自組裝短肽RAD16-I在水溶液中對疏水性化合物的穩(wěn)定作用

唐富山，原凌燕，高冬芳，宋 鴻

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 臨床藥學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)護(hù)理學(xué)教研窒，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

技術(shù)與方法

自組裝短肽RAD16-I在水溶液中對疏水性化合物的穩(wěn)定作用

唐富山1，原凌燕2，高冬芳1，宋 鴻3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 臨床藥學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)護(hù)理學(xué)教研窒，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 研究自組裝短肽RAD16-I在水溶液中對疏水性化合物的穩(wěn)定作用。方法 觀察模式疏水性化合物芘在RAD16-I水溶液中于磁力攪拌下形成膠體混懸液的情形，以動態(tài)光散射激光粒度儀測定混懸液中粒子的粒度分布，以熒光分光光度法表征芘在與RAD16-I形成的膠體混懸液中的存在形式并考察當(dāng)此混懸液與卵磷脂(EPC)脂質(zhì)體混合時，其中芘向模擬細(xì)胞的卵磷脂(EPC)脂質(zhì)體的膜中釋放的可能性。結(jié)果 在機(jī)械攪拌下，芘在RAD16-I水溶液中能形成相對穩(wěn)定的混懸液，混懸液中粒子粒度為500～5000 nm，平均粒徑為1800 nm，芘的熒光發(fā)射光譜和激發(fā)光譜都表明，芘在此混懸液中以微晶形式存在；當(dāng)該混懸液與EPC脂質(zhì)體溶液混合時，芘以分子形式擴(kuò)散進(jìn)入EPC脂質(zhì)體膜中。結(jié)論 自組裝短肽RAD16-I能在水性體系中穩(wěn)定疏水性化合物，具有作為疏水性化合物和水難溶性藥物載體的潛力。

自組裝短肽；RAD16-I；疏水化合物；芘；熒光分光光度法

許多藥物的水中溶解度很低，在生理的水性體液系統(tǒng)中存在傳遞問題，因而限制了其在臨床的應(yīng)用。許多經(jīng)由高通量篩選出的活性化合物，由于溶解性能問題而無法進(jìn)一步開發(fā)[1]。因而，開發(fā)臨床可用的水難溶性藥物載體材料具有十分重要的意義。材料只有與疏水性藥物適當(dāng)?shù)叵嗷プ饔?，使得藥物在水溶液中保持相對穩(wěn)定，才能作為水難溶性藥物載體材料被開發(fā)。生物技術(shù)和生物材料在現(xiàn)代藥物載體材料開發(fā)中占有重要地位[2]，是現(xiàn)代藥物載體材料開發(fā)的特色領(lǐng)域。由于離子互補(bǔ)型自組裝短肽結(jié)構(gòu)序列中具有交替出現(xiàn)的親水和親脂性氨基酸殘基，其親水親油性適中，生物相容性和生物可降解性良好，而且可以相對容易地設(shè)計新的短肽或?qū)ΜF(xiàn)有短肽加以結(jié)構(gòu)修飾[3-4]，而這些都是藥物載體材料尤其是水難溶性藥物載體材料開發(fā)所希望的。已有報道[5-6]表明EAK16-II能夠在水溶液中穩(wěn)定芘的微晶并將芘以分子形式傳送到蛋黃卵磷脂(EPC)脂質(zhì)體的脂雙層膜中。

RAD16-I由系統(tǒng)替換EAK16-II中的帶電氨基酸并將電荷分布類型由II型變?yōu)镮型設(shè)計合成，在生物材料研究中比EAK16-II應(yīng)用更為廣泛。由于RAD16-I與EAK16-II一樣能夠在水溶液中形成β折疊的二級結(jié)構(gòu)[3]，可以預(yù)期其疏水性區(qū)域可以與疏水性化合物相互作用而其親水區(qū)域可以使疏水性化合物與短肽的復(fù)合體在水溶液中穩(wěn)定。而其RAD序列與細(xì)胞粘附位點的RGD序列的高度相似性也許可以提供較好的細(xì)胞粘附能力。因此，本文參考文獻(xiàn)[5]的方法，以芘為模型疏水性化合物，以EPC脂質(zhì)體模擬細(xì)胞膜，研究RAD16-I在水性體系中對疏水性化合物的穩(wěn)定作用。

1 儀器與試藥

熒光分光光度計，F(xiàn)-4500型，日立公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-2000型，上海亞榮生化儀器廠；動態(tài)光散射激光粒度儀，LB-550型，日本Horiba 公司；高速離心機(jī)，Allegra X-22R型，貝克曼公司；電子天平，0.1 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；超純水儀：Mini-Q，Millipore公司。

RAD16-I(PuraMatrixTM, Ac-RADARADARADARADA-CONH2, 1%w/v)，購自美國3DM公司；芘(Pyrene，PY)，購自Sigma Aldrich，臨用前用乙醇重結(jié)晶二次；雞蛋卵磷脂(Egg phosphatidylcholine ，EPC)，購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純，購自本地有關(guān)試劑公司；二次蒸餾去離子水，Milli-Q，通用于配制所用的水溶液。

2 實驗操作

2.1 芘晶體的膠體混懸液制備與粒度測定 取適量芘晶體粉末，置于10 mL的玻璃小瓶中，精確稱重，精密加入適當(dāng)體積的水，然后精密加入適當(dāng)體積提前超聲30 min[7]的1% RAD16-I溶液，制成芘的濃度為5.0×10-3M、RAD16-I的濃度為0.1 mg/mL (5.8×10-5M)的RAD-PY溶液。RAD -PY溶液在室溫下保持磁力攪拌，每天測定熒光發(fā)射光譜，溶液的熒光光譜在24 h之內(nèi)基本不隨時間變化時，則認(rèn)為達(dá)到平衡。不含RAD16-I的空白對照溶液以相同的步驟制備。

2.2 動態(tài)光散射測定混懸液中粒子粒度分布 上述磁力攪拌下制備的RAD16-I-PY混懸液于測定前劇烈振搖，取適量采用動態(tài)光散射激光粒度儀測定混懸液中粒子的粒度分布。

2.3 EPC脂質(zhì)體的制備 在1 L圓底燒瓶中加入約50 mL的EPC氯仿溶液(20 mg/mL)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)除去氯仿，在燒瓶底部形成一層薄膜，加入310 mL pH7.4的25 mMTris/乙酸緩沖液(含0.2 mM EDTA)，充分振搖后的混合液于超聲波清洗儀中在氮氣通入、0 ℃冰水浴上超聲30 min，其后于4 ℃、7000 rpm 離心1 h，收集上清液4 ℃儲存。

2.4 穩(wěn)態(tài)熒光測定 以日立F-4500熒光計測定不同狀態(tài)下芘的穩(wěn)態(tài)熒光。所有混懸液和溶液均分別置于4 mL比色皿中，通過直角光路測定其熒光光譜，而固體粉末芘晶體的熒光光譜則采用固體支架測定。所有樣品的發(fā)射光譜均在336 nm激發(fā)，在350 nm到650 nm測定；激發(fā)光譜分別在373 nm和470 nm發(fā)射波長測定。

3 結(jié)果

3.1 RAD16-I對芘的穩(wěn)定作用 芘的水中溶解度約為6.0×10-7M[8]；在有RAD16-I存在的條件下, 芘與水在磁力攪拌下形成相對穩(wěn)定的混懸液，初步表明自組裝短肽RAD16-I在水溶液中對芘(約5×10-3M)有一定的穩(wěn)定作用。不加肽的對照樣品中芘漂浮于液面或沉在底部，溶液在攪拌過程基本保持透明(見圖1)。動態(tài)光散射測定結(jié)果表明，自組裝短肽水溶液與芘形成的混懸液中粒子的粒度范圍在500～5000 nm，平均粒度為1800 nm(見圖2)，表明芘在水溶液中RAD16-I的作用下形成微晶形式存在的膠體混懸液。

A：芘晶體在水中;B:芘晶體在RAD16-I水溶液中形成膠體混懸液。

3.2 芘在不同存在形式下的熒光發(fā)射光譜 圖3分別表示不同狀態(tài)下芘的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜。圖3A、B所示的固體粉末芘的發(fā)射光譜與RAD-PY溶液中芘的發(fā)射光譜幾乎相同，都表現(xiàn)為峰位在475 nm左右的強(qiáng)熒光激基二聚體譜帶，而單體發(fā)射譜帶幾乎不可見。這進(jìn)一步表明，芘在與自組裝短肽形成的混懸液中是以微晶體形式存在。而圖3C、D所示的芘在EPC脂質(zhì)體中和在混合液中的發(fā)射光譜也非常相似。在EPC脂質(zhì)體溶液中和在混合液中芘的熒光發(fā)射光譜的I1/I3值都約等于1.1，這和已經(jīng)報道的脂質(zhì)體中芘的I1/I3值一致[9]，提示芘在混懸液與脂質(zhì)體的混合液中的存在形式與其在EPC脂質(zhì)體中相同，初步表明被水溶液中RAD16-I所穩(wěn)定的微晶形式的芘能夠釋放到模擬細(xì)胞的脂質(zhì)體的脂雙層膜中。

圖2 RAD16-I-PY混懸液中粒子粒度分布

A:固體芘晶體;B:RAD-PY混懸液;C:含芘的脂質(zhì)體;D：RAD-PY混懸液與脂質(zhì)體的混合液；激發(fā)波長336 nm。

3.3 芘在不同存在形式下的熒光激發(fā)光譜 圖4分別表示固體粉末、混懸液、EPC脂質(zhì)體溶液和混懸液與脂質(zhì)體的混合液中芘的穩(wěn)態(tài)熒光激發(fā)光譜。發(fā)射波長373 nm測得的激發(fā)光譜代表芘單體，而發(fā)射波長470 nm測得的激發(fā)光譜代表激基二聚體。如圖4 A和B所示，固體粉末中芘的激發(fā)光譜與RAD-PY混懸液中芘的激發(fā)光譜相似：在發(fā)射波長470 nm條件下測得的激發(fā)光譜比發(fā)射波長373 nm下測得的激發(fā)光譜紅移了約38 nm。這表明固體粉末和RAD-PY混懸液中的芘的激基二聚體均主要為“靜態(tài)激基二聚體”，這從另一角度表明芘在RAD-PY混懸液中與在固體粉末中的存在形式相同，即在在RAD-PY混懸液中芘以晶體狀態(tài)存在。而圖4 C和D表明，在含芘的EPC脂質(zhì)體溶液和脂質(zhì)體溶液與混懸液的混合液中芘的激發(fā)光譜相似，芘的激基二聚體主要為“動態(tài)態(tài)激基二聚體”，即2種溶液中均有大量分子形式的芘存在。這進(jìn)一步印證了比較發(fā)射光譜所得的推測：芘以微晶形式被RAD16-I穩(wěn)定在水性混懸液中，并能以分子形式向卵磷脂脂質(zhì)體膜釋放。

A：固體芘晶體；B：RAD-PY混懸液；C：含芘的脂質(zhì)體；D： RAD-PY混懸液與脂質(zhì)體的混合液；實線、虛線圖譜分別在發(fā)射波長373 nm、470 nm測得。

4 討論

選擇芘為模型疏水性化合物，是由于其在水中的溶解度極低，而且具有獨特的可作為介質(zhì)極性探針的熒光特性。芘在水溶液中RAD16-I的作用下形成微晶形式存在的膠體混懸液?？赡苁怯捎赗AD16-I具有穩(wěn)定的β折疊的二級結(jié)構(gòu)，其疏水面能夠吸附到芘的微晶上面，而親水面朝外使得較大量的芘能在水中相對穩(wěn)定地存在。

疏水性化合物必須首先通過細(xì)胞膜，才能到達(dá)細(xì)胞的其他疏水部位。因為細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)為脂質(zhì)雙分子層，為了相對近似地模擬藥物載體向目標(biāo)細(xì)胞傳送水難溶性藥物的過程，本文參考文獻(xiàn)[5]的方法以脂質(zhì)體模擬細(xì)胞，通過比較芘在固體粉末、混懸液、EPC脂質(zhì)體中和混懸液與脂質(zhì)體的混合液中的熒光光譜，考察疏水性化合物從自組裝短肽RAD16-I包裹中釋放的可能性。

芘通常是作為一種研究介質(zhì)極性的熒光探針，其穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜I1/I3值(熒光發(fā)射第一譜帶與第三譜帶強(qiáng)度之比)與介質(zhì)極性有較好的相關(guān)性。I1/I3在水中為1.8左右，通常隨溶液極性下降而減小。由于芘的激發(fā)單線態(tài)可以和基態(tài)芘分子碰撞形成激基二聚體，此二聚體在470～480 nm處有較強(qiáng)的熒光，常用來測定蛋白質(zhì)溶液的構(gòu)象變化[9]。芘的這種獨特的熒光特征在本文中用以表征芘在不同介質(zhì)中的存在形式以及芘從與自組裝短肽形成的混懸液釋放到脂質(zhì)體的可能性。芘的激基二聚體可以簡單地分為兩種，由基態(tài)二聚體直接激發(fā)所形成通?？煞Q為“靜態(tài)激基二聚體”，其激發(fā)光譜與單體激發(fā)光譜相比有一定波長的紅移；而來自于激發(fā)態(tài)芘單體與基態(tài)芘單體的自由碰撞所形成通常可稱為“動態(tài)激基二聚體”，其激發(fā)光譜與單體激發(fā)光譜的峰位重合[11-12]。對不同存在形式下芘的穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜和激發(fā)光譜的分析比較可以得出如下推論：在機(jī)械攪拌下，水溶液中的自組裝短肽RAD16-I對水難溶性的芘有分散作用，并能吸附到芘的微晶之上而形成相對穩(wěn)定的混懸液，芘在此混懸液中以被RAD16-I包裹的微晶形式存在；當(dāng)該混懸液與EPC脂質(zhì)體溶液混合時，被RAD16-I包裹的芘微晶能夠以分子形式擴(kuò)散進(jìn)入EPC脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子膜中。

本文的研究表明，RAD16-I發(fā)揮了膠體穩(wěn)定劑的作用，其自組裝形成的疏水面能夠吸附到芘的微晶上面，而親水面則朝外使得較大量的芘能在水中相對穩(wěn)定地存在。當(dāng)和EPC脂質(zhì)體混合時, 芘能從短肽包裹的芘的微晶體轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)體膜。這種穩(wěn)定、包裹和釋放能力加上離子互補(bǔ)型自組裝短肽相對優(yōu)良的生物相容性，使其具備作為疏水性化合物和水難溶性藥物載體的潛力。

在藥物開發(fā)研究中，選擇適合藥物特點的載體材料已經(jīng)成為近年來國內(nèi)外的主要研究熱點之一[13]。盡管本實驗表明了離子互補(bǔ)型自組裝短肽具有作為疏水性化合物載體的潛力。但離子互補(bǔ)性自組裝短肽開發(fā)為現(xiàn)實可用的水難溶性藥物載體還有許多問題需要解決。一方面需要深入研究自組裝短肽與疏水性化合物或難溶性藥物之間的相互作用，另一方面需要設(shè)計開發(fā)新的短肽、并進(jìn)一步降低短肽的合成成本或考慮自組裝短肽與其它材料的復(fù)合，這些都是自組裝短肽能夠真正被開發(fā)為可用藥物載體材料的必然要求。

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[收稿2014-11-14;修回2014-12-20]

(編輯：王福軍)

Effects of self-assembling peptide RAD16-I on stabilizing hydrophobic compounds in water

TangFushan1,YuanLingyan2,GaoDongfang1,SongHong3

(1.Department of Clinical Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Basic Nursity, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3.Department of Microbiology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To investigate effects of self-assembling peptide RAD16-I on stabilizing hydrophobic compounds in water.Methods Colloidal suspensions of model hydrophobic compound, pyrene, were prepared with the RAD16-I peptide in water under magnetic stirring; the particle size distribution in the suspension was characterized through dynamic light scattering, and the existence form of pyrene in the colloidal suspensions was characterized and the possibility of pyrene being transferred from the suspensions into membranes of phosphatidylcholine liposomes was detected through fluorescence spectrophotometry. Results Relatively stable suspension of pyrene, with average diameter about 1800 nm, can be formed with RAD16-I in water under magnetic stirring and took a form of microcrystal in the suspension, suggested by fluorescence emission and excitation spectra; when the suspension was mixed with phosphatidylcholine liposomes, pyrene microcrystals in the suspensions can be molecularly transferred into membranes of the liposomes. Conclusion The self-assembling peptide RAD16-I can stabilize pyrene in water, thus has the potential as carriers for hydrophobic compounds or drugs.

self-assembling peptide; RAD16-I; hydrophobic compound; pyrene;fluorescence spectrophotometry

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO: 31460246)；貴州省科技廳、遵義醫(yī)學(xué)院、遵義市科技局聯(lián)合基金計劃項目(NO:黔科合LH字[2014]7564)；遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金資助項目(NO: F-583)。

O641.2

A

1000-2715(2015)01-0092-05