二甲雙胍聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)肺癌裸鼠移植瘤VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6和 β-catenin表達(dá)的影響

陳玉琴，陳剛

(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊050051)

肺癌目前位于全世界癌癥死亡原因的首位，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌預(yù)后差、生存期短的主要原因，因此探索靶向作用于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的抗腫瘤藥對(duì)晚期肺癌患者的治療有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用二甲雙胍可減少糖尿病患者惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［1～6］，抑制腫瘤細(xì)胞生長，增強(qiáng)化療藥物的作用。2012年6月～2013年7月，我們觀察了二甲雙胍聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)肺癌裸鼠移植瘤血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)、血管內(nèi)皮生長因子受體-3(VEGFR-3)、CD44變異體蛋白6(CD44v6)和 β-鏈蛋白(β-catenin)表達(dá)水平的影響，從而在分子方面探討其作用機(jī)制，期望能為肺癌的治療提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c雄性裸小鼠33只，體質(zhì)量0～24 g，周齡4～5周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK京-204-0004，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。在IVC環(huán)境中，應(yīng)用滅菌純凈水以及無菌飼料飼養(yǎng)。人肺腺癌細(xì)胞株A549為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部贈(zèng)送。奧沙利鉑注射液(深圳海王藥業(yè)有限公司)，二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司)。VEGF-C兔抗人單克隆抗體(抗體使用濃度均為1∶200)購自博士德公司，VEGFR-3鼠抗人單克隆抗體(抗體使用濃度均為1∶200)、CD44v6鼠抗人單克隆抗體(抗體使用濃度為1∶300)、β-catenin鼠抗人單克隆抗體(抗體使用濃度均為1∶200)、DAB及兔二抗均購自北京中杉公司。RNA保存液購自TIAN GEN公司，Transzol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京Trans Gen Biotech公司，2x UltraSYBR Mixture試劑盒購自CWBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及接種 將人肺腺癌細(xì)胞株A549置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，使用含12%進(jìn)口胎牛血清的F12k培養(yǎng)基培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。用1 mL注射器在裸鼠左側(cè)腋部皮下接種上述細(xì)胞懸液0.2 mL。

1.2.2 裸鼠分組與處理 使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的長徑(a)、短徑(b)，按公式 V=a×b2/2，估算腫瘤近似體積。待移植瘤平均直徑約5 mm后，剔除腫瘤體積最小的1只裸鼠，成瘤時(shí)間為細(xì)胞種植后5～8 d，接種后第12天，腫瘤直徑平均4 mm。采用隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、二甲雙胍組、奧沙利鉑組、聯(lián)合用藥組各8只。奧沙利鉑組給予奧沙利鉑注射液，劑量為10 mg/(kg·次)，腹腔注射，每周給藥1次，同時(shí)口服滅菌蒸餾水;二甲雙胍組給予二甲雙胍，劑量為200 mg/(kg·d)，灌胃給藥，同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水;聯(lián)合用藥組給予二甲雙胍200 mg/(kg·d)，灌胃給藥以及奧沙利鉑10 mg/(kg·次)，每周1次腹腔注射給藥;對(duì)照組口服等量滅菌蒸餾水，腹腔注射等量生理鹽水。給藥42 d，處死裸鼠后留取腫瘤組織，腫瘤組織部分置于含RNA保存液的EP管中，液氮凍存;部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6和β-catenin蛋白的表達(dá)水平 將剝?nèi)〉哪[瘤組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡2次，浸蠟2次，石蠟包埋。免疫組織化學(xué)染色采用SP法。結(jié)果判定:VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin陽性表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)中，CD44v6陽性表達(dá)產(chǎn)物位于胞膜，呈棕黃色判定為陽性。先在100倍光鏡下對(duì)組織切片全面觀察，隨后于200倍光鏡下，隨機(jī)觀察10個(gè)視野，以北航真彩色病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均積分光密度值(OD值)。

1.2.4 熒光定量RT-PCR法檢測(cè)VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6和β-catenin mRNA的表達(dá)水平 目的基因引物的合成:引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下:GAPDH上游引物:5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物:5'-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3';VEGF-C上游引物:5'-CAATCACACTTCCTGCCG-ATG-3'，下游引物:5'-GGTCTTGTTCGCTGCCTGA-3';VEGFR-3上游引物:5'-GCAGACCCACACAGAACTCT-3'，下 游 引 物:5'-TCGCTGGATGCCGTTGTT-3';CD44v6上游引物:5'-GGAGCCAAATGAAGAAAATGAA-3'，下游引物:5'-TGAAATGGTGCTGGAGATAAAA-3';β-catenin上游引物:5'-TTACACCCACCATCCCACTG-3'，下游引物:5'-GCACGAACAAGCAACTGAACTA-3'。組織總RNA提取:在冰浴勻漿器中加入50 mg腫瘤組織提取RNA，提取成功后放置－80℃保存?zhèn)溆谩z測(cè)RNA的純度及含量，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量 OD260/OD280，選用 OD260/OD280為 1.8 ～2.0 的 RNA 用作反轉(zhuǎn)錄，RNA含量采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)法。cDNA第一鏈合成:42℃反轉(zhuǎn)錄50 min，95℃、5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。Syber Green熒光定量PCR檢測(cè):PCR熱循環(huán)參數(shù):95℃、10 min，然后三步反應(yīng):95℃、15 s，58 ℃、20 s，72 ℃、27 s，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第3步72℃、27 s收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增完畢后，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，比較行單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍以及奧沙利鉑對(duì)裸鼠人肺癌移植瘤生長的影響 接種42 d后各組移植瘤體積分別為:對(duì)照組 (1 439.63± 97.74)mm3，二 甲雙 胍 組(1 022.63±101.97)mm3，奧沙利鉑組(944.88±88.18)mm3，聯(lián)合用藥組(715.88±95.97)mm3。二甲雙胍組、奧沙利鉑組和聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為28.97%、34.37% 和 50.27%。聯(lián)合用藥組抑瘤率高于二甲雙胍、奧沙利鉑組(P均＜0.05)。

2.2 各組 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6 和 β-catenin蛋白及mRNA的表達(dá)比較 見表1、2。

表1 各組 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin 蛋白表達(dá)比較(±s)

表1 各組 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin 蛋白表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與聯(lián)合用藥組比較，#P ＜0.05。

組別 n VEGF-C VEGFR-3 CD44v6 β-catenin對(duì)照組 8 152.35±12.41 149.85± 7.70 152.10±7.97 149.35± 6.65二甲雙胍組 8 143.41± 8.75# 142.16± 7.76# 146.29±4.59# 142.16± 4.77#奧沙利鉑組 8 120.09±10.03*# 121.34± 4.75*# 118.84±7.81*# 116.96± 7.65*#聯(lián)合用藥組 8 78.86±10.19* 71.09±11.13* 73.59±9.70* 64.84±12.65*F 79.281 151.275 171.294 164.149 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin mRNA 表達(dá)比較(±s)

表2 各組 VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin mRNA 表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與聯(lián)合用藥組比較，#P ＜0.05。

組別 n VEGF-C mRNA VEGFR-3 mRNA CD44v6 mRNA β-catenin mRNA對(duì)照組0.77±0.08 0.76±0.07 0.76±0.07 0.75±0.06二甲雙胍組 8 0.74±0.04# 0.72±0.05# 0.72±0.07# 0.69±0.08#奧沙利鉑組 8 0.49±0.09*# 0.46±0.09*# 0.51±0.09*# 0.46±0.09*#聯(lián)合用藥組 8 0.31±0.06* 0.27±0.08* 0.31±0.06* 0.25±0.05*F 78.897 81.029 64.100 83.892 P 8 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

肺癌是全球主要的死亡原因，非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌病例的85%，超過60%非小細(xì)胞肺癌患者在診斷時(shí)已是晚期或存在轉(zhuǎn)移，并且已無手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，迫切需要有新的策略延緩肺癌的進(jìn)展、改善其生存率，提高患者的生存質(zhì)量。

近年多項(xiàng)研究顯示，二甲雙胍可能有降低腫瘤發(fā)生率的作用，其機(jī)制為①通過ATM-LKB1-AMPK-mTOR途徑，直接抑制腫瘤生長［7］;②降低胰島素及人胰島素樣生長因子-1水平，可能是二甲雙胍抑制惡性腫瘤的重要間接機(jī)制［8］;③誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，并能降低生長因子信號(hào)［9］;④降低細(xì)胞周期蛋白水平;⑤抑制原癌基因 HER2［10］;⑥抗炎作用;⑦提高T細(xì)胞的記憶［11］。二甲雙胍可以通過抑制miRNA-222從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖［12］，還可以通過阻斷STAT3磷酸化而抑制白細(xì)胞介素-6介導(dǎo)的上皮間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化［13］。二甲雙胍可以與表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用治療非小細(xì)胞肺癌，減少表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的耐藥，延長生存期［14］;還可以提高吉非替尼對(duì)肺鱗癌的敏感性［15］。與化療藥物有協(xié)同作用，可以增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性［16］。但關(guān)于二甲雙胍對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子作用的研究很少，本文通過研究二甲雙胍及與奧沙利鉑合用對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的影響，從而了解其抗腫瘤作用。

VEGF-C經(jīng)蛋白水解加工后，形成以二硫鍵連接的同源二聚體，與相應(yīng)的受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在正常組織中，VEGF-C是一種特異性促淋巴管生成因子，VEGFR-2表達(dá)在血管內(nèi)皮及淋巴細(xì)胞內(nèi)皮上，而其另一受體VEGFR-3只表達(dá)在淋巴細(xì)胞內(nèi)皮上。與VEGF一樣，高濃度VEGF-C可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增生，并增加血管通透性。VEGF-C通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的VEGFR-2受體及淋巴細(xì)胞內(nèi)皮內(nèi)的VEGFR-3作用進(jìn)行信號(hào)調(diào)節(jié)。CD44屬于一個(gè)獨(dú)特的黏附分子受體家族，參與細(xì)胞—細(xì)胞和細(xì)胞—基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞遷移、淋巴細(xì)胞歸巢、炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生。CD44v6的表達(dá)可以預(yù)測(cè)Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床進(jìn)展及預(yù)后［17］。CD44v6在非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者增多，另外CD44v6的表達(dá)強(qiáng)度也與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。β-catenin既是重要的細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架成分，又是 Wnt信號(hào)通路中的重要組成部分。βcatenin在發(fā)育過程中指導(dǎo)機(jī)體的正常發(fā)育，在腫瘤細(xì)胞中，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。β-catenin可激活MMPs或通過影響E-cadherion復(fù)合物的形成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移;激活其下游靶基因c-myc和cyclinD1調(diào)控細(xì)胞的凋亡與增殖。

本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，奧沙利鉑組和聯(lián)合用藥組 VEGF-C、VEGFR-3、β-catenin、CD44v6的表達(dá)水平下降，二甲雙胍組β-catenin、CD44v6的表達(dá)水平變化不明顯，聯(lián)合用藥組較二甲雙胍組及奧沙利鉑組VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)下降。聯(lián)合用藥組較奧沙利鉑組β-catenin、CD44v6表達(dá)下降。提示二甲雙胍可能通過某種機(jī)制增強(qiáng)了奧沙利鉑的抗腫瘤作用。本研究中，免疫組織化學(xué)及熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，二甲雙胍與奧沙利鉑均可抑制VEGF-C、VEGFR-3、CD44v6、β-catenin 的表達(dá)，且二甲雙胍與奧沙利鉑聯(lián)合用藥較二甲雙胍和奧沙利鉑單藥抑制作用更加明顯，因此考慮兩藥的聯(lián)合應(yīng)用既可降低奧沙利鉑的不良作用，又可能在抗腫瘤方面提高療效。關(guān)于二甲雙胍聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子抑制的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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