用RT-LAMP可視化檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)H1亞型禽流感病毒及N1、N2亞型的分型［J］.病毒學(xué)報(bào)，2013，29（3）：154-161.

［2］Castrucci M R，Kawaoka Y.Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus［J］.Virology，1993，67（2）：759-764.

［3］Wu Y，Wu Y，Tefsen B，et al.Bat-derived influenza-like viruses H17N10and H18N11［J］.Trends Microbiol，2014，22（4）：183-191.

［4］Tong S，Zhu X，Li Y，et al.New world bats harbor diverse influenza A viruses［J］.PLoS Pathog，2013，9（10）：e1003657.

［5］Peng Y，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay［J］.Virol J，2011，8：337.

［6］趙 國(guó)，劉曉文，錢忠明，等.2002-2009年中國(guó)華東地區(qū)家禽低致病性禽流感的病原學(xué)檢測(cè)與分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（1）：153-159.

［7］Peng Y，Xie Z，Liu J，et al.Epidemiological surveillance of low pathogenic avian influenza virus（LPAIV）from poultry in Guangxi province，southern China［J］.PLoS One，2013，8（10）：1-6.

［8］彭 宜，張 偉 ，薛 峰，等.2006-2008年華東地區(qū)家禽不同HA亞型低致病性禽流感的病原學(xué)監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（2）119-121.

［9］Gething M J，Bye J，Skehel J，et al.Cloning and DNA sequence of double-stranded copies of hemagglutinin genes from H2and H3strains elucidates antigenic shift and drift in human influenza virus［J］.Nature，1980，287：301-306.

［10］殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997：708-709.

［11］Xie Z，Pang Y S，Liu J，et al.A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiation of avian H5，H7，and H9hemagglutinin subtype［J］.Mol Cell Probes，2006，20（3-4）：245-249.

［12］謝芝勛，謝麗基，劉加波，等.禽流感和新城疫病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法的建立［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19（3）：410-413.

［13］龐耀珊，謝芝勛，鄧顯文，等.多重RT-PCR快速檢測(cè)鑒別H7亞型禽流感病毒方法的建立［J］.中國(guó)人獸共患病雜志，2005（7）：33-40.

［14］羅思思，謝芝勛，劉加波，等.H7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：1-5.

［15］郭 捷，謝芝勛，彭 宜，等.H1和H3亞型禽流感病毒二重PCR檢測(cè)方法的建立［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：31-34.

［16］馬寅生，王永強(qiáng)，李 翔，等.禽流感跨種間傳播的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（12）：62-64.