金納米顆粒在食品抗氧化能力評(píng)價(jià)中的檢測(cè)應(yīng)用

馬滔+馬小媛+王周平

摘要：選取沒(méi)食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸5種酚酸化合物和康師傅東方樹(shù)葉、農(nóng)夫山泉水溶C100這2種茶飲料作為還原劑，誘導(dǎo)金納米顆粒的生長(zhǎng)，并利用分光光度計(jì)測(cè)定所形成金納米顆粒的吸光度，以評(píng)價(jià)各試驗(yàn)物質(zhì)的抗氧化能力。結(jié)果表明，5種酚酸化合物抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次為沒(méi)食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸;2種茶飲料抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次為農(nóng)夫山泉水溶C100>康師傅東方樹(shù)葉綠茶。通過(guò)與傳統(tǒng)清除2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH·）水平以評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法相比，基于金納米材料檢測(cè)抗氧化劑抗氧化能力的方法準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)迅速，值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：金納米顆粒;抗氧化能力;酚酸化合物;DPPH·

中圖分類(lèi)號(hào)： TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0282-04

收稿日期：2014-05-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21375049）;國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012BAK08B01）;江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2012614）。

作者簡(jiǎn)介：馬 滔（1992—），女，陜西寶雞人，從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail：ch_matao@163.com。

通信作者：馬小媛（1983—），女，江蘇南京人，博士，副教授，從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail：maxy@jiangnan.edu.cn。

生物體系中的氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，具有抗氧化能力的物質(zhì)能有效抵御氧化應(yīng)激的有害損傷。食品中的抗氧化劑日益引起人們的關(guān)注，對(duì)飲食中潛在的抗氧化劑及其抗氧化能力實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、可靠、快速的檢測(cè)變得尤為重要。傳統(tǒng)的抗氧化能力檢測(cè)方法主要包括清除生物體內(nèi)活性氧/活性氮自由基、清除非生物體內(nèi)穩(wěn)定自由基和總還原能力檢測(cè)等，如檢測(cè)ROO·、H2O2、ONOO—清除能力等[1-4]，這些檢測(cè)方法大多基于化學(xué)試劑和化學(xué)反應(yīng)，在實(shí)際應(yīng)用中存在危害人體健康、破壞生態(tài)環(huán)境等問(wèn)題而受到諸多限制。隨著納米科技的興起與發(fā)展，納米材料以其特有的物理、化學(xué)性質(zhì)在生物學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，納米材料應(yīng)用于食品功能評(píng)價(jià)正快速發(fā)展。Jiang等利用硒化鎘量子點(diǎn)（CdSe QDs）的電化學(xué)發(fā)光效應(yīng)研發(fā)出一種檢測(cè)HO·清除能力的方法[5];Kim等于2005年提出一種利用包埋有辣根過(guò)氧化物酶的聚合物小球評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的光學(xué)納米傳感方法[6]。

酚酸是非常重要的天然抗氧化劑，屬苯丙素類(lèi)化合物，多為對(duì)羥基苯甲酸和對(duì)羥基苯丙烯酸（肉桂酸）的衍生物，如沒(méi)食子酸（C7H6O5）、咖啡酸（C9H8O4）、原兒茶酸（C7H6O）、阿魏酸（C10H10O4）、香草酸（C8H8O4）等，廣泛存在于植物體內(nèi)。研究表明，酚酸類(lèi)成分具有抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌保肝等多種生物活性。Soobrattee等采用Trolox等價(jià)抗氧化能力、鐵離子還原抗氧化及次氯酸鹽清除能力等抗氧化測(cè)定體系，對(duì)酚酸的抗氧化進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果表明，酚酸具有較強(qiáng)的抗氧化能力，是良好的抗氧化劑;對(duì)活性氧自由基具有清除作用，可用DPPH·法定性測(cè)定不同酚酸的抗氧化性能力[7]。

本研究采用沒(méi)食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸等系列酚酸化合物及東方樹(shù)葉綠茶、水溶C100這2種茶飲料誘導(dǎo)金納米生長(zhǎng)，利用金納米顆粒獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生規(guī)律性變化的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收峰，根據(jù)吸收峰的變化來(lái)比較酚酸化合物及茶飲料的抗氧化能力，并與傳統(tǒng)的清除DPPH·自由基檢測(cè)方法進(jìn)行較，以期建立一種基于金納米材料檢測(cè)抗氧化劑抗氧化能力的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

UV-1800PC分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn);DK-S22電熱恒溫水浴鍋;BS124S分析天平;透射電子顯微鏡（TEM）。

1.2 試劑與材料

沒(méi)食子酸、咖啡酸、原兒茶酸、阿魏酸、香草酸、十六烷基三甲基溴化銨（C19H42NBr）、氯金酸（HAuCl4）、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7）、水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、維生素C（C6H8O6）、2，2-二苯基-1-苦基肼自由基（DPPH·），均購(gòu)于阿拉丁試劑公司;康師傅東方樹(shù)葉綠茶、農(nóng)夫山泉水溶C100，均購(gòu)于大型超市。

1.3 維生素C還原納米金顆粒標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)量測(cè)定

1.3.1 試驗(yàn)原理 維生素C（圖1）能抗壞血病，廣泛存在于新鮮水果蔬菜及許多生物中，作為一種高活性物質(zhì)參與新陳代謝過(guò)程，是一種強(qiáng)抗氧化劑，能還原Au（Ⅲ）形成金納米顆粒。由于金納米顆粒大小及形貌的變化，使其局域表面等離激元共振吸收峰產(chǎn)生規(guī)律性變化。因此，可以選擇維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)樣劑，并作為當(dāng)量與其他物質(zhì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.3.2 試驗(yàn)步驟 準(zhǔn)確稱(chēng)取維生素C標(biāo)準(zhǔn)品17.612 g，溶解定容至100 mL，搖勻，配制成1 mol/L維生素C標(biāo)準(zhǔn)液;將標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成0.000 1、0.001、0.01、0.1、1 mol/L的樣液，分別取0.5 mL樣液，加入到含有100 μL 10 mmol/L AuCl-4、600 μL 3.7 mmol/L CTAB、300 μL 0.2 mmol/L檸檬酸鈉、3.5 mL 0.12 mol/L pH值為 8.0磷酸緩沖液中， 混勻; 45 ℃

水浴10 min，取出，放至室溫，均質(zhì)后測(cè)定350～700 nm 的紫外吸收光度。

1.4 酚酸類(lèi)化合物還原納米金顆粒

1.4.1 試驗(yàn)原理 酚酸化合物（圖2）由于苯環(huán)上酚羥基的還原性，在溶液中不需要金種子的催化即能還原Au（Ⅲ）形成金納米顆粒，其光學(xué)吸收強(qiáng)度與酚酸類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力呈正相關(guān)[8]。endprint

1.4.2 試驗(yàn)步驟 把100 μL 10 mmol/L HAuCl4、600 μL 3.7 mmol/L CTAB和300 μL 0.2 mmol/L檸檬酸鈉連續(xù)加入到3.5 mL 0.12 mol/L 磷酸緩沖液（pH值為 8.0）中，混勻;取0.5 mL 0.01 mol/L試驗(yàn)樣品加入混合液中，45 ℃ 水浴 10 min;將混合物迅速移出，冷卻至室溫，均質(zhì)后測(cè)定350～700 nm的紫外吸光度[9]。以0.5 mL超純水代替0.5 mL待測(cè)樣品作為對(duì)照。

1.5 DPPH·自由基法測(cè)定酚酸類(lèi)物質(zhì)抗氧化性

1.5.1 試驗(yàn)原理 DPPH·是一種商業(yè)化的非常穩(wěn)定的自由基，含苯環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3），其乙醇溶液顯紫色，在515 nm處有強(qiáng)烈的光學(xué)吸收，且吸收峰位置相對(duì)穩(wěn)定?？寡趸瘎┦且环N常見(jiàn)的自由基清除劑，清除能力基于抗氧化劑結(jié)構(gòu)上的特性，包括羥基中O—H 鍵解離能、抗氧化劑失去電子形成苯氧自由基的鍵共振解離能及芳環(huán)上取代基團(tuán)的空間位阻效應(yīng)。清除化學(xué)反應(yīng)的方程式為：DPPH·+PheOH→DPPHH+[PheO（Ⅰ）、PhO（Ⅱ）、PhO（Ⅲ）…]，其中，（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）為不同的共振結(jié)構(gòu)，并基于以下理論終止反應(yīng)：DPPH·+DPPH·→DPPH-DPPH、DPPH·+PheO·→DPPH-PheO、PheO·+PheO·→PheO-PheO，從而決定各種抗氧化劑清除 DPPH·水平的大小[10]。

1.5.2 試驗(yàn)步驟 稱(chēng)取0.004 g DPPH·溶于100 mL無(wú)水乙醇中，得0.101 4 mmol/L的DPPH·乙醇溶液;分別取 0.05 mL 不同濃度的抗氧化劑待測(cè)物乙醇溶液加入到 3.95 mL 0.101 4 mmol/L DPPH·乙醇溶液中，用分光光度計(jì)每隔一段時(shí)間檢測(cè)其UV-vis-NIR吸收光譜并記錄，直到反應(yīng)液的吸光度保持相對(duì)穩(wěn)定、不再變化為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度維生素C誘導(dǎo)金納米顆粒的生長(zhǎng)

由圖4可見(jiàn)，不同濃度維生素C與氯金酸反應(yīng)后，在500～600 nm處出現(xiàn)強(qiáng)烈的吸收峰，并且隨著濃度的增加，吸收峰強(qiáng)度越來(lái)越高，這說(shuō)明維生素C的抗氧化性能力與吸收峰的峰值有相關(guān)性。維生素C具有較強(qiáng)的還原性，會(huì)誘導(dǎo)氯金酸溶液生成金納米顆粒，并產(chǎn)生特殊光學(xué)效應(yīng)。因待測(cè)液濃度均為0.01 mol/L，所以選擇0.01 mol/L，此時(shí)維生素C誘導(dǎo)生成金納米顆粒的最大吸光度作為標(biāo)準(zhǔn)單位，與其他待測(cè)液進(jìn)行比較（圖5）。

2.2 不同酚酸化合物誘導(dǎo)納米金的生長(zhǎng)

由圖6可以看出，5種酚酸中，沒(méi)食子酸紫外吸收峰強(qiáng)度最大，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)溶液顏色也最深，呈深紫紅色，其后依次為咖啡酸、原兒茶酸、香草酸和阿魏酸。在弱堿介質(zhì)下，酚酸形成的相應(yīng)苯氧自由基的親核性會(huì)影響酚酸抗氧化能力，并通過(guò)共振或分子內(nèi)氫鍵而穩(wěn)定。羧酸基團(tuán)是常見(jiàn)的吸電子基團(tuán)，能通過(guò)降低芳香環(huán)的電子密度來(lái)穩(wěn)定苯氧自由基;

—CHCH—COOH 連接在苯環(huán)上，通過(guò)共振提高苯氧自由

基的穩(wěn)定性而提高供氫能力[11]。根據(jù)5種酚酸化合物的結(jié)構(gòu)式可知，沒(méi)食子含有3個(gè)酚羥基和1個(gè)羧基，其失電子后結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定;咖啡酸含2個(gè)酚羥基和1個(gè)—CHCH—COOH，原兒茶酸含2個(gè)酚羥基和1個(gè)羧基，其酚羥基數(shù)量均比沒(méi)食子酸少，則失氫能力弱于沒(méi)食子酸;香草酸和阿魏酸都只含有1個(gè)酚羥基，還原性最弱。把5種酚酸物質(zhì)的最大吸光度與 0.01 mol/L 的維生素C進(jìn)行比對(duì)，沒(méi)食子酸相當(dāng)于1.12倍維生素C，咖啡酸相當(dāng)于0.76倍維生素C，香草酸相當(dāng)于0456倍維生素C，阿魏酸相當(dāng)于0.313倍維生素C。

由圖8可見(jiàn)，沒(méi)食子酸還原出的金納米顆粒最多，其次是原兒茶酸，最后是阿魏酸。結(jié)合5種酚酸物質(zhì)誘導(dǎo)金納米顆粒的紫外光譜及結(jié)構(gòu)分析，可知5種酚酸物質(zhì)的抗氧化性能依次為：沒(méi)食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸。

2.3 酚酸化合物對(duì)DPPH·清除能力的評(píng)價(jià)

由圖9、圖10可見(jiàn)，加入抗氧化待測(cè)物后的最初幾分鐘內(nèi)，峰強(qiáng)度迅速降低，峰位置不變，這表明反應(yīng)體系內(nèi) DPPH· 被部分清除，并且清除速率較快;隨著反應(yīng)的繼續(xù)進(jìn)行，峰強(qiáng)度降低的速率逐漸減慢，并保持相對(duì)穩(wěn)定的水平。

以加入反應(yīng)體系的抗氧化劑與DPPH·的相對(duì)量（摩爾比）為橫坐標(biāo)，以不同濃度抗氧化劑清除DPPH·后反應(yīng)體系內(nèi)的剩余DPPH·量作為縱坐標(biāo)作曲線(xiàn)（圖11-A）;同樣，以加入反應(yīng)體系的抗氧化劑與DPPH·的相對(duì)量（摩爾比）為橫坐標(biāo)，以不同濃度抗氧化劑清除DPPH·后反應(yīng)體系達(dá)到穩(wěn)定水平所需要的時(shí)間作為縱坐標(biāo)作曲線(xiàn)（圖11-B）。取剩余量為50%時(shí)的濃度為IC50值，將抗氧化劑濃度為 IC50值時(shí)所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間定義為T(mén)IC50，將DPPH·的清除能力定義為AE=1/（IC50TIC50）。AE和1/IC50可反映抗氧化劑清除DPPH·的能力，數(shù)值大小反映酚酸化合物清除DPPH·能力的強(qiáng)弱。

由表1可見(jiàn)， 沒(méi)食子酸清除的DPPH·能力最強(qiáng)，其次是咖啡酸、原兒茶酸、水溶C100、東方樹(shù)葉綠茶、香草酸，阿魏酸最弱。對(duì)DPPH·自由基清除能力的檢測(cè)作為一種傳統(tǒng)的抗氧化能力檢測(cè)法，被廣泛用于各種抗氧化劑抗氧化能力的表征，其中，DPPH·是一種人工合成、穩(wěn)定的商業(yè)自由基，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)可靠。試驗(yàn)結(jié)果表明，5種酚酸物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除能力與基于GNPs生長(zhǎng)過(guò)程的納米材料光學(xué)檢測(cè)法所得結(jié)果一致。

2.4 實(shí)際樣品誘導(dǎo)納米金顆粒生長(zhǎng)

水溶C100中含有維生素C，東方樹(shù)葉綠茶中含茶多酚，2種物質(zhì)均能夠誘導(dǎo)金納米顆粒生長(zhǎng)。由圖12、圖13可見(jiàn)，以0.01 mol/L的維生素C作為當(dāng)量，水溶C100相當(dāng)于0.587倍

表1 5種酚酸物質(zhì)和2種茶飲料清除DPPH·自由基的能力endprint

物質(zhì) IC50 1/IC50 TIC50

（min） AE

（mmol/mol） 反應(yīng)情況

沒(méi)食子酸 0.015 66.667 10.2 6 600.667 快，迅速

咖啡酸 0.126 7.937 13.4 999.938 快，較迅速

原兒茶酸 0.238 4.200 36.7 114.487 較快，中速

香草酸 48.439 0.020 6 44.1 0.468 慢，低速

阿魏酸 76.316 0.013 1 51.4 0.255 慢，低速

東方樹(shù)葉 0.289 3.745 38.8 93.529 較快，中速

水溶C100 0.267 3.460 37.2 96.016 較快，中速

維生素C，東方樹(shù)葉綠茶相當(dāng)于0.567倍維生素C。由表1可見(jiàn)，根據(jù)AE值，2種茶飲料還原性從強(qiáng)到弱為水溶C100>東方樹(shù)葉綠茶。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)不同濃度的維生素C與氯金酸相互作用生成金納米顆粒，采用分光光度法測(cè)定生成金納米顆粒的吸光度，表明抗氧化劑的抗氧化性與吸光度之間存在著正相關(guān)關(guān)系。采用相同的方法，用5種不同的酚酸化合物和2種飲料與氯金酸相互作用，測(cè)定其吸光度，以表征7種不同物質(zhì)的抗氧化能力，結(jié)果表明，酚酸化合物還原能力從強(qiáng)到弱依次為沒(méi)食子酸>咖啡酸>原兒茶酸>香草酸>阿魏酸，2種茶飲料抗氧化能力從強(qiáng)到弱依次為水溶C100>東方樹(shù)葉綠茶。通過(guò)與傳統(tǒng)清除DPPH·水平評(píng)價(jià)抗氧化能力的方法相比，證實(shí)應(yīng)用金納米顆粒測(cè)定抗氧化劑抗氧化能力的方法可靠、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速，具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]Laguerre M，Lecomte J，Villeneuve P. Evaluation of the ability of antioxidants to counteract lipid oxidation：existing methods，new trends and challenges[J]. Progress in Lipid Research，2007，46（5）：244-282.

[2]Roginsky V，Lissi E A. Review of methods to determine chain-breaking antioxidant activity in food[J]. Food Chemistry，2005，92（2）：235-254.

[3]Pazdzioch-Czochra M，Widenska A. Spectrofluorimetric determination of hydrogen peroxide scavenging activity[J]. Analytica Chimica Acta，2002，452（2）：177-184.

[4]Whiteman M，Halliwell B. Protection against peroxynitrite-dependent tyrosine nitration and alpha 1-antiproteinase inactivation by ascorbic acid. A comparison with other biological antioxidants[J]. Free Radical Research，1996，25（3）：275-283.

[5]Jiang H，Ju H X. Electrochemiluminescence sensors for scavengers of hydroxyl radical based on its annihilation in CdSe quantum dots film/peroxide system[J]. Analytical Chemistry，2007，79（17）：6690-6696.

[6]Kim S H，Kim B，Yadavalli V K，et al. Encapsulation of enzymes within polymer spheres to create optical nanosensors for oxidative stress[J]. Analytical Chemistry，2005，77（21）：6828-6833.

[7]Soobrattee M A，Neergheen V S，Luximon-Ramma A，et al. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents：mechanism and actions[J]. Mutation Research，2005，579（1/2）：200-213.

[8]Robbins R J. Phenolic acids in foods：an overview of analytical methodology[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（10）：2866-2887.

[9]Ordoudi S A，Tsimidou M Z. Crocin bleaching assay（CBA）in structure-radical scavenging activity studies of selected phenolic compounds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54（25）：9347-9356.

[10]Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J]. LWT-Food Science and Technology，1995，28（1）：25-30.

[11]Cai Y Z，Luo Q，Corke H. Structure-radical scavenging activity relationships of phenolic compounds from traditional Chinese medicinal plants[J]. Life Sciences，2006，78（25）：2872-2888.endprint