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    淡黃花百合花粉活力及其測(cè)定方法比較

    2015-06-15 13:02:04劉偉丁長(zhǎng)春沐建華
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年4期

    劉偉+丁長(zhǎng)春+沐建華

    摘要:用I-KI法、氯化三苯基四氮唑(TTC)法、離體萌發(fā)法連續(xù)7 d對(duì)淡黃花百合(Lilium sulphureum Baker)的花粉活力進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,I-KI法、離體萌發(fā)法、TTC法測(cè)定的淡黃花百合花粉活力不完全相同。I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異。I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異,由于I-KI法較離體萌發(fā)法簡(jiǎn)單、成本低、所需時(shí)間短,因此是快速測(cè)定淡黃花百合花粉活力的最佳方法。開花第2至第4天花粉活力最高且無顯著差異,這幾天都可以進(jìn)行雜交授粉,但從發(fā)育的角度考慮,以開花第2天授粉最佳。

    關(guān)鍵詞:淡黃花百合;花粉活力;離體萌發(fā)法;TTC法;I-KI法

    中圖分類號(hào): S682.2+65.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)04-0198-02

    收稿日期:2014-06-03

    基金項(xiàng)目:云南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào):2013Y582);文山學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(編號(hào):09wsxk 02)。

    作者簡(jiǎn)介:劉 偉(1977—),男,湖南祁東人,碩士,講師,從事植物學(xué)研究。E-mail:liuwei00780@126.com。

    百合是世界五大切花之一,也是國(guó)內(nèi)重要的高檔花卉。我國(guó)野生百合種質(zhì)資源豐富,為培育百合新品種奠定了良好的種質(zhì)資源基礎(chǔ)[1]?;ǚ凼情_展雜交育種最基本也是最重要的材料,花粉活力大小對(duì)育種效果影響很大,授粉前對(duì)花粉活力進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要[2]。許多學(xué)者對(duì)不同植物的花粉活力測(cè)定方法進(jìn)行研究,常用的方法包括染色法、萌發(fā)法[3-7]。郝瑞娟等比較了亞洲百合、東方百合、麝香百合的部分栽培品種花粉活力的測(cè)定方法,認(rèn)為染色法簡(jiǎn)單,萌發(fā)法準(zhǔn)確,育種時(shí)應(yīng)將二者結(jié)合使用[8]。趙興華等對(duì)百合花粉生活力測(cè)定、貯藏方法進(jìn)行了研究[9]。張福平等研究了影響百合花粉活力的化學(xué)因素[10]。車代弟等對(duì)東方百合花粉萌發(fā)培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化[11]。尹恒等研究了麝香百合花粉發(fā)芽適宜培養(yǎng)基及最佳貯藏條件,認(rèn)為蔗糖濃度、硼酸濃度等對(duì)花粉萌發(fā)均有較大影響[12]。本研究以淡黃花百合花粉作為材料,用萌發(fā)法、染色法對(duì)淡黃花百合的花粉活力進(jìn)行測(cè)定,目的在于獲取快速測(cè)定花粉活力的最佳方法,明確淡黃花百合花粉活力最高時(shí)期,在此基礎(chǔ)上確定雜交育種最佳授粉時(shí)間,旨在為提高淡黃花百合育種效率提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    將從野外采集和云南省文山市中藥材市場(chǎng)購買的淡黃花百合種球種植于文山學(xué)院生物園地,待其快綻放時(shí),收集不同時(shí)期的新鮮百合花粉。

    1.2 方法

    1.2.1 材料處理 每天早晨觀察百合花蕾期,待其開花前 1 d 09:00左右開始采集花粉,將花蕾輕輕剝開,用刀片切取 1/2 個(gè)花藥,用錫箔紙包裹,置于保鮮袋中,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。每天在同一時(shí)間采集花粉并進(jìn)行試驗(yàn)。所采集的花粉均來自生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的同一植株,測(cè)量期間按時(shí)澆水,確保水分充足。

    1.2.2 花粉活力測(cè)定

    1.2.2.1 I-KI染色測(cè)定法[13] 取2 g KI溶于10 mL蒸餾水中,加入1 g I2待其全部溶解后,再加蒸餾水至200 mL,配好試劑后,貯于棕色瓶中備用。用解剖針挑取少量花粉置于載玻片上,加入1~2滴I2-KI溶液,輕輕蓋上蓋玻片放置1~2 min,置于低倍顯微鏡下觀察。凡染成藍(lán)紫色的為發(fā)育好、活力強(qiáng)的花粉,呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉。每處理3個(gè)玻片,每個(gè)玻片觀察5個(gè)視野,計(jì)算平均值。花粉活力計(jì)算公式如下:

    花粉活力= (藍(lán)色花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù))×100%。

    1.2.2.2 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測(cè)定法[13] 用解剖針取少量花粉置于載玻片上,加1~2滴0.5% TTC溶液,蓋上蓋玻片。將裝片置于35 ℃恒溫箱中,15 min 后置于低倍顯微鏡下觀察,染成紅色的為生活力強(qiáng)的花粉,淡紅色的次之,無色者為沒有活力或不育的花粉。每處理3個(gè)玻片,每個(gè)玻片觀察5個(gè)視野,計(jì)算平均值?;ǚ刍盍τ?jì)算公式:花粉活力=(被染色的花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù))×100%。

    1.2.2.3 離體萌發(fā)法[13] 配制0.01%硼酸、0.03% CaCl2、0.35 mol/L蔗糖、0.7%瓊脂的固體培養(yǎng)基,將配好的培養(yǎng)基置于錐形瓶滅菌,滅菌完成后待其凝固前用移液槍取100~150 μL滴于雙孔凹玻片處,用解剖針取花粉置于培養(yǎng)基中,將其放入培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿中事先放有濕濾紙),置于25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。在光學(xué)顯微鏡下,觀察3個(gè)玻片6個(gè)凹孔,每個(gè)凹孔觀察5個(gè)視野,離體培養(yǎng)后花粉管明顯伸長(zhǎng)的為有生活力的花粉,未伸長(zhǎng)的為沒有活力的花粉。萌發(fā)率計(jì)算公式:萌發(fā)率=(已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù))×100%。

    1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,每次統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野,采用Excel 2003、SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 I-KI法測(cè)定淡黃花百合花粉活力

    由表1可知,開花前1 d至第3天,花粉活力不斷增強(qiáng),第4天開始活力不斷降低,開花第3天花粉活力最高。開花后1~4 d花粉活力無顯著差異,維持在95%左右。開花前1 d花粉活力為78.97%,第5天花粉活力為82.53%。開花第6天、第7天花粉活力均低于50%,單花接近花謝期,明顯不適合進(jìn)行雜交授粉。由此可知,開花后1~4 d淡黃花百合花粉活力較高,最適合授粉,如果與其他百合雜交出現(xiàn)花期不遇,也可在此時(shí)期采集花粉進(jìn)行貯存。

    2.2 TTC法測(cè)定淡黃花百合花粉活力

    由表1可知,開花前1 d花粉活力為70.63%,開花當(dāng)天花粉活力為73.57%,均較低;開花第2天至第4天花粉活力較高,第3天最高;開花第5天花粉活力為75.60%;第6天與第7天分別為43.50%、43.07%,已經(jīng)降至50%以下。開花前1 d、開花當(dāng)天及開花第5天均無顯著差異;開花第2、3、4天均無顯著差異;開花第6、7天無顯著差異。由此可知,花粉離體保存取花粉的最佳時(shí)期及雜交育種最佳授粉時(shí)間均為開花第2至第4天。endprint

    表1 不同測(cè)定方法所測(cè)不同發(fā)育程度花粉活力

    開放時(shí)間

    (d)

    花粉活力(%)

    I-KI法 離體萌發(fā)法 TTC法

    開花前1 d 78.97a 90.03a 70.63a

    1 95.70b 86.70a 73.57a

    2 95.40b 89.23a 91.20b

    3 96.40b 97.13a 91.90b

    4 94.27b 87.93a 84.90b

    5 82.53a 75.10b 75.60a

    6 48.13c 57.50c 43.50c

    7 47.90c 39.57d 43.07c

    注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

    2.3 離體萌發(fā)法測(cè)定淡黃花百合花粉活力

    由表1可知,開花前1 d至開花第4天,淡黃花百合花粉活力變化不明顯,開花第3天花粉活力最高;開花第5天開始花粉活力下降較快,第7天活力降至50%以下。由此可知,為了提高雜交育種的成功率,開花前1 d至開花第4天都可以進(jìn)行授粉,開花第3天是最佳授粉時(shí)間,開花前1 d至開花第4天是離體保存最佳采集花粉時(shí)間。

    2.4 3種不同測(cè)定方法比較

    由表2可知,用3種不同方法測(cè)定淡黃花百合花粉活力由高到低依次為I-KI法>離體萌發(fā)法>TTC法。采用I-KI染色法測(cè)定的花粉活力與離體萌發(fā)法無明顯差異,這2種方法所得花粉活力與TTC染色法所得花粉活力差異極顯著。由于離體萌發(fā)法測(cè)定的花粉活力最接近真實(shí)值,因此離體萌發(fā)法被廣泛使用[14-16]。本試驗(yàn)中,離體萌發(fā)法與I-KI染色法所得花粉活力無顯著差異,說明I-KI染色法適用于淡黃花百合花粉活力的測(cè)定。鑒于離體萌發(fā)法比I-KI 染色法程序復(fù)雜、耗時(shí)多、成本高,I-KI 染色法操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短,快速測(cè)定淡黃花百合花粉活力最佳方法為I-KI 染色法。

    3 結(jié)論與討論

    花粉活力對(duì)于研究花粉與柱頭的相互作用、基因庫的保持、不親和性與受精關(guān)系、生理調(diào)節(jié)對(duì)花粉萌發(fā)的影響等均有非常重要的意義。為了進(jìn)行雜交授粉,通常要早期采集、貯存花粉,以解決花期不一致、遠(yuǎn)距離雜交的問題,花粉活力直接

    表2 3種不同測(cè)定花粉活力方法方差分析

    測(cè)定方法 花粉平均萌發(fā)率(%)

    I-KI法 79.91aA

    TTC法 71.79bB

    離體萌發(fā)法 77.90aA

    注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

    關(guān)系到育種效率[3]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,I-KI法、離體萌發(fā)法、TTC法測(cè)定的淡黃花百合花粉活力不完全相同。I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異,這2種方法都可用于淡黃花百合花粉活力的測(cè)定。趙統(tǒng)利等以卷丹百合為研究對(duì)象,認(rèn)為I-KI法不適合用于花粉活力的測(cè)定[16]。郝瑞娟等也認(rèn)為,萌發(fā)法比染色法能更準(zhǔn)確地反映花粉的真實(shí)活力[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,I-KI法、離體萌發(fā)法所得花粉活力無顯著差異,由于I-KI法較離體萌發(fā)法簡(jiǎn)單、成本低、所需時(shí)間短,因此是快速測(cè)定淡黃花百合花粉活力的最佳方法。開花第2至第4天花粉活力最高且無顯著差異,這幾天都可以進(jìn)行雜交授粉,但從發(fā)育角度考慮,以開花第2天授粉最佳。

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