自發(fā)性癲癇大鼠腦內(nèi)神經(jīng)肽Y受體Y2R和Y5R的表達(dá)及分布

徐曉雪 郭鳳 王千慧 楊軍 趙久晗 張朝東 蔡際群

自發(fā)性癲癇大鼠腦內(nèi)神經(jīng)肽Y受體Y2R和Y5R的表達(dá)及分布

徐曉雪 郭鳳 王千慧 楊軍 趙久晗 張朝東 蔡際群

目的 研究自發(fā)性癲癇大鼠(tremor rat,TRM)海馬和顳葉皮質(zhì)中神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)Y2和Y5受體(Y2R和Y5R)的表達(dá)和分布。方法 以TRM大鼠作為癲癇組，正常Wistar大鼠作為對照組，每組7只，以RT-PCR法檢測Y2R和Y5R mRNA水平表達(dá)，Western Blot法檢測其蛋白水平表達(dá)，免疫熒光法分析癲癇組和對照組大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回(DG)區(qū)以及顳葉皮質(zhì)中Y2R與Y5R的分布和定位。 結(jié)果 RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比較，癲癇組海馬和顳葉皮質(zhì)中Y2R mRNA相對表達(dá)水平(相對灰度值為海馬：0.75±0.06vs. 0.51±0.07；顳葉皮質(zhì)：0.70±0.05vs. 0.55±0.03)及蛋白相對表達(dá)水平(相對灰度值為海馬：0.79±0.08vs. 0.42±0.05；顳葉皮質(zhì)：0.72±0.05vs. 0.51±0.07)均顯著上調(diào)(均P<0.01)，Y5R mRNA(相對灰度值為海馬：0.52±0.10vs. 0.54±0.06；顳葉皮質(zhì)：0.46±0.03vs. 0.42±0.04)及蛋白(相對灰度值為海馬：0.28±0.06vs. 0.27±0.03；顳葉皮質(zhì)：0.31±0.05vs. 0.27±0.07)表達(dá)均沒有明顯變化(均P>0.05)。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)Y2R與Y5R在癲癇組大鼠海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元和DG區(qū)顆粒細(xì)胞以及顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元中分布廣泛且主要定位在細(xì)胞膜上。 結(jié)論 在TRM中Y2R表達(dá)在海馬和顳葉皮質(zhì)中均表達(dá)上調(diào)，但是Y5R的表達(dá)沒有明顯改變。

癲癇；NPY受體；Y2R；Y5R；自發(fā)性癲癇大鼠

癲癇(epilepsy)是一種以大腦神經(jīng)元異常放電引起短暫的腦功能紊亂為特征的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y, NPY)是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)肽?，F(xiàn)已證實癲癇發(fā)生時NPY及其受體表達(dá)會發(fā)生變化，而這種改變可能與癲癇的發(fā)病和治療有重要關(guān)系[1]。

NPY受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族成員。NPY受體活化后通常與抑制性G蛋白(Gi)耦聯(lián)而抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，最終動員或抑制鈣離子的釋放。此外NPY還可通過影響相關(guān)離子通道的表達(dá)以及激活蛋白激酶C傳遞不同的調(diào)控信息。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)8種NPY受體亞型，分別命名為Y1R-Y8R[2]。在哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是在海馬和皮質(zhì)等與癲癇發(fā)生密切相關(guān)的部位，Y2R和Y5R的表達(dá)最為豐富[3]。在不同的癲癇模型中，Y2R和Y5R的表達(dá)變化以及功能存在一定差別。近年來人工過表達(dá)NPY及其特異受體也逐漸成為癲癇基因治療的新熱點[4]。

自發(fā)性癲癇大鼠(tremor rat,TRM)是由日本京都大學(xué)首次發(fā)現(xiàn)的模擬癲癇小發(fā)作的理想模型[5]，其在10號染色體上存在Tm基因突變，并在出生后無需物理化學(xué)因素刺激而出現(xiàn)自發(fā)性抽搐以及失神樣癲癇發(fā)作，通過腦電圖能夠在海馬和皮質(zhì)中檢出5～7 Hz的棘慢綜合波。本研究擬利用分子生物學(xué)檢測方法探討這兩種NPY受體亞型在TRM癲癇發(fā)生中的作用，為進(jìn)一步開發(fā)拮抗自發(fā)性癲癇的特異性藥物和基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑 TRM種鼠(為轉(zhuǎn)基因鼠kyo與Wistar雜交所得)由日本京都大學(xué)饋贈，中國醫(yī)科大學(xué)自行繁殖，飼養(yǎng)至4周齡時剪鼠尾基因鑒定后用作癲癇組，中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供健康Wistar大鼠作為對照組。癲癇組和對照組大鼠均選9～12周齡，雌雄不限，每項實驗中模型組和對照組各7只。TRIzol購自SIGMA公司，Y2R、Y5R和GAPDH擴(kuò)增引物由Takara公司合成，一抗Y2R和Y5R兔多克隆抗體購自ABCAM公司, 一抗GAPDH小鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測Y2R和Y5RmRNA表達(dá)：癲癇組和對照組大鼠麻醉后斷頭，迅速取出全腦，剝離海馬和顳葉皮質(zhì)。以TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA樣本模板于10 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，以GAPDH作為內(nèi)參，參照Takara反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒操作。PCR擴(kuò)增引物序列：Y2R上游引物5′-GAGCATGCGCACAGTAACCAA-3′，下游引物5′-TAGGGCACCAAATGGCACAAA-3；Y5R上游引物5′-CGCTTCCATCTGGAGCAGAA-3′，下游引物5′-CATTCCGAGCAGCAGCTGTAT-3′；GAPDH上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。陰性對照模板為ddH2O,其余體系組分以及反應(yīng)條件均與實驗組相同。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠電泳后分析灰度值。以Y2R 和Y5R 擴(kuò)增條帶灰度值與作為內(nèi)參的GAPDH 擴(kuò)增條帶灰度值的比值為相應(yīng)mRNA相對表達(dá)量。

1.2.2 Western Blot分析Y2R和Y5R蛋白表達(dá)：在剝離的各組大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)組織樣本中加入RIPA裂解液以及蛋白酶抑制劑混合物，勻漿超聲后低溫離心取上清液，BCA法測定提取的總蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性后取50 μg/孔，5%(質(zhì)量濃度)濃縮膠和12%(質(zhì)量濃度)分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V 50 min，分離膠電壓120 V 70 min。轉(zhuǎn)印至PVDF膜(200 mA,2 h)。5%(質(zhì)量濃度)BSA常溫封閉1 h后分別加入一抗Y2R(1∶500)、Y5R(1∶400)和GAPDH(1∶1500)，4℃過夜孵育。次日TBST洗膜后，加入相應(yīng)的二抗(Y2R和Y5R二抗為羊抗兔1∶3000；GAPDH二抗為羊抗小鼠1∶3000)，37℃孵育1 h，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光，按一抗說明書上的蛋白相對分子質(zhì)量確定目的條帶位置并測定灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值為Y2R和Y5R蛋白相對表達(dá)量。

1.2.3 免疫熒光染色檢測Y2R和Y5R蛋白分布：癲癇組和對照組大鼠麻醉后，以4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛心臟灌流，迅速取腦，4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛固定24 h，30%(質(zhì)量濃度)蔗糖沉淀24 h。OCT復(fù)合物包埋，冰凍切片機(jī)進(jìn)行10 μm厚的連續(xù)冠狀切片。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min，1%(質(zhì)量濃度)正常牛血清蛋白及0.2%(質(zhì)量濃度)Triton X-100孵育90 min，分別加入一抗兔抗Y2R(1∶50)和兔抗Y5R(1∶40)，4℃濕盒過夜。次日PBS清洗，在暗室中加入FITC標(biāo)記羊抗兔(1∶200)，避光孵育2 h后加入DAPI(1∶500)標(biāo)記細(xì)胞核并封片。400倍熒光顯微鏡下觀察Y2R和Y5R陽性細(xì)胞，其中兩種陽性細(xì)胞的細(xì)胞核均被標(biāo)記為藍(lán)色，目的蛋白均被標(biāo)記為綠色。每只大鼠各選取3張切片，觀察部位為顳葉皮質(zhì)以及海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)。陰性對照一抗由PBS代替，其余步驟均相同。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織Y2R和Y5R mRNA表達(dá) 與對照組大鼠比較，癲癇組大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)中Y2R mRNA表達(dá)均上調(diào)(均P<0.01)；Y5R mRNA在上述腦區(qū)中表達(dá)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表1和圖1)。

表1 各組腦內(nèi)Y2R和Y5R mRNA相對表達(dá)比較

表2 各組大鼠腦組織Y2R和Y5R蛋白相對表達(dá)比較

2.2 各組腦組織Y2R和Y5R蛋白表達(dá) 與對照組大鼠比較，癲癇組大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)中Y2R蛋白相對表達(dá)明顯增加(均P<0.01)；Y5R在上述腦區(qū)中蛋白相對表達(dá)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(表2和圖2)。

2.3 各組大鼠腦組織Y2R和Y5R蛋白表達(dá)定位免疫熒光結(jié)果顯示這兩種NPY受體亞型在兩組大鼠海馬CA1、CA3和顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元上均廣泛表達(dá)。如圖3、圖4所示，鏡下可見神經(jīng)元形態(tài)呈錐形或橢圓狀，細(xì)胞核較大且被標(biāo)記為藍(lán)色，Y2R和Y5R蛋白被標(biāo)記為綠色并主要表達(dá)在神經(jīng)元胞膜上，軸突上也有一定分布。在大鼠海馬齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞胞膜上，也能觀察到Y(jié)2R與Y5R的分布。

圖2 各組大鼠腦內(nèi)Y2R和Y5R蛋白水平表達(dá)(Western Blot法)

3 討論

NPY是一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的內(nèi)源性神經(jīng)肽。NPY與其相應(yīng)受體結(jié)合后能夠影響下游多條信號通路。癲癇誘發(fā)的NPY異常表達(dá)與NPY受體的表達(dá)變化有密切關(guān)系[6]。因此，Y2R和Y5R均可能參與癲癇的發(fā)生過程。本研究旨在研究NPY兩種重要的受體亞型Y2R和Y5R在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)的表達(dá)和分布。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組大鼠相比，在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中Y2R mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增多，而Y5R的表達(dá)沒有明顯變化。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，Y2R和Y5R在TRM海馬CA1、CA3和齒狀回以及顳葉皮質(zhì)區(qū)域都有廣泛的分布。

圖1 各組大鼠腦內(nèi)Y2R和Y5R mRNA表達(dá)(RT-PCR法)

圖3 各組大鼠腦組織Y2R蛋白表達(dá)分布，圖中箭頭所示為相應(yīng)陽性細(xì)胞(免疫熒光×400)

圖4 各組大鼠腦組織Y5R蛋白表達(dá)分布，圖中箭頭所示為相應(yīng)陽性細(xì)胞(免疫熒光×400)

Y2R與癲癇的關(guān)系十分密切，是比較公認(rèn)的具有抗癲癇功能的NPY受體。海馬區(qū)Y2R在苔蘚纖維和Schaffer側(cè)支的表達(dá)濃度最高。突觸前區(qū)域分布說明Y2R可能通過抑制鈣離子介導(dǎo)的谷氨酸釋放而發(fā)揮NPY的抗癲癇作用[7]。有研究發(fā)現(xiàn)局限性癲癇患者中Y2R在海馬的齒狀回、CA1和CA3區(qū)結(jié)合量提高43%～48%[8]。因此，由癲癇引起的海馬區(qū)Y2R增加也可以視為是一種內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，這種機(jī)制的產(chǎn)生可能依賴于細(xì)胞內(nèi)外的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)傳遞。由此推測，在TRM腦內(nèi)Y2R表達(dá)的異常升高可能有利于NPY神經(jīng)保護(hù)功能的發(fā)揮，但是這種保護(hù)并不足以完全抵御癲癇的發(fā)生。這有可能是因為蛋白激酶C的影響，因為有研究認(rèn)為蛋白激酶C的高表達(dá)有可能會阻礙由NPY和Y2R介導(dǎo)的谷氨酸抑制作用[9]，但是相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步的實驗證實。

有學(xué)者認(rèn)為NPY很有可能通過Y5R介導(dǎo)抑制海馬興奮性傳遞的過程。Nanobashviii等[10]認(rèn)為Y5R可以介導(dǎo)NPY對大鼠海馬腦片CA3區(qū)發(fā)作間期自發(fā)性癲癇樣放電的抑制作用。Y5R與Y2R對于癲癇樣放電的抑制作用不同。后者主要作用于癲癇大發(fā)作期，而Y5R主要作用于發(fā)作間期放電。在Y5R缺失的狀態(tài)下，NPY對于離體海馬腦片的癲癇樣放電不起作用。在急性癲癇發(fā)作后，在體海馬區(qū)Y5R mRNA表達(dá)明顯增加。提示Y5R對于NPY抑制邊緣性發(fā)作發(fā)揮關(guān)鍵作用。但本研究中未發(fā)現(xiàn)其在TRM海馬以及顳葉皮質(zhì)中表達(dá)異常。這可能是因為NPY通過Y5R作用時，在一定程度上能降低神經(jīng)元的興奮性，但其作用與通過Y2R作用相比則顯得較小且隨著年齡增長而減少，并不足以阻止或減弱電刺激引起驚厥發(fā)作后的放電[11]。

綜上，本研究顯示，與對照組大鼠相比，Y2R在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中表達(dá)均明顯上調(diào)，而Y5R則沒有明顯變化,提示在TRM海馬中，Y2R的異常表達(dá)可能有助于NPY抗癲癇作用的發(fā)揮。NPY的神經(jīng)保護(hù)作用可能并沒有受損，并正常啟動，但是這種保護(hù)卻沒有抵御癲癇的發(fā)生。這可能是由于NPY表達(dá)量不足，也有可能與其他關(guān)鍵蛋白，如蛋白激酶C有關(guān)。但上述推測均需要更多的實驗進(jìn)行驗證。

[1]陳瑯，季曉林，鄒漳鈺,等 戊四氮致癇大鼠不同腦區(qū)神經(jīng)肽Y的表達(dá)及意義[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2005，12：118-121.

[2]Walther C, M?rl K, Beck-Sickinger AG. Neuropeptide Y receptors: ligand binding and trafficking suggest novel approaches in drug development[J]. J Pept Sci, 2011，17: 233-246.

[3]Babilon S1, M?rl K, Beck-Sickinger AG. Towards improved receptor targeting: anterograde transport, internalization and postendocytic trafficking of neuropeptide Y receptors[J].Biol Chem, 2013, 394: 921-936.

[4]McCown TJ. The future of epilepsy treatment: focus on adeno-associated virus vector gene therapy[J]. Drug News Perspect, 2010, 23: 281-286.

[5]Xu X, Guo F, Lv X, et al. Abnormal changes in voltage-gated sodium channels NaV1.1, NaV1.2, NaV1.3, NaV1.6 and in calmodulin/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ, within the brains of spontaneously epileptic rats and tremor rats[J]. Brain Res Bull, 2013, 96: 1-9.

[6]Vezzani A, Sperk G. Overexpression of NPY and Y2 receptors in epileptic brain tissue: an endogenous neuroprotective mechanism in temporal lobe epilepsy?[J]. Neuropeptides, 2004, 38: 245-252.

[7]Stani? D, Mulder J, Watanabe M, et al. Characterization of NPY Y2 receptor protein expression in the mouse brain. Ⅱ: Coexistence with NPY, the Y1 receptor, and other neurotransmitter-related molecules[J]. J Comp Neurol, 2011, 519: 1219-1257.

[8]Furtinger S, Pirker S, Czech T, et al. Plasticity of Y1 and Y2 receptors and neuropeptide Y fibers in patients with temporal lobe epilepsy[J]. J Neurosci, 2001, 1: 5804-5812.

[9]Silva AP, Louren J, Xapelli S, et al. Protein kinase C activity blocks neuropeptide Y mediated inhibition of glutamate release and contributes to excitability of the hippocampus in status epilepticus[J]. FASEB J, 2007, 21: 671-681.

[10]Nanobashvili A, Woldbye D, Husum H, et al. Neuropeptide Y5 receptors suppress in vitro spontaneous epileptiform bursting in the rat hippoeampus[J]. Neuro Report, 2004, 15: 339-343.

[11]Ho MW, Beck-Sickinger AG, Colmers WF. Neuropeptide Y(5) receptors reduce synaptic excitation in proximal subiculum, but not epileptiform activity in rat hippocampal slices[J]. J Neurophysiol, 2000, 83: 723-734.

(本文編輯：鄒晨雙)

The expressions and distributions of NPY Y2R and Y5R in tremor rat brains

XUXiaoxue*,GUOFeng,WANGQianhui,YANGJun,ZHAOJiuhan,ZHANGChaodong,CAIJiqun.

*DepartmentofNeurology,thefirsthospitalofChinaMedicalUniversity,ShenyangLiaoning110001，China

XU Xiaoxue, Email:xiaoxue80cn@sina.com

Objective To explore the expressions and distributions of neuropeptide Y(NPY) Y2 receptor and Y5 receptor (Y2R and Y5R) in tremor rat (TRM) hippocampus(HIP) and temporal lobe cortex(TLC). Methods Normal Wistar was chosen as the control group and TRM was chosen as the epileptic group. Each group contained 7 rats.RT-PCR and Western Blot were carried out to detect the expressions of Y2R and Y5R. The distributions of these two receptors were analyzed by immunofluorescence in TLC and hippocampal CA1, CA3 and DG. Results Compared with Wistar rats, increased Y2R was observed both in the HIP and TLC of TRM on both mRNA levels(HIP：0.75±0.06vs. 0.51±0.07；TLC：0.70±0.05vs. 0.55±0.03,P<0.01) and protein level(0.79±0.08vs. 0.42±0.05；TLC：0.72±0.05vs. 0.51±0.07,P<0.01). However, the Y5R did not obviously change on either mRNA level(HIP：0.52±0.10vs. 0.54±0.06；TLC：0.46±0.03vs. 0.42±0.04,P>0.05)or protein level(HIP：0.28±0.06vs. 0.27±0.03；TLC：0.31±0.05vs. 0.27±0.07,P>0.05).Y2R and Y5R were localized throughout TRM brains, especially on the membranes of pyramidal cells and granule cells.Conclusions The expressions of Y2R increased in TRM HIP and TLC, but Y5R may not be involved in the activation of endogenously neuroprotective system mediated by NPY in TRM epileptogenesis.

epilepsy; NPY receptor; Y2R; Y5R; tremor rat

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.02.007

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(81001429)

110001中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 中國醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)研究所(徐曉雪、楊軍、趙久晗、張朝東)；110001 中國醫(yī)科大學(xué)藥物毒理教研室(郭鳳、王千慧、蔡際群)

徐曉雪，Email：xiaoxue80cn@sina.com

R742.1

A

1006-2963 (2015)02-0101-05

2014-07-04)