苦瓜提取物對(duì)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)Na+,K+-ATP酶活性的影響

翟玉榮，劉 波，莫鎮(zhèn)濤，靳俊峰，李意奇，李志梅

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 藥理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

專(zhuān)題研究

苦瓜提取物對(duì)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)Na+,K+-ATP酶活性的影響

翟玉榮，劉 波，莫鎮(zhèn)濤，靳俊峰，李意奇，李志梅

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 藥理學(xué)教研室，廣東 珠海 519041)

目的 探討苦瓜提取物(MCE)對(duì)糖尿病腎病(DN)的保護(hù)作用及對(duì)腎皮質(zhì)Na+,K+-ATP酶活性的影響。方法 鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，隨機(jī)將大鼠分為正常組，模型組，MCE預(yù)防給藥低、高劑量組，MCE治療給藥低、高劑量組。測(cè)定各組大鼠24 h尿蛋白量、血肌酐、尿素氮濃度及腎皮質(zhì)Na+,K+-ATP酶活性的變化，HE染色觀察腎臟病理學(xué)變化。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠的24 h 尿蛋白量、血清肌酐、尿素氮濃度及Na+,K+-ATP酶活性均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，MCE各給藥組大鼠的24 h 尿蛋白量、血清肌酐、尿素氮濃度及腎皮質(zhì)Na+,K+-ATP酶活性均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且MCE各給藥組均在不同程度上減輕了DN組大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)模糊、細(xì)胞數(shù)增多等病理變化；相同劑量下與治療給藥組比較，MCE預(yù)防給藥組24 h 尿蛋白、血清肌酐、尿素氮濃度及腎皮質(zhì)Na+,K+-ATP酶活性均下降更為明顯(P<0.05)，減輕病理變化也更顯著。結(jié)論 苦瓜提取物對(duì)DN大鼠的腎損傷有一定保護(hù)作用，能阻遏DN大鼠腎皮質(zhì)Na+,K+-ATP酶活性的升高。

苦瓜提取物；糖尿病腎??；大鼠；Na+,K+-ATP酶

糖尿病腎病( Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病( diabetes mellitus，DM)最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一[1]，也是導(dǎo)致終末期腎病的首要原因[2]。迄今仍無(wú)滿(mǎn)意的防治方法，主要采用降糖、調(diào)脂、降壓等對(duì)癥治療為主。因此，探索防治DN治療藥物具有重要意義?？喙蠟楹J科苦瓜屬植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的一種藥食兩用植物，性味苦寒，具有輔助降血糖、降血脂、抗氧化、增強(qiáng)免疫力及預(yù)防肥胖等保健功能[3]。有文獻(xiàn)表明苦瓜皂苷對(duì)糖尿病腎病有一定保護(hù)作用[4]，但苦瓜提取物(MomordicacharantiaL.extract,MCE)對(duì)早期糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用療效如何及作用機(jī)制是否與Na+，K+-ATP酶活性有關(guān)尚不清楚。本研究采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠腎損傷模型，觀察MCE對(duì)糖尿病大鼠的腎臟保護(hù)作用，并通過(guò)觀察其對(duì)腎皮質(zhì)中Na+，K+-ATP酶活性影響，初步探討苦瓜提取物對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體重200～250g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)scxk(粵)2011-0002。

1.2 藥品與試劑 苦瓜提取物購(gòu)于福州日冕科技開(kāi)發(fā)有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/RM0513-KG-2011，苷與苦瓜苷1%；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮蘭蛋白、尿蛋白及Na+，K+-ATP酶的測(cè)試盒購(gòu)于南京建成生物公司；One Touch自動(dòng)血糖分析儀及配套試紙由美國(guó)強(qiáng)生公司生產(chǎn)；SN-6930A型液閃儀與SN-6100型γ計(jì)數(shù)器購(gòu)自上海核所日環(huán)光電公司。

1.3 糖尿病模型制備、分組及給藥 60只大鼠按體重隨機(jī)分為正常組，模型組，苦瓜提取物預(yù)防給藥低、高劑量組，苦瓜提取物治療給藥低、高劑量組。每組10只大鼠。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食12 h，除正常組外，其余各組大鼠用1% STZ溶液(STZ溶解于0.1 mmol/L 4 ℃枸櫞酸緩沖液中，調(diào)pH=4.2～4.5，現(xiàn)配現(xiàn)用)，按60 mg/kg腹腔注射，72 h后分別取上述各組大鼠尾尖血測(cè)血糖，1次/d，連續(xù)3 d，以空腹血糖≥16.7 mmol/L者，視為糖尿病大鼠模型已制成。正常對(duì)照組給予同等容量的枸櫞酸溶液腹腔注射?？喙咸崛∥镱A(yù)防給藥低(100 mg/kg)、高(300 mg/kg)劑量組于造模前2周開(kāi)始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)6周；治療給藥低、高劑量組于成模后第3天開(kāi)始給藥，給藥劑量及方法同預(yù)防給藥組，連續(xù)給藥4周；正常和模型組灌服相同體積的蒸餾水。各組均給予普通飼料，自由飲水。

1.4 一般項(xiàng)目觀察 包括大鼠的精神狀態(tài)、毛色、飲食量、尿量、體重等。

1.5 HE染色腎臟病理學(xué)觀察 取左腎“去包膜”置于40g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片行HE染色，光鏡下觀察病理變化。

1.6 尿蛋白、血清肌酐及尿素氮測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前日用代謝籠收集24h尿液，以放射免疫法測(cè)定24 h尿蛋白量，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)脈取血，室溫下凝固，以1509×g離心10 min，取血清置-20 ℃保存?zhèn)溆?，測(cè)血清肌酐和尿素氮。血清肌酐、尿素氮由我院附屬醫(yī)院生化檢驗(yàn)室測(cè)定。

1.7 腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶活性的測(cè)定 取0.3g腎皮質(zhì)置于玻璃皿中，加入9倍體積的冷生理鹽水，在冰浴條件下剪碎并制成勻漿，取濃度為100g/L的組織勻漿以1593×g離心15 min，留上清液待測(cè)。 Na+，K+-ATP酶活性每毫克腎皮質(zhì)組織總蛋白中Na+，K+-ATP酶每小時(shí)分解ATP產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷(Pi)的量表示(pmol.mg-1.h-1)。樣品中總蛋白含量用考馬斯亮蘭法測(cè)定(按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 正常大鼠毛色光滑，反應(yīng)靈敏，體重增長(zhǎng)較快；模型組大鼠出現(xiàn)多飲多食多尿，毛色晦暗，明顯消瘦，行動(dòng)遲緩，體重減輕或增長(zhǎng)緩慢。MCE預(yù)防給藥低、高劑量組大鼠的精神狀況良好，體重減輕，反應(yīng)靈敏度較正常組稍差；MCE治療給藥高、低劑量組大鼠的精神狀況，體重變化及反應(yīng)靈敏度與預(yù)防給藥組情況相近，但較正常組稍差。

2.2 HE染色光鏡下腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清楚，腎小球血管袢薄而清晰，無(wú)系膜增生，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯增加，其周腎小管基本正常；模型組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)模糊，呈分葉狀，系膜細(xì)胞增生，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯增加。MCE各給藥組較模型組相比，上述改變有所減輕，周?chē)I小管結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，MCE預(yù)防給藥與治療給藥同劑量組相比，MCE預(yù)防給藥組病理變化減輕較為明顯(見(jiàn)圖1)。

2.3 MCE對(duì)糖尿病大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮的影響 與正常組相比，模型組大鼠24 h尿蛋白含量、血清肌酐及尿素氮濃度均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，MAG預(yù)防及治療給藥各組的24 h尿蛋白、血清肌酐及尿素氮濃度均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，相同劑量下，MAG預(yù)防給藥較治療給藥下降更為明顯(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

A：正常組；B：模型組；C：MC預(yù)防給藥100 mg/kg；D：MCE預(yù)防給藥300 mg/kg；E：MCE治療給藥100 mg/kg；F：MCE治療給藥300 mg/kg。

模型組與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；相同劑量下MCE預(yù)防與治療給藥組比較，△P<0.05(n=10)。

2.4 MCL對(duì)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶的影響 與正常組相比，模型組腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶活性顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，MAG預(yù)防及治療給藥各組Na+，K+-ATP酶活性均明顯降低(P<0.01)。相同劑量下，MAG預(yù)防比治療給藥Na+，K+-ATP酶活性下降更顯著(P<0.01，見(jiàn)圖3)。

模型組與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；同劑量下MCE預(yù)防與治療給藥組比較，△△P<0.01(n=10) 。

3 討論

DN以腎小球損害為主，當(dāng)濾過(guò)膜的通透性增加，會(huì)引起明顯蛋白尿，蛋白尿的發(fā)展與糖尿病病程進(jìn)展關(guān)系密切，即使嚴(yán)格控制血糖，隨著2型糖尿病進(jìn)展仍有1.7%的患者伴有蛋白尿出現(xiàn)[5]。一旦進(jìn)入大量尿蛋白期，腎功能損害的速度加快，且不可逆轉(zhuǎn)，所以及時(shí)有效的治療對(duì)于阻止、延緩DN的進(jìn)展十分重要[6]。血肌酐和尿素氮在腎小球?yàn)V過(guò)率降低后，其血中濃度會(huì)升高，因此尿蛋白、血肌酐和尿素氮是診斷腎損傷的常用檢測(cè)指標(biāo)，也是治療效果的直接判斷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，與正常組相比，模型組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮的濃度均明顯升高；光鏡病理學(xué)觀察也顯示模型組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)模糊、細(xì)胞數(shù)增多等病理變化，上述變化說(shuō)明糖尿病模型4周時(shí)已有腎臟損傷。苦瓜提取物預(yù)防和治療給藥各組均能明顯降低DN模型大鼠的24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮的濃度，且不同程度上減輕了DN大鼠的腎小球結(jié)構(gòu)模糊、細(xì)胞數(shù)增多等病理變化，提示苦瓜提取物對(duì)糖尿病引起的腎損傷有一定的保護(hù)作用，但預(yù)防給藥組要優(yōu)于治療給藥組。

Na+，K+-ATP酶在腎臟中分布廣泛，主要位于腎小管上皮細(xì)胞的基膜上，是鈉、鉀、葡萄糖和氨基酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、腎小管水重吸收及物質(zhì)交換的主要?jiǎng)恿?，也是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)。有研究表明，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎損傷早期，腎小管各節(jié)段Na+，K+-ATP酶活性都顯著增強(qiáng)[7-9]，而在DN腎功能失代償期，腎組織Na+，K+-ATP酶活性會(huì)明顯下降[9-10]。這些研究表明腎小管的Na+，K+-ATP酶活性變化可能與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。本研究顯示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠4周時(shí)，腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶活性顯著升高，與上述報(bào)道一致[7-9]，這可能是血糖的升高對(duì)腎小管管周膜的刺激，使Na+，K+-ATP酶活性代償性升高，此時(shí)，腎臟功能還處于代償期的原因。MCE預(yù)防給藥6周和治療給藥4周，明顯抑制造模導(dǎo)致腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶活性的顯著升高，這可能是MCE降低血糖，從而減輕了高血糖對(duì)腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶的刺激，使腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶活性下降。至于MCE減輕DN腎損傷作用的機(jī)制是否與其穩(wěn)定腎皮質(zhì)Na+，K+-ATP酶活性有關(guān)，在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上還有待于進(jìn)一步深入研究。

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[收稿2015-01-28;修回2015-02-26]

(編輯：譚秀榮)

Effects ofMomordicacharantiaL.extract on renal cortical Na+,K+- ATPase activity in diabetic rats

ZhaiYurong,LiuBo,MoZhentao,JinJunfen,LiYiqi,LiZhimei

(Department of Pharmacology, The Zhuhai Campus of Zunyi Medical University, Zhuhai Guangdong 519041, China)

Objective To investigate the protective effects ofMomordicacharantiaL.extract (MCE) on renal injury and the effects of MCE on renal cortical Na+,K+-ATPase activity in diabetic rats. Methods The diabetic nephropathy (DN) model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ) in the rats. Rats were randomly divided into the normal control, model, provention and treatment of MCE low- and high-dose groups.The 24-h urine protein quantity, serum creatinine (Scr), blood urea nitrogen (BUN) and the renal cortical Na+,K+-ATPase activity were detected. Renal pathology was observed via HE staining.Results Compared with normal control group, the 24-h urine protein quantity, Scr, BUN and the renal cortical Na+,K+-ATPase activity in model group were significantly increased (P<0.05). However, compared with model group, the above-mentioned indexes were obviously decreased and the renal pathological changes were also remarkably improved in MCE provention and treatment groups. In the same MCE dose, compared with MCE treatment group, the 24-h urine protein quantity, Scr, BUN, the renal cortical Na+,K+-ATPase activity and the renal pathologacal changes were more significantly improved in MCE provention group (P<0.05). Conclusion MCE have protective effects on renal injury and inhibit the increased renal cortical Na+, K+-ATPase activity in DN rats.

MomordicacharantiaL.extract; diabetic nephropathy; rat; Na+, K+-ATPase

貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：gzwk2009-1-067)；遵義醫(yī)學(xué)院中青年啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO：F-497)。

R285.5

A

1000-2715(2015)02-0121-04