微生物轉(zhuǎn)化氧化槐定堿活性菌株的篩選

付少彬,文福來(lái)，閆 松，張 蕓，李 義，岳昌武

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心暨貴州省特色微生物資源及藥物開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

技術(shù)與方法

微生物轉(zhuǎn)化氧化槐定堿活性菌株的篩選

付少彬1,文福來(lái)1，閆 松1，張 蕓1，李 義1，岳昌武2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心暨貴州省特色微生物資源及藥物開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

目的 通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)氧化槐定堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，以期得到結(jié)構(gòu)新穎或活性更強(qiáng)的衍生物，從中篩選出對(duì)氧化槐定堿有催化活性的微生物菌株。方法 采用稀釋法分離土壤微生物菌株，表面消毒法分離植物內(nèi)生菌，通過(guò)薄層色譜法(TLC)對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行篩選；通過(guò)表型和基因型鑒定活性菌株。結(jié)果 從遵義醫(yī)學(xué)院土壤分離得到土壤微生物菌株26株，從植物分離得到內(nèi)生真菌60株；17株土壤微生物具有催化活性，其中菌株T003表現(xiàn)出強(qiáng)的選擇性，經(jīng)顯微結(jié)構(gòu)和16S rDNA 序列分析，鑒定其為Escherichiacoli。結(jié)論 微生物轉(zhuǎn)化法為氧化槐定堿的結(jié)構(gòu)修飾和改造提供了一個(gè)很好的選擇方法。

生物轉(zhuǎn)化；生物堿；土壤微生物；選擇性

氧化槐定堿 (OSR) 和槐定堿 (SR) 是從豆科槐屬植物苦豆子(SophoraalopecuroidesL)中提取到的重要的生物堿。 研究表明槐定堿在興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗青霉素誘發(fā)的癲癇、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等方面表現(xiàn)出顯著的藥理活性[1-4]。氧化槐定堿和槐定堿在化學(xué)結(jié)構(gòu)上非常相似，其差別在于N(氮)原子，氧化槐定堿是槐定堿的氮氧化物形式，近年來(lái)關(guān)于氧化槐定堿的研究也受到越來(lái)越多的關(guān)注。多項(xiàng)研究表明氧化槐定堿顯示出良好的鎮(zhèn)痛、消炎、鎮(zhèn)靜、抗心律失常、免疫調(diào)節(jié)活性、保護(hù)腦缺血等藥理活性[5-6]。

氧化槐定堿由于環(huán)系穩(wěn)定，所以可改造的位點(diǎn)較少，利用傳統(tǒng)的有機(jī)催化的方式對(duì)該類化合物的化學(xué)活潑位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾有很大的局限性，對(duì)于不活潑的位點(diǎn)用傳統(tǒng)的有機(jī)化學(xué)的方法進(jìn)行修飾和改造相對(duì)較難，而微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)卻可以催化非活潑的C-H或 N-H位點(diǎn)，其作為化學(xué)合成的有效補(bǔ)充正廣泛應(yīng)用于合成反應(yīng)中，進(jìn)而可以為新藥研發(fā)提供更具價(jià)值的先導(dǎo)化合物[7-8]。此外，被稱之為“綠色化學(xué)”的微生物轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)選擇性強(qiáng)(區(qū)域選擇性和立體選擇性)、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、不造成環(huán)境污染和后處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，所以近年來(lái)通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾研究受到越來(lái)越多的關(guān)注[9-10]。但是，通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化法對(duì)氧化槐定堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的文獻(xiàn)少見(jiàn)報(bào)道。本文從土壤中分離土壤細(xì)菌及放線菌26株，植物內(nèi)生菌60株來(lái)篩選具有對(duì)氧化槐定堿有催化活性的微生物酶催化劑，為尋找更具價(jià)值的先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1 底物 底物氧化槐定堿購(gòu)自北京元寶山色譜科技有限公司(純度≥98%)。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集、分離及篩選培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基(去皮土豆200 g， 煮沸20 min；葡萄糖 20 g; 蛋白胨 10 g，加自來(lái)水定容至1 L)；LB 培養(yǎng)基 (蛋白胨10 g、酵母提取物5 g； 氯化鈉 10 g, 自來(lái)水定容至1 L, 用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié) pH至7)。 固體培養(yǎng)基則在相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中1 L加入20 g 瓊脂。所有培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌25 min備用。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌株的分離與純化 土壤微生物的分離與純化：選取遵義醫(yī)學(xué)院三宿舍前和學(xué)校后兩處的土壤，距離地面10～20 cm，裝入已滅菌的三角瓶，置于4℃冰箱待用。稱取5 g土壤樣品于250 mL三角瓶(內(nèi)裝50 mL無(wú)菌水以及玻璃珠)中，震蕩混勻30 min。靜止后量取1 mL上清液至于100 mL三角瓶中(內(nèi)裝40 mL LB液體培養(yǎng)基)，在37 ℃，140 rpm黑暗下震蕩富集培養(yǎng)12 h，加入底物氧化槐定堿，繼續(xù)在相同條件下共培養(yǎng)2 d，用等體積乙酸乙酯萃取1次，減壓濃縮后經(jīng)薄層色譜(TLC)檢測(cè)轉(zhuǎn)化結(jié)果。TLC條件：展開(kāi)劑：三氯甲烷-甲醇=5：1，顯色劑：碘以及改良碘化鉍鉀。經(jīng)TLC鑒定有陽(yáng)性轉(zhuǎn)化反應(yīng)的土壤樣品進(jìn)行濃度梯度稀釋(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7)，挑取單菌落，進(jìn)行劃線純化3次，得到純培養(yǎng)物，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

植物內(nèi)生真菌的分離與純化：選取采自遵義市金鼎山的藥用植物松穗卷柏SelaginellalaxistrobilaK. H. Shing的健康組織通過(guò)常規(guī)的表面消毒的方法進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離與純化[11]。

1.2.2 活性菌株的篩選 對(duì)分離得到的26株土壤微生物通過(guò)LB培養(yǎng)基進(jìn)行氧化槐定堿轉(zhuǎn)化反應(yīng)的篩選而植物內(nèi)生真菌則采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。土壤微生物在37 ℃，140 rpm條件下培養(yǎng)4～8 h后加入0.5 g/mL底物(乙醇溶解)，相同條件下繼續(xù)共培養(yǎng)2～3 d后用等體積乙酸乙酯萃取1次，減壓蒸發(fā)溶劑。經(jīng)TLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。展開(kāi)劑：三氯甲烷-甲醇=5：1，改良碘化必鉀顯色。植物內(nèi)生真菌在28 ℃，140 rpm條件下培養(yǎng)2～3 d，加入底物氧化槐定堿0.5 g/mL(乙醇溶解)，相同條件下共培養(yǎng)5 d后萃取培養(yǎng)物。萃取方法與檢測(cè)方法同上。

1.2.3 活性菌株T003的鑒定 對(duì)于篩選的活性菌株采用表型與基因型相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。表型通過(guò)觀察活性菌株的菌落形態(tài)與細(xì)胞形狀(革蘭氏染色)來(lái)鑒別。基因型則通過(guò)測(cè)定16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析進(jìn)行種屬鑒定，DNA 提取與PCR反應(yīng)條件參考已有文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離 從選取的5份土壤樣品中，只有三宿舍前的土壤微生物顯示陽(yáng)性轉(zhuǎn)化反應(yīng)。后續(xù)的活性菌株的分離純化也只針對(duì)于此處土壤。通過(guò)濃度稀釋法共得到土壤微生物26 株。圖1所示，10-5的稀釋濃度得到的單菌落最多，為最優(yōu)稀釋度。從植物松穗卷柏中得到內(nèi)生真菌60 株。

圖1 10-4 、10-5 、10-6稀釋濃度下的單菌落

2.2 氧化槐定堿轉(zhuǎn)化反應(yīng)的篩選 在篩選的86 株微生物菌株中，17 株土壤微生物顯示陽(yáng)性反應(yīng)(見(jiàn)圖2)。有趣的是，菌株T003表現(xiàn)出強(qiáng)的選擇性，因?yàn)橹晦D(zhuǎn)化出一種產(chǎn)物，且在TLC圖譜中底物OSR的點(diǎn)幾乎已看不見(jiàn)(見(jiàn)圖3)。而植物內(nèi)生真菌均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。

對(duì)照代表底物(OSR), 1-16 代表活性菌株，依次為T001, T002, T005, T007, T009, T010, T011, T012, T014, T015, y2, y3, T016, T017, T020, T023。

圖3 菌株T003的選擇性轉(zhuǎn)化

圖4 菌株T003的革蘭氏染色結(jié)果

2.3 活性菌株T003的鑒定 從土壤中分離的細(xì)菌T003因?yàn)檫x擇性催化生成單產(chǎn)物，所以作為我們后續(xù)研究的重點(diǎn)。其菌落形態(tài)特征為：菌落表面較光滑、透明狀、較濕潤(rùn)、易挑取、粘稠狀 ，具有細(xì)菌的典型菌落特征。在電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)，如圖4所示，細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏染色陰性。

16S rRNA 基因序列見(jiàn)圖5，長(zhǎng)1416bp，經(jīng)NCBI的Blast在線比對(duì)，與Escherichiacoli相似度100%。經(jīng)MEGA 5.1軟件進(jìn)行聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖6)。綜合表型和基因型分析，活性菌株T003鑒定為Escherichiacoli。

圖5 菌株T003的16S rDNA序列

圖6 菌株T003的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3 討論

土壤是微生物的“大本營(yíng)”。 土壤具有微生物生長(zhǎng)所需要的各種條件。土壤中有豐富的有機(jī)質(zhì)無(wú)機(jī)礦物質(zhì)，能為微生物提供碳源、氮源和能量。土壤的良好持水性、多孔性、接近中性的酸堿度、相對(duì)穩(wěn)定的溫度等，這些都能滿足微生物生長(zhǎng)繁殖的要求。因而土壤事實(shí)上是“微生物天然的培養(yǎng)基”。在這里微生物的種類最多，數(shù)量也最大。內(nèi)生真菌普遍存在于各種陸生和水生植物中，具有分布廣、種類多的特點(diǎn)。目前的研究表明，植物內(nèi)生真菌是一個(gè)龐大的特殊真菌類群，幾乎所有的植物組織中都發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生真菌的存在。按地球目前已知的25萬(wàn)種植物計(jì)算，內(nèi)生真菌的總數(shù)可以超過(guò)100萬(wàn)種。由此可見(jiàn)，植物內(nèi)生菌也是一個(gè)巨大的資源。

我們通過(guò)富集培養(yǎng)、活性檢測(cè)指導(dǎo)下得出采自遵義醫(yī)學(xué)院三宿舍前的土壤樣品含有能夠催化OSR的微生物菌株，以此處土壤為樣本分離得到土壤微生物26株。通過(guò)常規(guī)表面消毒得到松穗卷柏內(nèi)生真菌60株。經(jīng)TLC檢測(cè)，在篩選的86株菌株中，17株土壤微生物顯示出陽(yáng)性反應(yīng)。由此可見(jiàn)，土壤中蘊(yùn)藏著豐富的活性菌株。但是所有的植物內(nèi)生真菌均未見(jiàn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。土壤微生物T003因?yàn)檩^高的選擇性催化OSR成單一產(chǎn)物而成為我們研究的重點(diǎn)，經(jīng)表型和基因型分析將其鑒定為Escherichiacoli。下一步我們將對(duì)該菌株進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為新藥研發(fā)提供更多的化合物。

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[收稿2014-10-20;修回2014-12-10]

(編輯：王福軍)

Strains screening on microbial transformation of oxysophoridine

FuShaobin1,WenFulai1,YanSong1,ZhangYun1,LiYi1,YueChangwu2

(1. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. Research Center for Medicine Biology, Guizhou Key Laboratory of Characteristic Microbial Resources & Drug Development, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective The structuture of oxysophoridine(ORS) were modified by microbial transformation to obtain derivatives with novel structure or Stronger activity.The strains with catalytic activity of oxysophoridine were screened.Methods Soil microbes were separated and purified by dilution method while plant endophytic fungi were obtained by surface disinfection. Transformation reaction was detected via TLC. Active stains were identified by phenotype and genotype. Results Twenty-six soil microbes were isolated from soil in Zunyi Medical University and 60 endophytic fungi from plant were purified. Seventeen strains of soil microbes exhibited the catalytic activity. Interestingly, strain T003 with high selectivity was identified asEscherichiacolibasedonphenotype and genotype.Conclusion It provides an alternative for structure modification of ORS by microbial transformation.

biotransformation; alkaloids; soil microbes; selectivity

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO: 21462057)；貴州省普通高等學(xué)校微生物資源及藥物開(kāi)發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(NO: GZMRD-2014-003)；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)課題研究資助(NO: QZYY-2014-083)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(NO: [2014] 5838)。

R284

A

1000-2715(2015)02-0190-03