牙齦卟啉單胞菌脂多糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子IL-8和MCP-1的影響

胡琳琳，林玉祥，肖 莉，李 霞，賈慧杰，李文軍，葛 頌

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 牙周科，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

牙齦卟啉單胞菌脂多糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子IL-8和MCP-1的影響

胡琳琳，林玉祥，肖 莉，李 霞，賈慧杰，李文軍，葛 頌

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 牙周科，貴州 遵義 563099)

目的 觀察牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)產(chǎn)生趨化因子的影響，探討P.gingivalis在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)病變過程中的可能作用。方法 復(fù)蘇P.gingivalis菌株(ATCC 33277)并于厭氧條件下培養(yǎng)，采用熱酚水法提取P.gingivalis-LPS，并加以純化。應(yīng)用紅外線光譜、鱟實(shí)驗(yàn)對(duì)提取的脂多糖予以鑒定。體外培養(yǎng)HUVECs并加入不同終濃度的P.gingivalis-LPS，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)共同培養(yǎng)2 、6 、24 h后,HUVECs分泌IL-8和MCP-1的量。結(jié)果 本研究條件下，應(yīng)用不同濃度P.gingivalis-LPS刺激HUVECs 2 、6 、24 h后，細(xì)胞表達(dá) IL-8和MCP-1蛋白水平升高。結(jié)論P(yáng).gingivalis-LPS能上調(diào)HUVECs的IL-8和MCP-1表達(dá)。

牙齦卟啉單胞菌脂多糖；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；白細(xì)胞介素-8；單核細(xì)胞趨化蛋白-1

牙周炎是一種世界范圍內(nèi)的常見病、多發(fā)病，在我國(guó)成人中的患病率高達(dá)80%～90%，其中20%左右為重度牙周炎。流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究均顯示，牙周炎與主動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)、冠心病等心血管疾病密切相關(guān)[1-4]。牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)是牙周炎的主要致病菌，并且已經(jīng)在As斑塊中檢測(cè)出P.gingivallis[5]。已有的研究發(fā)現(xiàn)P.gingivallis能夠侵入人冠狀動(dòng)脈和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能紊亂在As的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是P.gingivalis的重要毒力因子，具有廣泛的生物學(xué)活性[8-9]。研究表明P.gingivallis-LPS能活化血管內(nèi)皮細(xì)胞并影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

趨化因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是炎癥反應(yīng)中重要的前炎癥因子，能選擇性誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞在炎癥部位聚集。正常內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)少量MCP-1和IL-8，許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)P.gingivallis全菌刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-8、MCP-1明顯增強(qiáng)。Takahashi研究表明P.gingivalis-LPS能刺激HUVECs表達(dá)趨化因子，Nassar等[6]通過研究也認(rèn)為P.gingivalis外膜成分包括P.gingivallis-LPS能誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生MCP-1和IL-8。然而也有學(xué)者認(rèn)為P.gingivalis-LPS不能誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生IL-8[11]。出現(xiàn)這兩種截然相反觀點(diǎn)的原因可能與實(shí)驗(yàn)中LPS的提取方法、作用濃度等的不同有關(guān)，但也使大家關(guān)于P.gingivallis-LPS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能影響及其在As發(fā)生發(fā)展中作用的認(rèn)識(shí)無法形成定論。因此，本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典熱酚水法提取、純化P.gingivalis-LPS，并以不同濃度作用于HUVECs，觀察其產(chǎn)生細(xì)胞趨化因子的情況，以期探討和明確P.gingivalis-LPS能否導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的活化和功能紊亂。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器設(shè)備和試劑

1.1.1 材料P.gingivalisATCC33277菌株(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ATCC CRL-2480(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院提供)。

1.1.2 試劑 牛心腦浸液(BHI)培養(yǎng)基(OXIOD, United Kingdom)；DNase I(Sigma, USA)；RNase H(Sigma, USA)；透析袋(Merck，German)；鱟試劑(廈門鱟試劑廠，敏感性0.25 EU/mL)；大腸桿菌脂多糖O111:B4(Sigma，USA)；IL-8 ELISA試劑盒、MCP-1 ELISA試劑盒(上海西唐生物工程公司)。

1.1.3 主要儀器 厭氧培養(yǎng)箱(Shellab , USA)；超聲波振碎機(jī)(Soniprep150 )；電泳儀(BIO-RAD, USA)；1000 FT-IR紅外線光譜儀(VARIAN, USA)；超速離心機(jī)(BECKMAN, USA)；酶標(biāo)儀(ELx 800, USA)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組分為2組：T1組為1 μg/mLP.gingivalis-LPS刺激的HUVECs組，T2組為10 μg/mLP.gingivalis-LPS刺激的HUVECs組；對(duì)照組分2組：E.coli-LPS組(陽(yáng)性對(duì)照組)為加入100 ng/mL刺激的HUVECs組，陰性對(duì)照組為僅加RPMI-1640培養(yǎng)基的HUVECs。

1.2.2P.gingivalis菌株的培養(yǎng) 復(fù)蘇用脫脂牛奶凍存的P.gingivalisATCC33277菌株，并將P.gingivalis接種于BHI血瓊脂培養(yǎng)基，放置于厭氧培養(yǎng)箱( 80%N2, 10%H2, 10%CO2) ，37 ℃恒溫培養(yǎng)5～7d。挑取少量菌落涂片，革蘭染色呈紅色，鏡檢證實(shí)為純培養(yǎng)物，用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 收集菌苔，并用無菌蒸餾水懸浮，-20 ℃凍存。

1.2.3P.gingivalis-LPS的提取及純化 熱酚水法提取P.gingivalisATCC33277脂多糖[7]。用pH 7.4、0.01 mol/L PBS 收集 P.gingivalis 菌苔，用 PBS 離心洗滌3次后取細(xì)菌沉淀，稱重后將細(xì)菌懸浮于適量的無菌蒸餾水中，形成細(xì)菌懸液，-70 ℃反復(fù)凍融4～5次，超聲波裂解機(jī)振碎30 min。裂解后的細(xì)菌懸液加入等量90% 苯酚，68～70 ℃水浴中劇烈攪拌30 min，冷卻至室溫，3 000 r/min 離心 30 min，吸取上層水相，中層變性蛋白吸棄。將等量的無菌蒸餾水加入下層酚相，按照上述的方法繼續(xù)提取2～3次。收集的上層水相先后用自來水、蒸餾水透析，透析后的水相用聚乙二醇20000濃縮至原體積的1/4，加入終濃度為50 μg/mL的DNaseⅠ和RNase H，37 ℃消化4 h，100 ℃水浴15 min，3 000 r/min 離心30 min，收集上清，再用終濃度為50 μg/mL Proteinase K 同上述方法處理后收集上清，上清加6倍以上體積無水乙醇4 ℃過夜， 3 000 r/min 離心30 min，收集沉淀，無菌蒸餾水懸浮沉淀，蒸餾水透析沉淀48 h，換水4～6次，105 000～110 000 r/min 超速離心4 h，收集沉淀，無菌蒸餾水懸浮沉淀，蒸餾水透析懸浮的沉淀48 h，換水4～6次，真空冰凍干燥后稱重。

1.2.4P.gingivalis-LPS 再純化 據(jù) Manthey 和 Vlgel 介紹的方法對(duì)P.gingivalis脂多糖進(jìn)行再純化，5 mgP.gingivalis脂多糖溶于1 mL含0.2% 三乙胺和0.5% 脫氧膽酸鈉無熱源性蒸餾水中，加入1 mL 9：1(v/v)苯酚水混合物，室溫下漩渦攪拌5 min，靜置5 min，把樣本靜置于冰上10 min，14 000 r/min離心2 min，收集上層水相，酚相加入1 mL含0.2%三乙胺和0.5% 脫氧膽酸鈉無熱源蒸餾水，按上述的方法重提1次，合并上層水相，再用9:1 (v/v)苯酚水混合物再抽提1次，加入終濃度為75% 無水乙醇和3 mM乙酸鈉， -20 ℃ 放置1 h使LPS沉淀下來，14 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，無熱源蒸餾水懸浮沉淀，蒸餾水透析懸浮的沉淀48 h，換水4～6次，真空冰凍干燥后4 ℃保存。

1.2.5 鑒定P.gingivalis-LPS

1.2.5.1 鱟實(shí)驗(yàn) 采用試管法凝膠鱟試劑檢測(cè)P.gingivalis-LPS和商品化E.coli-LPS活性。分別取1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL的各種脂多糖溶液0.1 mL與等量經(jīng)無熱源性水溶解的鱟試劑輕輕混均，37 ℃孵箱孵育1 h，1 h后讀取結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：緩慢將試管旋轉(zhuǎn)180°，管內(nèi)容物呈凝膠狀，堅(jiān)實(shí)，不變形，不脫出為陽(yáng)性(+)；管內(nèi)容物不呈凝膠狀或形成的凝膠狀物質(zhì)形狀不完整能從管壁滑落為陰性(-)。本實(shí)驗(yàn)以無熱源性水作為陰性對(duì)照，鱟試劑陽(yáng)性品作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5.2 紅外線光譜 稱取P.gingivalis-LPS2 mg，加入200 mg KBr粉末于紅外燈下在瑪瑙乳缽中充分研磨均勻，裝入壓片模具在抽真空狀態(tài)下以27 mPa的壓力壓制2 min,取出壓片，進(jìn)行紅外掃描測(cè)定，以商品化的E.coli-LPS(sigma)做參比。查看Satler標(biāo)準(zhǔn)光柵光譜的譜線索引對(duì)光譜圖進(jìn)行剖析。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.6.1P.gingivalis脂多糖刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 取生長(zhǎng)旺盛的HUVECs(存活率>95%)，用0.25% 胰蛋白酶消化，制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2 mL，5% CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞有90% 以上貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞3次。實(shí)驗(yàn)組T1組、T2組分別加入終濃度為1 μg/mL和10 μg/mL的P.gingivalis-LPS工作液。空白對(duì)照組，加入新鮮配制的RPMI-1640完全培養(yǎng)基2 mL，復(fù)種2孔，陽(yáng)性對(duì)照組加入終濃度為100 ng/mLE.coli-LPS工作液。按P.gingivalis-LPS刺激HUVECs時(shí)間又分為3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)：2、6、24 h。在2、6、24 h時(shí)，分別吸取上清液，-80 ℃冰箱凍存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6.2 ELISA法檢測(cè)IL-8和MCP-1蛋白含量 ① 建立標(biāo)準(zhǔn)孔：將標(biāo)準(zhǔn)品加入0.5 mL蒸餾水混均，配制成2000 pg/mL的溶液，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)管8管，每管加入標(biāo)本稀釋液300 μL，進(jìn)行對(duì)倍稀釋，第8管為空白對(duì)照。② 檢測(cè)：每孔加入樣本100 μL，將反應(yīng)板充分混均，封板，37 ℃孵育120 min，洗板。加入100 μL第一抗體工作液，混均， 37 ℃孵育60 min，洗滌。加入100 μL稀釋好的酶標(biāo)抗體，混均，37 ℃孵育30 min，洗滌。加入100 μL新鮮配制的底物工作液。加入100 μL反應(yīng)終止液，混均。30 min之內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀取各孔光密度值。

2 結(jié)果

2.1P.gingivalis菌株的培養(yǎng) 在BHI血瓊脂平板上，P.gingivalis呈圓形微隆的黑色光滑菌落；革蘭染色后鏡下見為紅色的球桿狀細(xì)菌。

2.2P.gingivalis-LPS的鑒定

2.2.1 鱟實(shí)驗(yàn)結(jié)果 提取的P.gingivalis-LPS具有較高的生物活性(≥15 ng/mL)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(見表1)。

表1P.gingivalis-LPS及E.coli-LPS鱟實(shí)驗(yàn)結(jié)果

組別LPS濃度(ng/mL)1005025201510521Pg-LPS+++++----E．coli-LPA+++++----陰性對(duì)照----------

陰性對(duì)照為等量的無熱源水。

2.2.2 LPS的紅外線光譜檢測(cè)P.gingivalis-LPS的紅外線光譜圖與E.coli-LPS比較相似(見圖1、2)，其中3400 cm-1及1630 cm-1處吸收峰為多聚-OH及-C-N=OH，提示為多糖及脂類成分。

2.3 不同濃度P.gingivalis-LPS刺激 HUVECs 表達(dá) IL-8水平的比較 T1組、T2組在2、6、24 h，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-8分泌水平升高且均高于陰性對(duì)照組，24 h表達(dá)量達(dá)到最高(P<0.05)。表明P.gingivalis-LPS刺激下，HUVECs表達(dá)IL-8水平上調(diào)(見表2)。

圖1 E.coli-LPS紅外線光譜圖

圖2 P.gingivalis ATCC33277 -LPS紅外線光譜圖

表2 不同濃度P.gingivalis-LPsS刺激HUVEC表達(dá)IL-8水平的比較

組別濃度(μg/mL)IL-8(pg/mL)2h6h24hT1組T2組E．coli-LPS陰性對(duì)照1100．1-945．400±72．627?1453．172±95．869?#1088．163±156．482582．523±142．1911121．188±137．161?1576．884±258．196?#1190．050±168．697758．049±70．9601348．288±204．066?1868．794±60．854?#1634．029±246．107875．532±14．362

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與T1組比較，#P<0.05。

2.4 不同濃度P.gingivalis-LPS刺激HUVECs表達(dá) MCP-1水平的比較 2 h時(shí)，T2組及陽(yáng)性對(duì)照組，HUVECs表達(dá)MCP-1水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，T1組與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；6、24 h時(shí)，T1、T2組及其陽(yáng)性對(duì)照組，HUVECs表達(dá)MCP-1水平高于陰性對(duì)照組(P<0.05)；T2組在2、6、24 h，HUVECs表達(dá)MCP-1的量均高于T1組(P<0.05)。表明在P.gingivalis-LPS刺激下，HUVECs的 MCP-1蛋白水平的表達(dá)上調(diào)(見表3)。

表3 不同濃度P.gingivalis-LPS刺激HUVECs表達(dá)MCP-1水平的比較

組別濃度(μg/mL)MCP-1(pg/mL)2h6h24hT1組T2組E．coli-LPS陰性對(duì)照1100．1-355．363±23．363521．511±77．643?#431．490±53．659320．391±12．433534．839±36．269?710．838±39．707?#523．267±73．346371．291±18．0481289．964±136．172?1591．473±138．767?#963．956±100．944796．960±32．508

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與T1組比較，#P<0.05。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究均提示，牙周炎并不是一種獨(dú)立的疾病，而是與心血管系統(tǒng)疾病、代謝綜合征、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病密切相關(guān)。但牙周炎與這些全身系統(tǒng)性疾病、尤其是心血管系統(tǒng)疾病相關(guān)的機(jī)制與生物學(xué)基礎(chǔ)目前尚不清楚。作為牙周炎最重要的致病菌—P.gingivalis常在深牙周袋上皮、齦下菌斑表面大量存在并造成牙周袋內(nèi)壁潰瘍、出血，P.gingivalis及其毒性產(chǎn)物—LPS可通過牙周袋內(nèi)壁破損處進(jìn)入血液循環(huán)，影響脈管系統(tǒng)宿主細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞。而血管內(nèi)皮細(xì)胞是As形成的關(guān)鍵細(xì)胞，其受多種因素刺激所導(dǎo)致的損傷和功能紊亂、進(jìn)而引發(fā)后續(xù)炎癥反應(yīng)正是As過程的起始。因此本實(shí)驗(yàn)將P.gingivalis-LPS作用于HUVECs。籍此探討P.gingivalis-LPS在As發(fā)生發(fā)展中的作用。

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分，由脂質(zhì)A、核心寡聚糖和O-特異性多糖側(cè)鏈組成，是P.gingivalis最重要的毒力因子之一。研究表明P.gingivalis-LPS化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)與經(jīng)典大腸桿菌脂多糖(E.coli-LPS,E-LPS)相似，僅生物學(xué)活性部分脂質(zhì)A磷酸化和堿基化形式有所不同[10]。本實(shí)驗(yàn)選用的P.gingivalis菌株是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33277，使用熱酚水法提取LPS。該方法提取的LPS中常見的污染物為核酸，用DNaseI和RNsaeH消化后提取的P.gingivalis-LPS，能夠最大限度的減少提取的LPS中殘存的核酸，再根據(jù)Manthey和Vlgel介紹的方法對(duì)P.gingivalis-LPS進(jìn)行純化。經(jīng)鑒定提取的P.gingivalis-LPS凝固鱟試劑活性與Ecoli-LPS相似，P.gingivalis-LPS紅外光譜也與Ecoli-LPS比較相似，表明該P(yáng).gingivalis-LPS與Ecoli-LPS具有相似的基本結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證P.gingivalis-LPS對(duì)HUVECs功能的影響，本研究分別選用了前期實(shí)驗(yàn)確定的LPS刺激濃度范圍內(nèi)較低(1 μg/mL)和較高(10 μg/mL)的兩種不同濃度的P.gingivalis-LPS刺激HUVECs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺激2、6、24 h 后，細(xì)胞表達(dá) IL-8蛋白水平隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，24 h時(shí)表達(dá)量最高；2 h時(shí)，高濃度P.gingivalis-LPS刺激細(xì)胞表達(dá) MCP-1蛋白水平與陰性對(duì)照組相比升高，6 h和24 h時(shí)，高濃度和低濃度P.gingivalis-LPS刺激細(xì)胞表達(dá) MCP-1蛋白水平均較陰性對(duì)照組高。本研究與Nassar等的研究結(jié)果相似，均顯示P.gingivalis-LPS能刺激HUVECs致其功能紊亂、表達(dá)趨化因子IL-8和MCP-1增加。IL-8和MCP-1是特異性中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化因子，可引起中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞聚集并在黏附分子的作用下黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，從而使后續(xù)的單核細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移并吞噬脂質(zhì)而成為泡沫細(xì)胞、As病損初步形成等成為可能。因此，我們推測(cè)，P.gingivalis-LPS對(duì)HUVECs的影響可能是P.gingivalis感染所致牙周炎與As相關(guān)的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。

目前已有研究表明，牙周主要致病菌P.gingivalis可根據(jù)其菌毛蛋白編碼基因fimA核苷酸序列的差異被分為6型(Ⅰ-Ⅴ型以及Ⅰb型)。其中，ⅡfimA型和ⅣfimA型菌株與重度牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是P.gingivalis的高毒力株，而ⅠfimA型菌株則為低毒力株。與此同時(shí)，流行病學(xué)研究顯示，與As相關(guān)的主要是重度牙周炎。那么，不同fimA型P.gingivalis菌株的LPS對(duì)HUVECs功能的影響有無差異、其作用的分子機(jī)制與信號(hào)通路等尚待進(jìn)一步研究闡明。

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[收稿2014-12-30;修回2015-03-03]

(編輯：譚秀榮)

Effects ofPorphyromonasgingivalislipopolysaccharide on the expressions of IL-8 and MCP-1 in HUVECs

HuLinlin,LinYuxiang,XiaoLi,LiXia,JiaHuijie,LiWenjun,GeSong

(Department of Periodontics,The Affiliated Dental Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To study the effects of lipopolysaccharide (LPS) fromPorphyromonasgingivalison the expressions of IL-8 and MCP-1 in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and discuss the possible role ofPorphyromonasgingivalisin the process of atherosclerosis.Methods Anaerobic method was employed forP.gingivalis(ATCC 33277).P.gingivalis-LPS was prepared by phenol-water methodsand then purified.P.gingivalis-LPS was assessed for their inductions of IL-8 and MCP-1 expressions in HUVECs. Enzyme linked immunosorbent assay was used to determine the protein expressions of IL-8 and MCP-1 in the culture supernatant of HUVECs at different time intervals (2, 6 and 24 h).Results Under the environments of our experiment,P.gingivalis-LPS increased the levels of IL-8 and MCP-1.Conclusion LPS ofPorphyromonasgingivaliscould stimulate HUVECs to express IL-8 and MCP-1.

P.gingivalis-LPS; HUVECs; IL-8; MCP-1

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:8126016)。

葛頌，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：牙周病學(xué)，E-mail:gesong007b@163.com。

R781.4

A

1000-2715(2015)02-0154-06