大豆幼苗中葡萄糖—6—磷酸脫氫酶對(duì)干旱脅迫的生理響應(yīng)

王華華+黃俊駿+楊麗丹

摘要：以2種抗旱性不同的大豆品種（ZD11、YD24）為試驗(yàn)材料，用聚乙二醇（PEG）模擬干旱脅迫條件，探討不同干旱脅迫條件下葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）活性的動(dòng)態(tài)變化及其在抗旱性中的可能作用。結(jié)果顯示，干旱脅迫增強(qiáng)了2種大豆品種中G6PDH的活性，而且抗旱品種YD24比對(duì)照品種ZD11提高的幅度大，提示了G6PDH可能參與了大豆的抗旱性響應(yīng);進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，G6PDH抑制劑處理進(jìn)一步提高了干旱脅迫下大豆根中相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量;另外，G6PDH抑制劑處理進(jìn)一步抑制了主根的生長(zhǎng)以及側(cè)根的數(shù)量。這些結(jié)果表明，干旱脅迫下G6PDH在增強(qiáng)大豆的抗旱性中可能起著重要的作用。

關(guān)鍵詞：大豆;干旱脅迫;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;抗旱機(jī)制;抗旱性

中圖分類號(hào)： S565.101;Q946.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0102-03

收稿日期：2014-04-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：U1204305）;河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：132300410455）;河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：13A180515）;河南師范大學(xué)博士啟動(dòng)課題（編號(hào)：11126、11129）。

作者簡(jiǎn)介：王華華（1980—），男，湖北漢川人，博士，副教授，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：hhwang04@163.com。

干旱是目前制約植物生長(zhǎng)和農(nóng)作物產(chǎn)量的主要逆境因素之一，已成為農(nóng)作物生產(chǎn)上長(zhǎng)期存在的主要非生物脅迫因素，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。在我國(guó)，尤其是干旱和半干旱地區(qū)，缺水問(wèn)題一直是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最主要因素之一，即使是降水較多的地區(qū)也普遍存在季節(jié)性和非周期性干旱問(wèn)題，因此了解干旱脅迫下作物的抗性有著重要的意義。戊糖磷酸途徑（PPP）是葡萄糖降解的1個(gè)主要代謝途徑，其產(chǎn)生的大量還原型輔酶Ⅱ（NADPH）可以為生物合成提供主要的還原力，其中間代謝物亦可為許多生物合成提供原料[2]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH，分類號(hào)EC1.1.1.49）是PPP的關(guān)鍵酶，也是限速酶，在植物中廣泛存在。有研究表明，PPP參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)和環(huán)境脅迫響應(yīng)，如營(yíng)養(yǎng)饑餓、鹽脅迫、金屬脅迫、病原菌侵染等[3-5]。雖然現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，植物G6PDH參與了多種環(huán)境脅迫的應(yīng)答，但是干旱脅迫下大豆中的G6PDH對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)及其調(diào)節(jié)作用仍然不清楚。本研究以2種抗旱性強(qiáng)弱不同的大豆品種（ZD11、YD24）為試驗(yàn)材料，探討了干旱脅迫下G6PDH活性的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程及其在抗旱性中的可能作用，以期為進(jìn)一步揭示干旱脅迫下大豆的抗旱機(jī)制以及培育抗旱品種提供線索。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大豆（Glycine max）品種為抗旱性弱的周豆11（ZD11，對(duì)照）和抗旱性強(qiáng)的豫豆24（YD24），大豆種子由河南省周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 材料培養(yǎng)

挑選大小一致的大豆種子，用5%次氯酸鈉消毒15 min后，用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈，放入水中浸泡2 h，使種子充分吸脹，然后將種子于恒溫箱內(nèi)25 ℃黑暗條件下萌發(fā)2 d。挑選萌發(fā)一致的大豆種子，將其種在放有蛭石的托盤內(nèi)，并用1/4 Hoagland溶液澆灌。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，14 h光周期，光照度150 μmol（m2·s），相對(duì)濕度控制在70%。

1.3 材料處理

用聚乙二醇（PEG）6000模擬干旱脅迫處理，將萌發(fā)后的種子取出、洗凈后轉(zhuǎn)移到盛有不同濃度PEG（0、3%、6%、9%、12%、15%）、25 mmol/L氨基葡萄糖-6-磷酸（GN6P）的溶液中進(jìn)行不同處理。處理一定時(shí)間后收集大豆主根，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

處理完成后收集大豆幼苗的主根用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。G6PDH提取及活性的測(cè)定參照Esposito等的方法[6]，G6PDH的活性根據(jù)NADPH產(chǎn)生的速率來(lái)測(cè)定;相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量測(cè)定參照Wang等的方法[7];主根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量的測(cè)定采用相機(jī)對(duì)處理后的大豆根部進(jìn)行拍照記錄，其中根長(zhǎng)用ImageJ軟件進(jìn)行分析，每個(gè)處理至少分析30條根，所測(cè)指標(biāo)均選用大豆的主根為試驗(yàn)材料，測(cè)定時(shí)至少重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干旱脅迫水平對(duì)G6PDH活性的影響

如圖1所示，用不同濃度PEG（0～15%）處理大豆24 h，隨著PEG濃度的增加，2種大豆根中G6PDH活性均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，對(duì)照品種ZD11在9%PEG處理下達(dá)到最大值，與對(duì)照（PEG濃度為0）相比增加了82.7%;抗旱品種YD24在12%PEG處理下達(dá)到最大值，與對(duì)照（PEG濃度為0）相比增加了117.9%，且抗旱品種YD24的G6PDH活性始終比抗旱性較弱品種ZD11高。從表形上看，用15% PEG處理時(shí)，ZD11植株表現(xiàn)出明顯的萎蔫現(xiàn)象，而YD24則無(wú)明顯萎蔫現(xiàn)象。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)選定中等脅迫程度（9% PEG）作為干旱脅迫處理的濃度。

為了進(jìn)一步查明干旱脅迫下大豆根中G6PDH活性的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，本試驗(yàn)檢測(cè)了干旱脅迫下G6PDH活性變化的時(shí)間過(guò)程。如圖2所示，在正常營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，2個(gè)大豆品種中的G6PDH活性差異并不明顯（即處理開(kāi)始時(shí)）;但在干旱脅迫條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ZD11、YD24根中G6PDH活性均表現(xiàn)為先上升后下降，其中ZD11品種在處理36 h時(shí)達(dá)到最大值，與對(duì)照（處理開(kāi)始時(shí)）相比增加了1238%;YD24品種則在處理48 h時(shí)達(dá)到最大值，與對(duì)照（處理開(kāi)始時(shí)）相比增加了166.3%;隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，G6PDH活性有所下降，但仍比對(duì)照的高，且抗旱性品種YD24在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的G6PDH活性均要高于抗旱性較弱品種ZD11，表明在干旱條件下，抗旱性品種YD24可能通過(guò)提高G6PDH的活性來(lái)抵御干旱脅迫對(duì)大豆植株造成的傷害。

2.2 干旱脅迫下G6PDH抑制劑對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量的影響

相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量是反映植物受傷害程度常用的

2個(gè)重要指標(biāo)[8]。為了進(jìn)一步證實(shí)干旱脅迫下大豆根中G6PDH活性的增加與植物抗旱性有關(guān)，本試驗(yàn)運(yùn)用G6PDH抑制劑處理，檢測(cè)干旱脅迫下YD24大豆品種中相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量的變化情況。如圖3、圖4所示，干旱脅迫（9% PEG）處理48 h明顯提高了大豆根中相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量，分別比對(duì)照（未用PEG處理）增加了109.2%、57.1%;干旱脅迫條件下，用G6PDH抑制劑氨基葡萄糖-6-磷酸（GN6P）處理，使得大豆根中相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量均進(jìn)一步明顯提高，分別增加了55.6%、36.4%，說(shuō)明抑制G6PDH活性會(huì)加劇大豆植株遭受干旱脅迫所造成的氧化傷害程度，表明大豆幼苗通過(guò)增加G6PDH活性來(lái)抵抗干旱脅迫環(huán)境，避免植株遭受嚴(yán)重的氧化傷害，從而達(dá)到增強(qiáng)植株對(duì)干旱耐受性的目的。

2.3 干旱脅迫下G6PDH抑制劑對(duì)主根生長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)量的影響

根系是植物感受干旱脅迫信號(hào)的主要位點(diǎn)，土壤中水分的含量直接影響根系的發(fā)育[9]。為了進(jìn)一步查明大豆根中G6PDH在植物抗旱性中的調(diào)節(jié)作用，本試驗(yàn)運(yùn)用G6PDH抑制劑處理，檢測(cè)了干旱脅迫下YD24大豆品種中主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)量的變化情況。如圖5、圖6所示，干旱脅迫（9% PEG）處理48 h明顯抑制了主根生長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)量，分別比對(duì)照降低了22.6%、30.3%;G6PDH抑制劑GN6P處理進(jìn)一步抑制了干旱脅迫條件下主根生長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量，與干旱脅迫相比分別降低了47.9%、33.0%。這些結(jié)果表明，干旱脅迫下G6PDH參與調(diào)節(jié)了大豆根的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫條件會(huì)引起植物細(xì)胞質(zhì)膜的損傷、細(xì)胞內(nèi)容物的損傷、色素的破壞、自由基的增加等，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡的變化，使細(xì)胞遭到氧化傷害。然而，為了維持細(xì)胞的氧化還原平衡及正常的生理生化狀態(tài)，細(xì)胞會(huì)做出適應(yīng)性反應(yīng)，如細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶的活性增加以消除自由基，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡;另外還會(huì)產(chǎn)生1種對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)，就是增加還原力，還原力的產(chǎn)生離不開(kāi)磷酸戊糖途徑的主要調(diào)節(jié)酶G6PDH[10]。

本研究結(jié)果表明，隨著干旱脅迫程度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，2種大豆品種根中G6PDH活性均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，可能是隨著干旱脅迫程度加重，植物體受到的氧化傷害更嚴(yán)重，導(dǎo)致G6PDH活性開(kāi)始下降，其維持細(xì)胞氧化還原能力的減弱不足以抵消氧化破壞的能力，植株就可能呈負(fù)增長(zhǎng)狀態(tài)。干旱脅迫下加入G6PDH抑制劑GN6P處理，大豆根中相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量均進(jìn)一步增加也證明了這點(diǎn)。G6PDH被抑制可使得遭受干旱脅迫的植株氧化傷害程度加劇，表明G6PDH參與了大豆抗旱性的調(diào)節(jié)。

為了進(jìn)一步探討G6PDH在大豆抗旱性中的調(diào)節(jié)作用，本試驗(yàn)檢測(cè)了G6PDH對(duì)大豆主根生長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量的影響。植物對(duì)環(huán)境特別是水分因子變化的響應(yīng)主要通過(guò)根系進(jìn)行，植物為了適應(yīng)環(huán)境，提高競(jìng)爭(zhēng)效率，吸收較多的養(yǎng)分和水分，根系表現(xiàn)出明顯的可塑性[11]。由于根的伸長(zhǎng)使植物從土壤中吸收到水分，因此根對(duì)干旱逆境的不同反應(yīng)通常被認(rèn)為是作物對(duì)干旱條件的適應(yīng)性指標(biāo)。Hoecker等認(rèn)為，增加根長(zhǎng)是增大根系吸收表面積的有效途徑[12];然而Gullo等更加強(qiáng)調(diào)側(cè)根的作用，植物的主根數(shù)基本固定，但側(cè)根數(shù)量不受限制，水分脅迫條件下，植物可通過(guò)各級(jí)側(cè)根的加速分生和分枝而進(jìn)行補(bǔ)償生長(zhǎng)，提高根吸收表面積[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下，大豆主根生長(zhǎng)和側(cè)根數(shù)量均受到顯著抑制，G6PDH抑制劑GN6P處理則進(jìn)一步增加了這種抑制效果，表明G6PDH增強(qiáng)大豆的抗旱性可能是通過(guò)調(diào)節(jié)大豆根系的生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，對(duì)于G6PDH調(diào)節(jié)根系發(fā)育的機(jī)理還有待進(jìn)一步的深入研究。

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