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    白芨種子無菌萌發(fā)特性

    2015-06-15 16:09:09李雨晴楊嘉偉王康才梁永富陳紅麗徐益祥夏天爽
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:白芨發(fā)芽勢

    李雨晴+楊嘉偉+王康才+梁永富+陳紅麗+徐益祥+夏天爽

    摘要:為探討白芨[B.striata(Thunb.)Teichb.f.]種子無菌萌發(fā)適宜條件,采用1/2 MS、MS添加不同激素、生物添加劑,以及光暗處理進(jìn)行白芨種子萌發(fā)試驗。結(jié)果表明:1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA有利于種子萌發(fā);1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁有利于誘導(dǎo)原球莖;暗培養(yǎng)降低白芨種子萌發(fā)率,白芨種子萌發(fā)后,其幼苗在光照條件下生長緩慢。

    關(guān)鍵詞:白芨;無菌萌發(fā);發(fā)芽勢;

    中圖分類號: S567.23+9.04 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2015)04-0253-02

    收稿日期:2014-05-22

    基金項目:江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)項目(編號:R0201100292)。

    作者簡介:李雨晴(1991—),女,碩士研究生,主要從事藥用植物栽培與生理研究。E-mail:2013804133@njau.edu.cn。

    通信作者:王康才,教授,主要從事藥用植物栽培與生理研究。E-mail:wangkc@njau.edu.cn。

    白芨[Bletilla striata (Thunb.)Teichb.f.]為蘭科白芨屬多年生草本植物,以干燥塊莖入藥,性微寒,味苦、甘、澀,具有補(bǔ)肺、止血、散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿、生肌、斂瘡等功效,主治咳血吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、肺結(jié)核咳血、潰瘍病出血等癥[1]。白芨種子細(xì)小、無胚,在野生條件下很難萌發(fā)。人工采挖導(dǎo)致白芨野生資源緊缺,迫切需要進(jìn)行人工栽培。白芨蒴果包含上萬粒種子,利用組織培養(yǎng)技術(shù)對白芨進(jìn)行無菌萌發(fā),可以提高其萌發(fā)率,得到大量組培苗,是解決傳統(tǒng)分株繁殖效率低的重要手段[2-5]。為進(jìn)一步優(yōu)化白芨種子的發(fā)芽條件,本研究探討白芨無菌萌發(fā)條件及幼苗生長特性,以期為白芨快速繁殖提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    白芨于2013年8月采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材試驗大棚,經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所王康才教授鑒定為白芨的蒴果。

    1.2 方法

    白芨蒴果采集后,先用洗滌劑漂洗蒴果表面,再用流水沖洗30 min。在超凈工作臺上用75%乙醇浸沒30 s,無菌水沖洗后經(jīng)HgCl2消毒15 min,其間不停搖動,無菌水沖洗3~4遍,用無菌濾紙吸干白芨蒴果表面水分。蒴果縱剖,將種子均勻抖落在培養(yǎng)基表面?;九囵B(yǎng)基為1/2 MS,均添加蔗糖 30 g/L、瓊脂粉6 g/L(除特殊說明而外)。培養(yǎng)基滅菌前加入不同生物添加劑(馬鈴薯提取液、椰汁)以及不同濃度激素(NAA、6-BA),設(shè)置5×5完全隨機(jī)區(qū)組。培養(yǎng)基高溫滅菌前調(diào)節(jié)pH值至5.6,121 ℃下滅菌30 min,每處理接種5瓶,每瓶300~400粒種子。暗培養(yǎng)以黑暗條件下培養(yǎng)30 d后置于光下,其余處理為12 h/12 h光暗培養(yǎng),照度2 000~2 500 lx,培養(yǎng)溫度均為(25±1) ℃。統(tǒng)計各處理白芨種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢,原球莖誘導(dǎo)率及株高。發(fā)芽勢以培養(yǎng)20 d時的萌發(fā)率計,幼苗株高以培養(yǎng)50 d時計。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同處理下白芨種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育過程

    白芨種子接種至各不同培養(yǎng)基上1周后開始膨大,顏色由灰白轉(zhuǎn)綠。2周后可見葉芽從膨大的種胚一端頂出,添加高濃度激素的培養(yǎng)基上葉芽粗壯。3周后,葉芽變綠。數(shù)周后葉片展開。添加椰汁的培養(yǎng)基上葉芽生長緩慢,種胚持續(xù)膨大形成原球莖。培養(yǎng)50 d,原球莖誘導(dǎo)率分別達(dá)87.3%、92.3%,未見葉片展開(圖1)。培養(yǎng)60 d,添加激素的培養(yǎng)基中白芨幼苗莖基粗壯,葉片向上展開,未見生根。1/2 MS培養(yǎng)基上白芨葉片自基部展開,葉片向四周展開,葉尖微垂,少數(shù)植株生根。暗培養(yǎng)的白芨種子萌發(fā)率低,種胚膨大后不形成原球莖,直接萌發(fā)為細(xì)弱的幼苗;幼苗移至光下后,生長十分緩慢。

    2.2 基本培養(yǎng)基、生物添加劑及光周期對白芨種子萌發(fā)的影響

    由表1可見,培養(yǎng)40 d,除暗培養(yǎng)處理外,各培養(yǎng)基上白芨種子發(fā)芽率均可達(dá)到90%以上。與1/2 MS相比,添加 1.0 mg/L NAA能明顯提高白芨種子發(fā)芽率并促進(jìn)幼苗生長。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基時,白芨種子發(fā)芽勢高,生活力更旺盛。以MS為基本培養(yǎng)基有利于提高白芨幼苗株高,促進(jìn)其生長。馬鈴薯提取液對白芨萌發(fā)促進(jìn)作用較小,甚至抑制了幼苗的生長。

    2.3 激素對白芨種子無菌萌發(fā)的影響

    不同濃度激素處理對白芨種子萌發(fā)有顯著影響。添加1.0 mg/L NAA、1.6 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上,白芨種子發(fā)芽勢較高(94.4%),幼苗株高達(dá)1.190 cm;添加0.2 mg/L NAA及1.2 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上,白芨種子發(fā)芽勢最低(186%),幼苗較矮(0.104 cm)(表2、表3)。

    表1 不同處理對白芨種子萌發(fā)的影響

    培養(yǎng)基

    發(fā)芽率(%)

    20 d 30 d 40 d

    株高

    (cm)

    1/2 MS+1.0 mg/L NAA 88.2±1.924ab 95.4±1.673a 97.0±2.449a 0.348±0.015b

    MS+1.0 mg/L NAA 78.4±2.074c 96.6±3.209a 97.6±1.140a 0.398±0.016a

    1/2 MS+馬鈴薯提取液 65.0±1.581d 83.4±2.510b 91.4±1.140b 0.252±0.036c

    1/2 MS+20%椰汁 86.6±2.702b 96.8±1.304a 97.6±1.517a 0.206±0.021dendprint

    1/2 MS+30 g/L蔗糖+20%椰汁 89.8±1.304a 95.6±1.517a 96.2±2.168a 0.352±0.041b

    1/2 MS暗培養(yǎng) 27.4±1.817f 45.8±1.095d 46.4±3.435c 0.112±0.013e

    1/2 MS 60.8±1.924e 79.4±3.715c 90.2±0.837b 0.368±0.036ab

    注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

    表2 不同激素對白芨種子發(fā)芽勢的影響

    6-BA濃度

    (mg/L)

    發(fā)芽勢(%)

    NAA濃度0.2 mg/L NAA濃度0.4 mg/L NAA濃度0.6 mg/L NAA濃度0.8 mg/L NAA濃度1.0 mg/L

    0.4 44.2±4.970k 60.2±3.421i 42.0±3.606k 81.2±6.496cd 87.2±3.563b

    0.8 35.2±4.764l 42.2±3.271k 53.0±4.301j 71.2±4.970fg 82.0±2.828cd

    1.2 18.6±1.517n 24.6±2.302m 31.2±1.483l 44.4±2.074k 59.6±2.966i

    1.6 74.6±2.702f 79.8±2.774de 84.6±3.782bc 89.0±2.915b 94.4±1.673a

    2.0 64.8±2.280h 69.8±2.775g 75.6±2.966ef 73.0±3.240fg 79.6±5.030de

    注:所有數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

    表3 不同激素對白芨幼苗株高的影響

    6-BA濃度

    (mg/L)

    株高(cm)

    NAA濃度0.2 mg/L NAA濃度0.4 mg/L NAA濃度0.6 mg/L NAA濃度0.8 mg/L NAA濃度1.0 mg/L

    0.4 0.094±0.038j 0.232±0.029ghi 0.386±0.058f 0.436±0.047f 1.050±0.156b

    0.8 0.296±0.028g 0.312±0.038g 0.392±0.071f 0.448±0.048f 0.812±0.061d

    1.2 0.104±0.011j 0.198±0.037i 0.292±0.026gh 0.712±0.037e 0.874±0.113d

    1.6 0.212±0.026hi 0.242±0.038ghi 0.272±0.029ghi 0.970±0.051c 1.190±0.042a

    2.0 0.242±0.018ghi 0.402±0.026f 0.806±0.111d 0.834±0.043d 1.000±0.066bc

    注:所有數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

    2.4 不同激素對白芨萌發(fā)影響的多重比較

    由表4可知,白芨種子發(fā)芽勢、幼苗株高在一定范圍內(nèi)隨著6-BA、NAA濃度的增大而升高。6-BA濃度達(dá)1.6 mg/L時,白芨種子發(fā)芽勢最大。與添加NAA的培養(yǎng)基相比,添加6-BA白芨種子發(fā)芽勢極差較高,但幼苗株高極差偏低,表明NAA對白芨種子發(fā)芽勢影響較6-BA小,但對幼苗生長促進(jìn)作用較強(qiáng)。

    3 結(jié)論與討論

    蘭科植物種子細(xì)小,成熟時種皮細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器退化消失,成為死細(xì)胞[6]。胚發(fā)育不完全,缺乏供給營養(yǎng)成分的胚乳,自然條件下難以萌發(fā)。白芨為陸生蘭類,陸生蘭為適應(yīng)其生長環(huán)境,其種子具有厚種皮及含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)性質(zhì)[7],其種子發(fā)芽較氣生蘭更困難。無菌培養(yǎng)白芨種子,必須提供其萌發(fā)所需的各種物質(zhì),椰汁、馬鈴薯提取液等生物添加劑能提高發(fā)芽率、發(fā)芽速度[6],這與本研究結(jié)果基本相符。本試驗發(fā)現(xiàn),椰汁能誘導(dǎo)白芨種子直接形成原球莖,旦抑制幼苗生

    表4 6-BA、NAA濃度對白芨萌發(fā)的影響

    激素 濃度(mg/L) 發(fā)芽勢(%) 株高(cm)

    6-BA 0.4 62.96±19.379c 0.435±0.347b

    0.8 56.72±18.281d 0.452±0.198b

    1.2 35.68±15.146e 0.436±0.312b

    1.6 84.48±7.512a 0.577±0.427a

    2.0 72.56±6.001b 0.657±0.297a

    極差 48.80百分點(diǎn) 0.222

    NAA 0.2 47.48±20.821d 0.185±0.089e

    0.4 55.32±20.326c 0.277±0.080d

    0.6 57.28±20.713c 0.430±0.207c

    0.8 71.76±15.870b 0.680±0.219b

    1.0 80.56±12.282a 0.985±0.162a

    極差 33.08百分點(diǎn) 0.800

    注:同一激素處理同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

    長,這可能與椰汁含有的激素種類和濃度有關(guān)。生長素、細(xì)胞分裂素在種子萌發(fā)過程中起著重要作用,尤以后者作用更為明顯[8]。本研究發(fā)現(xiàn),6-BA對白芨種子發(fā)芽的促進(jìn)作用較NAA更為明顯,這與前人研究相符。MS是成分比較完全的

    培養(yǎng)基,1/2 MS雖與之成分相同,但大量元素減半。本研究結(jié)果表明,1/2 MS作為種子萌發(fā)培養(yǎng)基可以提高其發(fā)芽勢,猜測高濃度鹽離子影響細(xì)胞滲透勢導(dǎo)致發(fā)芽勢降低。發(fā)芽后應(yīng)盡快將幼苗轉(zhuǎn)接至MS培養(yǎng)基上壯苗,添加激素輔助其幼苗繼續(xù)生長。光是影響種子萌發(fā)的重要因素之一,本研究發(fā)現(xiàn),白芨種子萌發(fā)初期需光,暗培養(yǎng)的白芨種子萌發(fā)率低,轉(zhuǎn)至光下萌發(fā)率未見顯著增長,但可在無激素培養(yǎng)基上維持幼苗期長達(dá)數(shù)月,直至添加激素打破其生長停滯。這一發(fā)現(xiàn)對保存白芨種質(zhì)及人工調(diào)控溫室白芨苗生長期具有重大意義。綜上所述,在12 h/12 h光周期下,考慮以1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.6 mg/L 6-BA為萌發(fā)培養(yǎng)基較為適宜;以1/2MS+20%椰汁為培養(yǎng)基獲得白芨原球莖。白芨種子萌芽初期細(xì)小,不宜轉(zhuǎn)接,因此對于種子萌發(fā)培養(yǎng)基不僅要評價其提高種子活力的能力,而且要考慮其促進(jìn)幼苗生長的作用。

    參考文獻(xiàn):

    [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009.

    [2]周至明,黃程生,彭麗麗,等. 白芨人工種植初步研究[J]. 中藥材,2006,29(1):7-8.

    [3]張亦誠.白芨的生物特性及栽培技術(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)科技與信息,2007(11):45.

    [4]韓學(xué)儉.白芨藥用及其栽培技術(shù)[J]. 農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技,2004,15(10):31-32.

    [5]陸善旦.白芨種植技術(shù)[J]. 農(nóng)村新技術(shù),2008(19):4-5.

    [6]郭順星,徐錦堂.蘭科植物種子無菌萌發(fā)的研究[J]. 種子,1990(5):36-37,58.

    [7]Plant B,Shrestha S,Prandhan S. In vitro seed germination and seeding development of Phaius tancarvilleae(L′Her.) Blum[J]. Sci World,2011,9 (9):50-52.

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