大鼠羊水栓塞動(dòng)物模型制備方法的改進(jìn)

楊 陽(yáng)，沈 鑫，余 艦

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 司法醫(yī)學(xué)鑒定中心，貴州 遵義 563099)

技術(shù)與方法

大鼠羊水栓塞動(dòng)物模型制備方法的改進(jìn)

楊 陽(yáng)1，沈 鑫1，余 艦2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)學(xué)系，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 司法醫(yī)學(xué)鑒定中心，貴州 遵義 563099)

目的 改進(jìn)大鼠羊水栓塞動(dòng)物模型的制備方法。方法 將30只晚孕SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(NS組)、羊水原液組(AF組)、羊水胎糞液組(MAF組)。用改良的方法建立羊水栓塞模型，觀察大鼠呼吸、心率改變，取肺組織進(jìn)行HE染色、APM特殊染色和CK16免疫組織化學(xué)檢查。結(jié)果 AF組和MAF組肺組織特殊染色及免疫組化檢查均有陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，NS組未見(jiàn)。結(jié)論 改良后的方法操作簡(jiǎn)易、成功率高,是較為理想的建模方法。

羊水栓塞；動(dòng)物模型；APM；CK16

羊水栓塞(Amniotic Fluid Embolism，AFE)是產(chǎn)科最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)病罕見(jiàn)、死亡率高，確切的發(fā)病機(jī)制尚未清楚。制備動(dòng)物模型模擬人類AFE發(fā)病可為臨床早期診斷、提前干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)在既往大鼠AFE模型制備方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，力圖摸索出更接近人體且簡(jiǎn)易的建模方法。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性SD孕鼠30只，胎齡20 d，體重280～400 g，由遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。根據(jù)注入液體的性質(zhì)不同隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(NS組)10只、羊水原液組(AF組)10只、羊水胎糞液組(MAF組)10只。Alcian blue 8GX(生工生物工程股份有限公司)，phloxine B(上海晶純生化科技股份有限公司)，Martius yellow(東京化成工業(yè))，兔抗鼠細(xì)胞角蛋白16(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2 手術(shù)操作 術(shù)前12 h禁食，自由飲水。用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔麻醉，麻醉生效后眼眶取血1 mL(見(jiàn)圖1A)。將孕鼠固定于手術(shù)臺(tái)，備皮，取下腹正中切口3 cm，行子宮次全切除術(shù)，分離下腔靜脈和腹主動(dòng)脈備用(見(jiàn)圖1B)。

1.3 羊水收集 將切下的子宮輕輕置于濕紗布上，切勿用力牽拉，避免子宮靜脈破裂，導(dǎo)致血混入羊水中。一手托住子宮，一手持注射器針頭在無(wú)血管紋路處輕輕劃破子宮壁和胎膜，讓羊水順勢(shì)流入收集管內(nèi)(見(jiàn)圖1C)。若羊水粘稠可換用大號(hào)注射器抽吸。

1.4 制備羊水胎糞液 取出胎鼠，剪開(kāi)腹壁，輕輕擠壓出胎腸，用1 mL注射器抽吸羊水后注入腸腔內(nèi)將胎糞沖洗至收集管中(見(jiàn)圖1D)，用微量加樣器配置1%羊水胎糞液。

1.5 制備栓塞模型 以0.25 mL/100 g劑量從大鼠下腔靜脈分別注入相應(yīng)液體：NS組(生理鹽水)、AF組(羊水原液)、MAF組(1%羊水胎糞液)(見(jiàn)圖1E)。注入后紗布按壓止血，觀察60 min后用5 mL注射器經(jīng)腹主動(dòng)脈取血3 mL(見(jiàn)圖1F)。若觀察期間大鼠死亡，可立即經(jīng)腹主動(dòng)脈取血。10%KCL處死大鼠，取肺組織固定于10%甲醛溶液中。

A:眼眶取血；B：分離下腔靜脈(1)、腹主動(dòng)脈(2)；C：取羊水；D：取胎糞；E：下腔靜脈注入實(shí)驗(yàn)液體；F：腹主動(dòng)脈取血。

2 檢測(cè)指標(biāo)

監(jiān)測(cè)大鼠在觀察期間呼吸、心率的改變。肺組織進(jìn)行HE染色、阿爾辛藍(lán)-熒光桃紅-馬休黃特殊染色(APM)和細(xì)胞角蛋白(CK16)免疫組織化學(xué)檢查，驗(yàn)證模型是否成功。

3 結(jié)果

3.1 臨床表現(xiàn)及取材 AF組與MAF組注入實(shí)驗(yàn)液體后呼吸頻率逐漸降低，幅度變淺；心率先加快后減慢。3組大鼠均成功收集到血液、羊水及胎糞液。

3.2 HE染色 AF組與MAF組大鼠肺間質(zhì)明顯增寬，均有不同程度充血、水腫，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺小血管可見(jiàn)到淡染的不定形物質(zhì)，NS組未見(jiàn)(見(jiàn)圖2)。

A：NS組；B：AF組；C：MAF組。

3.3 APM染色 AF組與MAF組肺小血管中的不定形物質(zhì)(羊水黏液)被染成藍(lán)色，角化鱗狀上皮染成桃紅色，NS組未見(jiàn)(見(jiàn)圖3)。

A:AF組；B:MAF組。

3.4 CK16免疫組織化學(xué)染色 AF組與MAF組肺小血管中可見(jiàn)染成棕黃色，顆粒狀或絲狀的鱗狀上皮，NS組未見(jiàn)(見(jiàn)圖4)。

A:AF組；B:MAF組。

4 討論

在AFE的研究中學(xué)者們嘗試用不同物種及不同條件制作模型，早期的研究是將人類羊水注入未孕的雌性動(dòng)物體內(nèi)[1]，其中部分動(dòng)物出現(xiàn)AFE癥狀，部分動(dòng)物沒(méi)有類似表現(xiàn)?？紤]到存在種屬間差異性，后期建模多選用晚期妊娠的動(dòng)物并且注入它們自身的羊水，不但提高了模型的成功率，也增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說(shuō)服力。近年來(lái)動(dòng)物模型多選用兔和大鼠，其中嚙齒類動(dòng)物與人類遺傳物質(zhì)有90%以上的同源性，且大鼠繁殖率高，可重復(fù)性好，是AFE較為合理的模型選擇。

盡管多數(shù)實(shí)驗(yàn)都使用大鼠建立AFE動(dòng)物模型，但暫無(wú)完整的文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組在歷年AFE發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，既往報(bào)道的建模方法存在不足之處，實(shí)踐操作較為復(fù)雜且動(dòng)物死亡率高。經(jīng)不斷摸索，對(duì)傳統(tǒng)的建模方法進(jìn)行以下改進(jìn)。

4.1 術(shù)前取血 報(bào)道中為監(jiān)測(cè)外周血液動(dòng)力學(xué)變化，多行頸總動(dòng)脈插管術(shù)，后經(jīng)動(dòng)脈導(dǎo)管取血[2]。該項(xiàng)操作為防止導(dǎo)管內(nèi)血液凝固通常需提前將導(dǎo)管肝素化，而肝素化的血液可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)前選擇眼眶取血效果更好，眼球血運(yùn)豐富，取血后按壓可迅速止血且創(chuàng)傷小。

4.2 配制羊水胎糞液 既往的方法多為取出胎鼠直腸，輕輕擠壓出胎糞或是直接碾磨腸管組織[3]。該項(xiàng)操作的可行性不高，經(jīng)過(guò)測(cè)量，胎鼠腸管直徑為0.05～0.10 cm，質(zhì)脆，擠壓易斷裂，所以用擠壓的方法收集胎糞是不合理的。碾磨法，即使將碾磨液高速離心取上清液，液體的成分也與胎糞相差甚遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)使用1 mL注射器抽取羊水直接注入腸腔，可將胎糞沖洗出來(lái)。當(dāng)羊水粘稠時(shí)，可用生理鹽水替代。通常一只胎鼠可取出10～20 μL胎糞。配置1%羊水胎糞液(原始文獻(xiàn)未詳)改用微量加樣器對(duì)羊水和胎糞進(jìn)行等比例混合，比以往將胎糞干燥后稱重再與羊水混合更加精確、省時(shí)。

4.3 注入實(shí)驗(yàn)液體 報(bào)道中通常是經(jīng)股靜脈和尾靜脈注入羊水及羊水胎糞液[4-5]，經(jīng)改良我們選取下腔靜脈。首先，可利用腹部同一切口，避免再次切開(kāi)分離，減少損傷、縮短手術(shù)操作時(shí)間。其次，AFE發(fā)生時(shí)，羊水通過(guò)開(kāi)放的靜脈竇進(jìn)入子宮，經(jīng)髂靜脈匯入下腔靜脈，最后到達(dá)右心房進(jìn)入肺循環(huán)。下腔靜脈注入羊水可高度模仿人體羊水進(jìn)入機(jī)體的循環(huán)通路。最后，下腔靜脈是體內(nèi)最大的靜脈，操作較方便，成功率高。

4.4 術(shù)后取血 報(bào)道中多通過(guò)頸動(dòng)脈導(dǎo)管取血或是大動(dòng)脈離斷取血[2]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一些大鼠在注入羊水過(guò)程中或注入羊水后可突發(fā)呼吸、循環(huán)衰竭，外周血管快速坍塌，及時(shí)的心外按壓也很難搶救成功。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，頸動(dòng)脈導(dǎo)管取血法在大鼠突發(fā)死亡時(shí)成功取血率較低，立刻心臟穿刺取血得到的血量也很少。在我們既往實(shí)驗(yàn)中對(duì)突發(fā)死亡的大鼠采用心臟取血，取血量為0.5～1.0 mL。大動(dòng)脈離斷取血受外界影響較大，也不可取。改進(jìn)后我們選取與下腔靜脈伴行的腹主動(dòng)脈，可在分離下腔靜脈時(shí)同時(shí)分離出腹主動(dòng)脈，該動(dòng)脈較大，取血方便，甚至可在大鼠突發(fā)死亡時(shí)迅速取血。實(shí)驗(yàn)中對(duì)建模成功的大鼠通常可按要求取到3mL以上血液，突發(fā)死亡的大鼠及時(shí)取血也能取到2 mL，明顯提高取血的成功率。

AFE最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)是突發(fā)的急性肺損傷、低血壓、心臟驟停和DIC等，實(shí)驗(yàn)中大鼠注入羊水及羊水胎糞液后可出現(xiàn)不同程度的心肺衰竭癥狀，與臨床相符。

隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)多種免疫學(xué)因子與AFE密切相關(guān)，如STN抗原、補(bǔ)體C3、白三烯及白細(xì)胞介素等。但這些發(fā)現(xiàn)尚存在局限性，未能解釋AFE發(fā)生發(fā)展的全部過(guò)程，僅限于實(shí)驗(yàn)研究階段。目前法醫(yī)學(xué)AFE的診斷主要依靠尸檢肺組織病理學(xué)檢查，在肺小血管中找到胎兒有形物質(zhì)?？紤]到HE染色缺乏特異性，不能明確組織的來(lái)源。國(guó)內(nèi)學(xué)者[6]用?PM對(duì)AFE病例進(jìn)行染色，阿爾辛藍(lán)能將羊水中嗜酸性的黏液成分染成藍(lán)色，熒光桃紅可將角化的鱗狀上皮染成桃紅色，馬休黃用于分色及增色，使視野更加清晰、鮮明。Wang等人[7]同時(shí)對(duì)AFE及羊水吸入綜合征(amnioticuid aspiration ，AFA)死亡病例進(jìn)行肺組織APM染色，分別在AFE患者的肺小血管及AFA患兒支氣管中發(fā)現(xiàn)染成同樣顏色的羊水成分。且APM染色對(duì)少量羊水入血的病例也有較高的敏感性，可用于法醫(yī)學(xué)中疑似AFE病例的診斷，減少漏診及誤診率。

CK16表達(dá)于角化和增生的鱗狀上皮內(nèi)，肛管、足底、舌和食道常見(jiàn)，而羊水中的角化鱗狀上皮大多來(lái)源于胎兒皮膚的表層上皮[9]。于家華[9]在研究中發(fā)現(xiàn)AFE死亡患者肺組織與正常人體皮膚中CK16均有陽(yáng)性表達(dá)，推測(cè)該鱗狀上皮來(lái)源于表層皮膚。趙敏等人[10]研究不同劑量羊水進(jìn)入大鼠體內(nèi)后CK16的表達(dá)變化，觀察到隨著羊水入血量的增加，肺CK16陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，且染色更深。認(rèn)為CK16可作為AFE客觀的診斷指標(biāo)。因此我們聯(lián)合APM染色和CK16免疫組織化學(xué)檢查可以綜合性的鑒別肺血管中的物質(zhì)是否來(lái)源于羊水，由此驗(yàn)證動(dòng)物模型是否建立成功。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，改進(jìn)后的建模方法具有損傷小，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、成功率高等優(yōu)點(diǎn)，是一種值得推廣的大鼠AFE模型制備方法。

[1] Steven L, Clark M D. Amniotic Fluid Embolism[J]. Obstetrics & Gynecology,2014,123(2):337-348.

[2] 李成博,唐慧君.大鼠羊水栓塞時(shí)的內(nèi)皮素-1的含量及其作用的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28(1):20-24.

[3] 劉云梅,戰(zhàn)云,王新云,等.IL-8在大鼠羊水栓塞發(fā)病機(jī)制中的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(9):1370-1371.

[4] 侯志剛,宋子亨,趙敏,等.羊水栓塞孕鼠血清類胰蛋白酶的變化及意義[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,34(4):407-412.

[5] 盧穎州,高謀.孕鼠羊水栓塞補(bǔ)體C3、C4和B因子的動(dòng)態(tài)變化及意義[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志,2014,15(3):220-222.

[6] 劉良,汪嵐.阿爾辛藍(lán)-熒光桃紅-馬休黃染色在羊水栓塞病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中華病理學(xué)雜志,2003,32(3):263-264.

[7] Wang J J,Lai Q, Pan H Y,et al. Evaluation of specinc marker CK13 and CK10/13 Combined with APM staining for the diagnosis of amniotic fluid embolism and aspiration[J]. Forensic Science International, 2014,May,238: 108-112.doi:10.1016/j.forsclint.2014.02.032.

[8] Sesterhenn A M, Mandic R, Dunne A A, et al.Cytokeratins 6 and 16 are frequently expressed in head and neck squamous cellcarcinoma cell lines and fresh biopsies[J]. Anticancer Res, 2005, 25(3): 2675-2680.

[9] 于家華, 吳國(guó)民, 周玲. 抗角蛋白單克隆抗體用于羊水栓塞病例病理診斷的研究[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2004, 8(6): 29-33.

[10] 趙敏, 張國(guó)棟, 余艦. 實(shí)驗(yàn)性大鼠羊水栓塞角蛋白16表達(dá)的變化及意義[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 32(17): 2750-2751.

[收稿2014-11-24;修回2014-12-28]

(編輯：王福軍)

Technique improvement on animal model of amniotic fluid embolism in rats

YangYang1，ShenXin1，YuJian2

(1.Department of Forensic Pathology,Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China；2.The Forensic Medicine Center of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To improve the preparation method of animal model of amniotic fluid embolism in rats. Methods 30 late pregnancy SD rats were randomly divided into control group (NS), amniotic fluid group (AF) and the mixture of amniotic fluid meconium group (MAF). Modified methods was used to form amniotic fluid embolism model; to observe the breath and heart rate of rats; lung tissues were collected for HE staining, APM staining and CK16 immunohistochemistry. Results The HE staining, APM staining and CK16 immunohistochemistry study revealed positive in the lung tissues of both AF group and MAF group, but did not show in NS group. Conclusion The modified method was easier to operate and with high success rate, it is an ideal modeling method for amniotic fluid embolism in rats.

amniotic fluid embolism; animal model;APM;CK16

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字[2012]2358)。

余艦，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：羊水栓塞發(fā)病機(jī)制，E-mail:783065265@qq.com。

R714.46

A

1000-2715(2015)01-0097-04