大鼠原位腎移植管道吻合改良新技術(shù)

陳 海,楊亦彬,梁國(guó)標(biāo),楊 旸,容 松

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 泌尿外科，貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 器官移植實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099)

技術(shù)與方法

大鼠原位腎移植管道吻合改良新技術(shù)

陳 海1,楊亦彬1,梁國(guó)標(biāo)2,楊 旸1,容 松3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 泌尿外科，貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 器官移植實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563099)

目的 建立一種改良的大鼠原位腎移植模型，評(píng)價(jià)其可靠性和穩(wěn)定性。方法 采用同體移植，以Sprague Dawley(SD)大鼠作為供、受體，手術(shù)技術(shù)采用原位移植法，血管及輸尿管各采用新式吻合法，即供體左腎動(dòng)、靜脈與受體左腎(切除后)動(dòng)、靜脈均行端端連續(xù)外翻式吻合，末端不打結(jié)。輸尿管采用新式端端吻合法，間斷縫針。共施行移植手術(shù)常規(guī)技術(shù)組及改良新技術(shù)組各20對(duì)，記錄各期手術(shù)時(shí)間，術(shù)后連續(xù)觀測(cè)體重及腎功能，第28天處死老鼠檢查移植腎及吻合口情況。結(jié)果 與常規(guī)血管吻合技術(shù)相比，采用改良新技術(shù)的供體手術(shù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而受體總手術(shù)時(shí)間明顯減少(P<0.05)；移植術(shù)后腎功能兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；吻合后常規(guī)技術(shù)組出現(xiàn)2例血管狹窄、1例吻合口出血，而改良新技術(shù)組無(wú)并發(fā)癥；術(shù)后28 d改良新技術(shù)組動(dòng)、靜脈吻合口通暢無(wú)狹窄，輸尿管吻合口無(wú)狹窄和瘺，而常規(guī)技術(shù)組1例動(dòng)脈吻合口堵塞、2例輸尿管狹窄。結(jié)論 采用血管端端連續(xù)外翻式無(wú)結(jié)吻合、輸尿管新式端端間斷吻合改良新技術(shù)，有效避免了吻合口狹窄與瘺，提高了成功率，是一個(gè)很好的移植模型。

腎移植;大鼠;動(dòng)物模型;血管吻合

大鼠腎移植作為常規(guī)器官移植模型一直以來(lái)被廣泛用于移植免疫排斥反應(yīng)等方面的研究之中。長(zhǎng)期以來(lái)由于涉及到顯微手術(shù)，雖然大鼠腎移植方法很多，但均對(duì)吻合技術(shù)沒(méi)有實(shí)質(zhì)的改進(jìn)，因此該移植技術(shù)需要初學(xué)者大量的練習(xí)才能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。本文建立改進(jìn)的血管及輸尿管重建新技術(shù)，使得該模型能在較短的時(shí)間內(nèi)熟練掌握，而且成功率高，并發(fā)癥明顯降低，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 采用6～8周無(wú)特定病原體級(jí)雄性SD大鼠80只，體重200～250g，均購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：ScXK渝20111009)，在本校實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)飼養(yǎng)3 d以上以穩(wěn)定情緒。大鼠分為兩組，常規(guī)技術(shù)組與改良新技術(shù)組各做20對(duì)腎臟移植。

1.2 手術(shù)器械 立式手術(shù)顯微鏡(德國(guó)Leica公司,M220F12)，異氟醚小動(dòng)物麻醉機(jī)(美國(guó)Matrx公司，VMR)，高頻電凝器(滬通，GT35-T)，自制恒溫手術(shù)床，醫(yī)用無(wú)損傷針帶線(10-0,8-0,2-0絲線)，15mm顯微血管夾(德國(guó)Braun公司，F(xiàn)E780K)，其它常規(guī)顯微手術(shù)器械。

1.3 手術(shù)方法

1.3.1 供體采摘 異氟醚氣體麻醉后腹部手術(shù)區(qū)剃毛，仰臥位固定于恒溫手術(shù)床上，消毒后沿腹部正中線剪開(kāi)皮膚，從劍突至恥骨聯(lián)合，拉鉤拉開(kāi)皮膚，溫濕紗布覆蓋腸管并向大鼠右側(cè)輕推，充分暴露左側(cè)腎臟區(qū)域，以棉簽鈍性分離腎動(dòng)、靜脈附近結(jié)締組織，電凝離斷左腎上腺血管分支和精索內(nèi)靜脈，至少游離出腎動(dòng)、靜脈5 mm。用血管夾夾住腎動(dòng)脈上的主動(dòng)脈，剪開(kāi)下腔靜脈一個(gè)小口，從腎動(dòng)脈下的主動(dòng)脈插入套管針向左腎灌注冰生理鹽水5 mL直至腎臟完全發(fā)白，然后盡量靠近主動(dòng)脈及下腔靜脈開(kāi)口處剪斷左腎動(dòng)、靜脈。接著游離輸尿管，注意保護(hù)好輸尿管滋養(yǎng)血管，游離后從下三分之一段剪斷輸尿管。最后銳性剪開(kāi)腎臟與周?chē)M織至完全游離左腎及血管、輸尿管，放在冰鹽水中保存待用。

1.3.2 受體準(zhǔn)備 同供體一樣麻醉、剪毛、消毒開(kāi)腹、保護(hù)腸管、顯露左腎區(qū)域，鈍、銳性分離左腎動(dòng)、靜脈約5 mm長(zhǎng)以及輸尿管，凝斷小血管分支，盡量靠近主動(dòng)脈及下腔靜脈開(kāi)口處用15 mm血管夾夾閉左腎動(dòng)、靜脈，盡量靠近腎門(mén)處剪斷動(dòng)、靜脈，從中段剪斷輸尿管，完全切除自體左腎。將供體腎放入左側(cè)腎窩，仔細(xì)修剪各吻合口端，去除脂肪，剪直吻合口邊緣待吻合。

1.3.3 血管吻合 輕輕拉動(dòng)供、受體腎動(dòng)脈端對(duì)端對(duì)齊，采用8-0線，先將兩腎動(dòng)脈作兩端縫合打結(jié)吊線，再用下端的針帶線在前壁作連續(xù)縫合，具體針?lè)ㄊ牵簭墓w腎動(dòng)脈外壁穿入，從受體外壁穿出，再?gòu)墓w外壁穿入，從受體外壁穿出，如此重復(fù)，結(jié)果動(dòng)脈前壁共縫合4針。翻轉(zhuǎn)腎臟，動(dòng)脈后壁和前壁一樣作連續(xù)縫合共4針，最后尾線和吊線打結(jié)，而改良新技術(shù)組則采用連續(xù)外翻縫合，具體針?lè)ㄊ牵簭氖荏w腎動(dòng)脈外壁穿入，從供體外壁穿出，再?gòu)耐瑐?cè)供體外壁穿入，從受體外壁穿出，再?gòu)耐瑐?cè)受體外壁穿入，從供體外壁穿出，如此重復(fù)，結(jié)果動(dòng)脈前壁共縫合4針(見(jiàn)圖1)。翻轉(zhuǎn)腎臟，動(dòng)脈后壁和前壁一樣作連續(xù)外翻縫合共4針，最后保留尾線5 mm長(zhǎng)不和吊線打結(jié)。將腎臟翻回原位，輕輕拉動(dòng)供、受體腎靜脈端對(duì)端對(duì)齊，仍用8-0線，將兩腎靜脈作兩端縫合打結(jié)吊線，用下端的針穿入供體靜脈腔，于腔內(nèi)行靜脈后壁常規(guī)連續(xù)縫合7-8針，最后一針穿出受體靜脈壁出來(lái)，再在腔外行前壁常規(guī)連續(xù)縫合7-8針，常規(guī)技術(shù)組最后一針穿出后尾線與吊線打結(jié)，而新技術(shù)組則保留1 cm不和吊線打結(jié)。吻合結(jié)束后，用棉簽輕輕壓住吻合口，放開(kāi)血管夾，然后慢慢放開(kāi)棉簽，可見(jiàn)移植腎即刻充血、紅潤(rùn)。若見(jiàn)吻合口仍有出血，可再度加壓片刻直至出血停止。采用改良新技術(shù)后若吻合口過(guò)寬或過(guò)窄可拉動(dòng)兩側(cè)吊線調(diào)節(jié)吻合口大小。

A:常規(guī)技術(shù)(連續(xù)縫合)；B:改良新技術(shù)(連續(xù)外翻縫合)。

1.3.4 輸尿管吻合 移植腎復(fù)灌后數(shù)分鐘，即可見(jiàn)輸尿管有尿液流出。將兩輸尿管拉直，剪去供體輸尿管過(guò)長(zhǎng)部分，使兩輸尿管無(wú)張力自然對(duì)準(zhǔn)且不扭曲。使用10-0線間斷吻合輸尿管，常規(guī)技術(shù)組吻合法先作兩端吻合吊線，再在前壁用常規(guī)方法間斷縫合兩針，然后牽拉兩端吊線，使輸尿管翻轉(zhuǎn)暴露后壁，最后用常規(guī)方法間斷縫合后壁兩針，再翻回輸尿管呈自然狀。改良新技術(shù)組則在每次縫合輸尿管時(shí)均從內(nèi)壁進(jìn)針、外壁穿出，其它過(guò)程和常規(guī)技術(shù)組相同(見(jiàn)圖2)。

A:常規(guī)技術(shù);B:改良新技術(shù)。

1.3.5 術(shù)后處理 管道吻合完畢，仔細(xì)檢查移植

腎供血情況、吻合口無(wú)扭曲狹窄、無(wú)出血后，還原腸管。結(jié)扎右側(cè)腎蒂，切除右腎。常規(guī)關(guān)腹，待老鼠蘇醒后放入籠中烤燈保溫，常規(guī)飲食飲水。

1.4 記錄指標(biāo) 分別記錄各期手術(shù)時(shí)間，術(shù)后連續(xù)觀測(cè)移植鼠體重及腎功能，第28天處死老鼠檢查移植腎及吻合口情況。

2 結(jié)果

2.1 移植術(shù)中情況 供體手術(shù)耗時(shí)：常規(guī)技術(shù)組13.2±2.5 min，改良新技術(shù)組13.4±2.3 min，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；受體手術(shù)總時(shí)間：常規(guī)技術(shù)組為45.5±7.8 min，而新技術(shù)組為38.3±6.9 min，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；吻合口開(kāi)放后常規(guī)技術(shù)組出現(xiàn)2例血管狹窄、1例吻合口出血較多(>200 μL)，而改良新技術(shù)組無(wú)明顯并發(fā)癥；兩組輸尿管吻合均未發(fā)現(xiàn)漏尿及明顯堵塞。

2.2 術(shù)后受體大鼠一般情況 術(shù)后全部大鼠蘇醒時(shí)間為3.1±1.5 min，術(shù)后圍手術(shù)期均存活，兩組手術(shù)成功率均100%。術(shù)后第28天處死老鼠，開(kāi)腹檢查見(jiàn)新技術(shù)組動(dòng)、靜脈吻合口通暢無(wú)狹窄，輸尿管吻合口無(wú)狹窄和漏尿，而常規(guī)技術(shù)組1例動(dòng)脈吻合口堵塞(腎色發(fā)白)、2例輸尿管狹窄致近端輸尿管膨脹、腎盂中度積水。

2.3 術(shù)后連續(xù)觀測(cè)受體大鼠體重(見(jiàn)表1) 兩實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后體重均下降，然后緩慢持續(xù)增加，呈正常生長(zhǎng)狀態(tài)，比較兩組體重變化，除第3周(P<0.05)外其它時(shí)段差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

表1 受體大鼠體重(g)變化情況(n=20)

組別術(shù)前術(shù)后第1天術(shù)后第7天術(shù)后第14天術(shù)后第21天術(shù)后第28天常規(guī)技術(shù)組198．8±4．7186．4±11．4210．3±11．2262．9±13．1315．9±27．5?359．7±36．7改良新技術(shù)組200．3±4．5190．4±10．5213．5±10．6265．4±12．8321．8±24．2?363．6±33．6

與常規(guī)技術(shù)組比較，*P<0.05。

2.4 受體大鼠術(shù)后腎功能 分別于術(shù)前及術(shù)后第1、7、14、21、28天取眼球后靜脈血，測(cè)量血清肌酐(見(jiàn)圖3)，可見(jiàn)兩組術(shù)后第1天肌酐均接近130 μmol/L，各自與術(shù)前比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組間比較，兩周內(nèi)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，第3周及第4周，常規(guī)技術(shù)組血清肌酐值較改良新技術(shù)組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 大鼠移植術(shù)后血清肌酐變化情況

3 討論

建立動(dòng)物移植模型一直是研究排斥反應(yīng)的重要手段之一[1]，而這其中大鼠腎移植模型使用最早[2]且最為廣泛[3]。相比大中型動(dòng)物移植模型，大鼠腎移植最容易出現(xiàn)的并發(fā)癥是出血、血栓和輸尿管堵塞及尿漏。國(guó)內(nèi)外已有眾多移植技術(shù)改良的文獻(xiàn)報(bào)道。多數(shù)技術(shù)涉及吻合部位的選擇、是否使用袖套、補(bǔ)片、套管[4-5]等設(shè)計(jì)，而忽略了吻合過(guò)程中用針的具體技巧。本模型即針對(duì)常見(jiàn)的并發(fā)癥采用新的管道吻合技術(shù)，提高了手術(shù)成功率和移植物使用質(zhì)量。

首先在血管吻合時(shí)采用端端吻合，和常用的端側(cè)吻合技術(shù)[5]相比，減少了對(duì)受體下肢缺血的影響，提高了成功率[6]。在動(dòng)脈端端吻合時(shí)，常規(guī)多用間斷縫合[7-8]，主要原因是連續(xù)吻合容易導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄。本模型在血管吻合中使用兩項(xiàng)新式技術(shù)：一是連續(xù)吻合，但每次都是同側(cè)外壁穿出再穿入，這樣能保證兩血管壁是外翻的，可以減少血栓形成的機(jī)會(huì)；二是最后一針吻合完畢后不與吊線打結(jié)，這樣可以在放開(kāi)血管夾后發(fā)現(xiàn)血管狹窄或縫線間距過(guò)大導(dǎo)致出血時(shí)輕輕拉動(dòng)兩根吊線調(diào)整吻合口大小，以解決狹窄及出血問(wèn)題。本研究組已用該無(wú)結(jié)技術(shù)成功建立小鼠心、腎移植模型[9-11]，而大鼠腎移植首次使用該技術(shù)，難度更大，故術(shù)中改用8-0縫合線，這樣可以利用線本身的粗度壓迫縫合間隙減少出血。在靜脈端端吻合時(shí)，同樣使用無(wú)結(jié)技術(shù)，也可以在吻合后拉動(dòng)吊線調(diào)整吻合口大小防止狹窄與出血。這種單純的縫合方法比使用輔助材料比如內(nèi)支架技術(shù)等方法要耗時(shí)短，血管內(nèi)壁損傷小，極大地降低了血栓形成幾率。本實(shí)驗(yàn)中改良新技術(shù)組沒(méi)有出現(xiàn)1例血管并發(fā)癥，而常規(guī)技術(shù)組出現(xiàn)數(shù)例吻合口狹窄與出血，證實(shí)了改良新技術(shù)的優(yōu)越。

輸尿管端端吻合難度相對(duì)較大，因?yàn)檩斈蚬芄軓奖妊芨侄鴥?nèi)徑極小[12]，在顯微鏡下很難將縫針從外壁穿入內(nèi)壁，所以本新技術(shù)每次進(jìn)針都選擇從內(nèi)壁穿入外壁穿出，這種吻合進(jìn)針簡(jiǎn)單，使縫合變得更加容易，極大地節(jié)約了手術(shù)時(shí)間，而對(duì)于輸尿管來(lái)說(shuō)因沒(méi)有血栓風(fēng)險(xiǎn)所以這種縫合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題，且因能較好地保持吻合間距，而沒(méi)有出現(xiàn)狹窄；而用10-0線間斷縫合6針，也可以保證不會(huì)出現(xiàn)尿瘺的情況。這種端端吻合技術(shù)與輸尿管直接縫入膀胱技術(shù)相比更接近自然狀態(tài)，也避免了因受體膀胱收縮擠壓輸尿管導(dǎo)致的狹窄。連續(xù)28 d觀察發(fā)現(xiàn)沒(méi)有1例出現(xiàn)尿瘺及狹窄，證明本改良新吻合技術(shù)雖容易導(dǎo)致兩側(cè)內(nèi)外壁無(wú)法對(duì)齊但結(jié)果仍完全成功有效，而常規(guī)吻合法有2例狹窄，均因視線不清導(dǎo)致縫線不均勻所致。

采用本模型的管道吻合改良新技術(shù)，明顯降低血管吻合導(dǎo)致的血栓形成和出血，降低輸尿管吻合導(dǎo)致的尿瘺和堵塞，在連續(xù)28 d的觀察中，大鼠體重恢復(fù)好，肌酐降至正常。本技術(shù)簡(jiǎn)單易行，操作可靠，非常適于初學(xué)者練習(xí)及進(jìn)階者使用。

[1] Rong S, Hueper K, Kirsch T, et al. Renal PKC-epsilon deficiency attenuates acute kidney injury and ischemic allograft injury via TNF-alpha-dependent inhibition of apoptosis and inflammation[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2014, 307(6): F718-726.

[2] Fisher B, Lee S. Microvascular surgical techniques in research with special reference to renal transplantation in rat[J]. Surgery, 1965, 58(7):904-905.

[3] Shrestha B, Haylor J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review[J]. Int J Nephrol Renovasc Dis, 2014, 7: 315-322.

[4] 李定憲, 祝峰, 胡有根.大鼠原位腎移植模型血管吻合方法的改進(jìn)[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2012, 29(8):1635.

[5] Ye D, Heng B, Lai C, et al. A recommended technique of renal vein anastomosis in rat kidney transplantation for trainee[J]. Chin Med J (Engl), 2014, 127(10):1919-1923.

[6] Spanjol J, Celic T, Jakljevic T, et al. Surgical technique in the rat model of kidney transplantation[J]. Coll Antropol, 2011, 35(Suppl 2):87-90.

[7] 鄧新軍, 劉永光, 郭穎, 等.大鼠右側(cè)供腎移植中腎靜脈吻合方式的比較研究[J]. 中華器官移植雜志, 2012, 33(12):746-749.

[8] 林淼, 王繼納, 許明, 等.大鼠原位腎移植模型的建立及技術(shù)改進(jìn)[J]. 實(shí)用器官移植電子雜志, 2014，2(6):360-364.

[9] 易清平, 劉小孫, 王華曦, 等.一種小鼠腎移植模型的建立[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2008, 25(11):1517-1519.

[10] 劉小孫, 張富祥, 容松.小鼠腹部異位心臟移植模型制作的改良(附視頻)[J]. 中華移植雜志:電子版, 2012,6(1): 38-39.

[11] Rong S, Lewis A G, Kunter U, et al. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse[J]. J Transplant, 2012, 2012: 127215.

[12] 劉明, 王玉杰.大鼠同種異體腎移植模型研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用醫(yī)技雜志, 2012,19(9):945-947.

[收稿2015-01-12;修回2015-03-06]

(編輯：王福軍)

New improved technologies of pipeline anastomosis of orthotopic kidney transplantation in rats

ChenHai1,YangYibing1,LiangGuobiao2,YangYang1,RongSong3

(1.Department of Nephrology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Department of Urology, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Organ Transplant Laboratory of The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To explore a new operation method for constructing a scalable and reliable orthotopic kidney transplantation in rats. Methods Sprague Dawley rats were used for the orthotopic isogenic transplantation. A new improved technique for anastomosis of vessels and ureter was established. The vessel’s continuous anastomosis was performed in an end-to-end manner between the donor’s and recipient’s left renal vessels after the left donor kidney was removed. Importantly, the last stitch was not tied to the end of the tie. A new end-to-end anastomosis with interrupted stitches by ureter was performed. Twenty transplantation cases were divided into regular technique group and new improved technique group. Operation time and renal function were observed. Rats were sacrificed at 28th Day. The grafts and the stomas were checked.Results Compared with regular technique group, donor operation time had no significant difference, but total recipient operation time was significantly reduced in the new improved technique group (P<0.05). Renal function had no significant difference between these two groups. In the regular technique group, there were two vessel stenosis and one anastomotic blooding after transplantation. But there were no complications in the new improved technique group. Twenty-eight days after transplantation, the arterial and venous anastomosis had good patency and no stenosis in the new improved technique group. There was no ureteral stenosis and anastomotic leak in the new improved technique group. But there were one artery blockage and two ureteral stenosis.Conclusion In this study, with the new improved vascular anastomosis and ureter anastomosis, anastomotic stenosis and leak of vessels and ureter are avoided. The success rate of transplantation is improved. It is a good model for the kidney transplantation in rats.

kidney transplantation;rat; animal model;vessel anastomosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81160096)。

楊亦彬,男,博士,主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師,研究方向:慢性腎病,E-mail:yyb1011@sina.com；容松,男,博士,教授，碩士生導(dǎo)師,研究方向:移植損傷,E-mail: songrong@hotmail.com。

R699.2

A

1000-2715(2015)02-0197-04