百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林、氯吡格雷聯(lián)用對(duì)家兔血小板聚集的影響

徐 露 ，張?zhí)?/p>

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重慶市中醫(yī)院 科技教育外事處， 重慶 400021)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林、氯吡格雷聯(lián)用對(duì)家兔血小板聚集的影響

徐 露1，張?zhí)?

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2.重慶市中醫(yī)院 科技教育外事處， 重慶 400021)

目的 觀察百裕銀杏內(nèi)酯注射液分別與阿司匹林、氯吡格雷聯(lián)用后對(duì)家兔血小板聚集的影響。方法 觀察各組對(duì)AA、ADP及PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集作用的影響,以及PAF誘導(dǎo)下血小板超微結(jié)構(gòu)和PF-4和β-TG水平的變化。結(jié)果 百裕銀杏內(nèi)酯注射液分別與阿司匹林、氯吡格雷聯(lián)用后，均能抑制PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集，減少聚集型血小板數(shù)量使樹突型血小板突起變少變短，并使得PF-4和β-TG表達(dá)降低。結(jié)論 百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林、氯吡格雷聯(lián)用后，起到拮抗PAF誘導(dǎo)的血小板聚集的協(xié)同作用。

百裕銀杏內(nèi)酯；血小板；PAF

百裕銀杏內(nèi)酯注射液主要由銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯組成，兩者是銀杏活血化瘀的主要有效成分。目前已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯能明顯抑制PAF介導(dǎo)的血小板的聚集，證明了其為PAF受體拮抗劑[1]。但是，很多實(shí)驗(yàn)只是用單一的藥物來(lái)研究，沒有同步采用幾種藥物聯(lián)用的方法來(lái)比較作用靶點(diǎn)及作用強(qiáng)弱的差異。由于藥物聯(lián)用抗血

小板聚集的治療方法已在臨床上廣為使用，因此本文就幾種臨床上常用的抗血小板聚集藥物聯(lián)用后對(duì)不同誘導(dǎo)劑下的抗血小板聚集效果進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取40只健康日本大耳兔，雌雄各半，體重(2.0±0.2)kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：XCXK(渝)20090001]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 百裕銀杏內(nèi)酯注射液(成都百裕制藥,批號(hào)：20120303)，阿司匹林(拜耳公司，批號(hào)：120504)氯吡格雷(賽諾菲制藥公司，批號(hào)：1A751)。

1.3 試劑和儀器 將花生四烯酸(AA)(sigma,批號(hào)：A9689)溶解在1%碳酸鈉溶液中，終濃度為0.35 mmol/L；用磷酸鹽緩沖液溶解ADP(sigma，批號(hào)：A2894),最終濃度為300 μmol/L；用pH為7.6的Tris-NaCl溶液溶解血小板活化因子(PAF)(cayman，批號(hào)：012328)，使得PAF終濃度為3.6 nmol/L，再加入小牛血清蛋白，使其濃度為0.25%；蒸餾水溶解枸櫞酸鈉(北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號(hào)：20130117)配成3.8%的濃度；兔血小板因子4(PF-4)ELISA試劑盒(FOCUS，批號(hào)：20130301)；兔β-血小板球蛋白(β-TG)ELISA試劑盒(FOCUS，批號(hào)：20130224)。多功能智能血液凝聚儀TYXN-96(上海通用技術(shù)研究所研制)；S-3000N掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；酶標(biāo)儀ELX-800(美國(guó)寶特公司)。

1.4 分組及給藥方法 40只日本大耳白兔，采用隨機(jī)數(shù)字表的方法，完全隨機(jī)分為4組，每組10只，分為：①生理鹽水組;②百裕銀杏內(nèi)酯與阿司匹林聯(lián)用組;③百裕銀杏內(nèi)酯與氯吡格雷聯(lián)用組;④阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)用組。百裕銀杏內(nèi)酯注射劑按照0.51 mL/kg的劑量iv給藥，阿司匹林和氯吡格雷分別以5.13 mg/kg與3.85 mg/kg的劑量灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。

1.5 血小板聚集率的檢測(cè) 給藥7 d后，家兔心臟取血10.5 mL，分出1.5 mL全血于4 ℃靜置4 h得血清，其余9 mL全血用3.8%枸櫞酸鈉以1∶9的比例抗凝，離心機(jī)以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心，離心10 min后留取上清液，得到富血小板血漿(PRP)，再?gòu)腜RP取出100μL進(jìn)行電鏡檢測(cè)，其余PRP用于血小板聚集率的檢測(cè)；剩余的血漿再以3 000 r/min速度離心15 min，留取上清液，得到貧血小板血漿(PPP)。用PPP對(duì)PRP進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得血小板數(shù)目為360×109/l。用1 μL AA、ADP及PAF進(jìn)行誘導(dǎo)，測(cè)定1 min、5 min及最大血小板聚集率，計(jì)算血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率的計(jì)算方法為：(生理鹽水組MAX血小板聚集率-測(cè)驗(yàn)組MAX血小板聚集率)/生理鹽水組MAX血小板聚集率×100%。

1.6 血小板的電鏡觀察 向硅化EP管中注入100 μL PRP，加入1 μL的PAF對(duì)血小板聚集進(jìn)行誘導(dǎo)，15 min后，將PRP滴注于鋪有方華膜的銅網(wǎng)上，于37 ℃下孵育10 min，超純水沖洗后，加入3%戊二醛固定5 min，超純水再次沖洗，待銅網(wǎng)上標(biāo)本干燥后，在其表面噴一層厚度為20 nm的金膜，S-3000N電子顯微鏡掃描細(xì)胞形態(tài)，隨機(jī)找到100個(gè)血小板進(jìn)行觀察，計(jì)算各型血小板比例。電鏡下的血小板形態(tài)主要有4種：①圓形：圓或橢圓，體積較小而均一，核大，中央密，周邊透明帶低窄；②樹形：從中央致密區(qū)發(fā)出了單個(gè)或多個(gè)足突，呈片狀或細(xì)長(zhǎng)狀，有的有分枝；③展平形：中央核心致密且外圍透明帶寬，周邊光滑或有突起；④聚集形：數(shù)個(gè)至幾十個(gè)血小板聚集形成，大小不一，血小板相互連接或融合為一體，外周部血小板可見明顯足突。

1.7 測(cè)定血清中PF-4和β-TG的含量水平 將1 μL的PAF加入到1.5 mL全血中，誘導(dǎo)PF-4及β-TG釋放，全血于4 ℃靜置4 h得到上層血清，取200 μL血清進(jìn)行檢測(cè)。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取。

2 結(jié)果

2.1 血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 AA誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在AA誘導(dǎo)下，所有組別的最大血小板聚集率(血小板分析儀所顯示)與生理鹽水組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林聯(lián)用后，其PLT抑制率與阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)用后對(duì)血小板聚集抑制率相近(見表1)。

組別給藥劑量1min5minMAXPLT聚集抑制率(%)生理鹽水2mL33．45±5．8966．53±9．6167．14±11．220．00%百裕+阿司匹林0．51mL/kg+5．13mg/kg36．29±6．1736．43±6．5742．85±7．07??36．17%百裕+氯吡格雷0．51mL/kg+3．85mg/kg38．23±6．7440．13±6．3055．02±6．95?18．05%阿司匹林+氯吡格雷5．13mg/kg+3．85mg/kg24．06±5．11??37．14±5．60??41．44±6．29??38．28%

與生理鹽水組比較，**P<0.01，*P<0.05。

2.1.2 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在ADP誘導(dǎo)下，除了百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林聯(lián)用組以外，所有組別的最大血小板聚集率與生理鹽水組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

組別給藥劑量1min5minMAXPLT聚集抑制率(%)生理鹽水2mL35．83±5．7464．44±9．2566．98±10．350．00%百裕+阿司匹林0．51mL/kg+5．13mg/kg40．83±6．7257．14±6．6262．08±6．557．32%百裕+氯吡格雷0．51mL/kg+3．85mg/kg42．57±6．4241．41±6．8051．06±6．61??23．76%阿司匹林+氯吡格雷5．13mg/kg+3．85mg/kg24．06±5．11??37．12±5．60??41．44±6．29??38．13%

與生理鹽水組比較，**P<0.01。

2.1.3 PAF誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在PAF誘導(dǎo)下，除了阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)用組外，所有組別的最大血小板聚集率與生理鹽水組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林聯(lián)用組的PLT抑制率最高(52.01%，見表3)。

組別給藥劑量1min5minMAXPLT聚集抑制率(%)生理鹽水2mL36．75±6．1668．43±9．1170．24±11．450．00%百裕+阿司匹林0．51mL/kg+5．13mg/kg31．34±6．5932．65±7．26??33．70±7．62??52．01%百裕+氯吡格雷0．51mL/kg+3．85mg/kg40．40±7．3941．52±7．32??42．29±7．58??39．77%阿司匹林+氯吡格雷5．13mg/kg+3．85mg/kg35．60±6．0865．46±9．5566．37±9．505．51%

與生理鹽水組比較，**P<0.01。

2.2 血小板電鏡檢測(cè)結(jié)果 通過2000倍掃描電鏡，呈現(xiàn)出4種血小板形態(tài)：圓形、樹形、展平形和聚集形。在PAF誘導(dǎo)下，百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林、氯吡格雷聯(lián)用組，血小板大小比較一致，表面比較光滑，較少見到聚集型血小板。生理鹽水組的血小板發(fā)生強(qiáng)烈激活，表現(xiàn)為：血小板粘附力變強(qiáng)，有的血小板可粘附紅細(xì)胞；血小板體積增大、形態(tài)不規(guī)則；呈芽孢狀突出的偽足增多；聚集形血小板數(shù)量增多。阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)用組血小板大小不一，表面有偽足，聚集型血小板較多(見表4，圖1)。

組別血小板形態(tài)(%)圓形樹形展平形聚集形生理鹽水3．4±0．87．6±2．612．0±3．277．0±18．5百裕+阿司匹林34．0±11．5??14．7±9．2?23．6±8．2??27．7±12．5??百裕+氯吡格雷35．9±11．7??20．4±9．5??15．3±8．628．4±10．7??阿司匹林+氯吡格雷4．8±1．011．3±4．720．6±6．5??63．3±16．0

與生理鹽水組比較，**P<0.01，*P<0.05。

A：生理鹽水組;B：百裕+阿司匹林組; C：百裕+氯吡格雷組;D：阿司匹林+氯吡格雷組。

2.3 血小板PF-4和β-TG檢測(cè)結(jié)果 與生理鹽水組相比，百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林、氯吡格雷聯(lián)用組PF-4水平顯著降低(P<0.01)，β-TG水平也顯著降低(P<0.01)。PF-4和β-TG水平降低，說(shuō)明血小板釋放功能受到抑制(見表5)。

組別PF-4(μg/mL)β-TG(μg/mL)生理鹽水1．748±0．2861．735±0．276百裕+阿司匹林1．254±0．169??1．216±0．134??百裕+氯吡格雷1．268±0．151??1．242±0．150??阿司匹林+氯吡格雷1．631±0．2451．652±0．243

與生理鹽水組比較，**P<0.01。

3 討論

如今中國(guó)逐漸步入老齡化，血栓栓塞性疾病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。在防治各種血栓相關(guān)的疾病方面，抗血小板聚集藥物發(fā)揮著非常重要的作用。

血小板首先被激活是血栓形成的關(guān)鍵及始動(dòng)機(jī)制，只有激活的血小板才會(huì)發(fā)生聚集隨后形成血栓。血小板激活的誘導(dǎo)劑及途徑較多，主要有：PAF、AA、ADP、5-羥色胺(5-HT)、前列腺素G2、CaCl2、前列腺素H2等[2]。臨床最常見及重要的抗血小板途徑有以阿司匹林為代表的AA途徑、以氯吡格雷為代表的ADP途徑及銀杏內(nèi)酯為代表的PAF途徑[3]。聯(lián)用抗血小板藥治療能夠不同程度降低血小板聚集情況。目前已有研究證實(shí)阿司匹林和氯比格雷聯(lián)用對(duì)抗血小板聚集,具有協(xié)同作用[4]。阿司匹林主要通過抑制環(huán)氧化酶(COX),不可逆地抑制血小板血栓A2(TXA2)的合成[5]。氯比格雷通過改變血小板膜結(jié)構(gòu),阻斷纖維蛋白原與膜上糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的相互作用，從而抑制ADP誘發(fā)的血小板聚集[6]。之前本課題組已做了研究，證實(shí)百裕銀杏內(nèi)酯主要是通過PAF途徑發(fā)揮抗血小板聚集作用的，無(wú)ADP拮抗作用，該結(jié)果與報(bào)道相一致[7]。

通過前期我們進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)[8]，我們發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)斡?.51mL/kg劑量的百裕銀杏內(nèi)酯注射液對(duì)AA、ADP及PAF的PLT抑制率分別為25.51%、13.87%和39.18%，通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)：當(dāng)百裕銀杏內(nèi)酯與阿司匹林聯(lián)用后，顯著提高了AA及PAF誘導(dǎo)下的血小板聚集抑制率；當(dāng)百裕銀杏內(nèi)酯和氯吡格雷聯(lián)用后，顯著提高了ADP及PAF誘導(dǎo)下的血小板聚集抑制率；說(shuō)明當(dāng)PAF誘導(dǎo)后，百裕銀杏內(nèi)酯與阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)用均能起到協(xié)同作用，更能同時(shí)有效地拮抗PAF引起的血小板聚集情況，使抗血小板效果更為顯著，另外明顯地減少了電鏡下激活的血小板細(xì)胞數(shù)量。

同為血小板特異蛋白的PF-4(血小板第4因子)和β-TG(血小板血栓球蛋白)，存在于血小板的α顆粒內(nèi)。當(dāng)某種因素刺激血小板時(shí)，血小板被激活釋放出PF-4和β-TG[9]。血小板被激活時(shí)，β-TG高值和β-TG/PF-4比率升高；β-TG和PF-4同時(shí)升高時(shí)，試管內(nèi)(in vitro)血小板被激活的可能性較大[10]。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，百裕銀杏內(nèi)酯與其他藥物聯(lián)用后均對(duì)PAF誘導(dǎo)后的血小板PF-4和β-TG水平有明顯的抑制作用，且β-TG/PF-4比率較低，而單獨(dú)聯(lián)用阿司匹林和氯吡格雷卻無(wú)此作用，該組β-TG和PF-4同時(shí)升高，說(shuō)明出現(xiàn)了試管內(nèi)血小板被激活的情況。

本基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究，對(duì)臨床的抗血小板藥物的選擇及應(yīng)用有重要的價(jià)值：在臨床上，病人往往因?yàn)槟承┭ㄐ约膊⌒枰L(zhǎng)期服用阿司匹林和氯吡格雷，當(dāng)兩者聯(lián)用后能有效抑制AA和ADP途徑引起的血小板聚集情況。但是，有一部分病人會(huì)出現(xiàn)抵抗現(xiàn)象，使用阿司匹林和氯吡格雷無(wú)效，這可能與AA和ADP受體長(zhǎng)期受到抑制后，受體上調(diào)，降低藥物敏感性相關(guān)。當(dāng)選用阿司匹林或氯吡格雷所產(chǎn)生的抗凝作用不明顯的時(shí)候，因百裕銀杏內(nèi)酯的抗血小板作用途徑不同于阿司匹林及氯吡格雷，可以考慮通過PAF途徑進(jìn)行治療。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了百裕銀杏內(nèi)酯注射液與阿司匹林和氯吡格雷聯(lián)用后，其抗PAF誘導(dǎo)的血小板聚集效應(yīng)明顯，可作為臨床用藥參考。PAF途徑的藥物研發(fā)為臨床上抗血小板聚集用藥提供了更多的機(jī)會(huì)。

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[收稿2014-10-17;修回2014-12-02]

(編輯：譚秀榮)

The effects of bai yu ginkgolide injection combined with aspirin,clopidogrel on platelet aggregation and ultra structure changes

XuLu1,ZhangTaijun2

(1.The Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology in Chongqing Medical University,Chongqing 400016，China；2.GCP department in Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Chongqing 400020,China)

Objective To observe the effects of bai yu ginkgolide injection combined with aspirin,clopidogrel on platelet aggregation in rabbits.Methods In vitro experiments,arachidonic acid (AA), adenosine diphosphate (ADP) and platelet activating factor (PAF) induced platelet aggregation PAF also induced ultra-structure alterations.The platelet factor 4 (PF-4) and β-thromboglobulin (β-TG) levels were measured.Results bai yu ginkgolide injection combined with aspirin,clopidogrel could inhibit PAF-induced platelet aggregation, reduce the number of aggregation-type platelets, result in fewer and shorter dendritic platelets after PAF and reduce the levels of PF-4 and β-TG significantly(P<0.01).Conclusion bai yu ginkgolide injection combined with aspirin,clopidogrel could produce cooperative effects to prevent PAF-induced platelet aggregation.

bai yu ginkgolide injection;platelet;PAF need one more time correction

重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：cstc2012jjA10137)。

張?zhí)?，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中藥制劑與臨床，E-mail:4345422@qq.com。

R446.1

A

1000-2715(2015)01-0025-04