產苦馬豆素瘋草內生真菌Undifilum oxytropis原生質體的制備和再生

張蕾蕾，余永濤，何生虎，趙清梅，葛 松

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川750021；2.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川750021；3.國家民委發(fā)酵釀造工程生物技術重點實驗室，寧夏銀川750021；4.韓城市金城辦畜牧獸醫(yī)工作站，陜西韓城715400）

瘋草是棘豆屬和黃芪屬有毒植物的統(tǒng)稱，其主要毒性成分為苦馬豆素（swainsonine，SW）。動物采食瘋草后可引起以神經系統(tǒng)紊亂為特征的瘋草中毒?。?］，但瘋草中SW 的合成機理一直未被闡明。研究表明，瘋草內普遍存在能合成苦馬豆素的內生真菌－Undifilum oxytropis，該內生真菌與瘋草毒性密切相關［2－10］，是瘋草中合成苦馬豆素的主要因素。抑制或消除瘋草內產SW 內生真菌將有望降低或消除瘋草的毒性，要實現(xiàn)該目標需要對瘋草內生真菌合成SW 的分子調控機制進行深入的研究。

原生質體是指完整細胞剝除細胞壁結構后所形成的裸露細胞，為球狀的單細胞，對化學誘導劑敏感，易于攝取外源大分子、細胞器及細菌和病毒，是真菌遺傳轉化和功能研究的重要工具。自Ferenczy L等［11］成功將細胞融合技術引入絲狀真菌的研究領域，原生質體技術陸續(xù)被應用于絲狀真菌融合育種、質粒及線粒體等外源基因的原生質體轉化育種、誘變再生育種及遺傳性狀表達和分析研究中。原生質體的制備方法主要分為機械法、酶解法和超聲法3種，其中酶解法條件比較溫和、制備量大、對原生質體的損傷小，是目前應用最為普遍的絲狀真菌制備方法。研究報道滲透壓穩(wěn)定劑、溫度、pH、酶解孵育方式及培養(yǎng)基組分等因素對菌株原生質體的形成和再生均具有不同程度的影響［12－16］。

瘋草內生真菌原生質體的制備可為進行瘋草內生真菌的遺傳轉化和基因研究提供重要工具，為進一步研究確定瘋草內生真菌合成SW 的相關基因功能，闡明分子調控機制奠定基礎。本試驗擬采用酶解法制備瘋草內生真菌的原生質體，并對獲得的原生質體進行生物學特性的初步研究，為進一步研究瘋草內生真菌合成SW 相關基因的功能提供轉化工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 瘋草內生真菌菌株U.oxytropis NX－FEL001，由寧夏大學臨床獸醫(yī)學自治區(qū)重點學科實驗室從寧夏黃花棘豆中分離鑒定并保存［9］。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 固體培養(yǎng)基，馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基，蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基［10］，CM 培養(yǎng)基［14］，酵母浸膏完全培養(yǎng)基（YCM）［14］，PDA 液體培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑和儀器 SW 標準品由寧夏大學農學院臨床獸醫(yī)學重點學科實驗室從黃花棘豆草粉中分離和純化；蝸牛酶（snailase）、溶壁酶（lysing enzyme）、纖維素酶（cellulase）為Sigma公司產品；山梨醇、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂等為國產分析純。

裂解酶溶液的配制：分別稱取1g蝸牛酶，1g纖維素酶，0.1g的溶壁酶，加入少量無菌的1mol／L的山梨醇溶解，定容至100mL，經0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 主要儀器設備 RE－52AA 型旋轉蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠產品；KG－SX－500型高壓鍋為三洋電機株式會社日本產品；MIP－250型霉菌培養(yǎng)箱為上海精宏實驗設備有限公司產品；QYC－2102C型搖床為上海?，攲嶒炘O備有限公司產品；酶標儀為Thermo Fisher公司產品；E438酸度計為Mettler Toledo 有限公司產品；超純水儀為Thermo Fisher公司產品；高速離心機為Eppendorf公司產品；數(shù)碼照相機為日本佳能公司產品；Neofugel 5R型臺式高速冷凍離心機為上海力申科學儀器有限公司產品；CKx41SF 倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品。

1.2 方法

1.2.1 菌種的培養(yǎng) 固體培養(yǎng)：將U.oxytropis NX－FEL001菌株接種于PDA 固體培養(yǎng)基22 ℃培養(yǎng)30d后，無菌刮取菌絲，將收集的菌絲用研磨棒研磨制備成均一的菌懸液（1×106個／mL）。取500μL涂布于蛋白胨無機鹽固體平板上，22 ℃靜置培養(yǎng)7d～30d，培養(yǎng)結束后，無菌刮取菌絲，將菌絲用研磨棒研磨成勻漿，并用1.0 mol／L 山梨醇溶劑洗滌3次。

液體培養(yǎng)：用打孔器取直徑6 mm 的菌餅（15個／瓶）接種到100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，22 ℃振 蕩 培 養(yǎng)7 d ～30 d，培 養(yǎng) 結 束 后，5 000r／min，離心30min，棄上清，將菌絲用研磨棒研磨成勻漿，并用1.0mol／L山梨醇劑洗滌3次。

1.2.2 原生質體的制備 稱量培養(yǎng)好的濕的菌絲體400mg，按質量體積比為1∶10加入4mL 裂解酶液，35℃，80r／min振蕩孵育，分別在孵育后1、2、3、4、4.5h取孵育的菌絲懸液于血球計數(shù)板上，置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計原生質體的數(shù)量，篩選適宜的酶解時間。酶解結束后，加入0.5倍酶體積的1.0mol／L山梨醇，渦旋混勻，3 層擦鏡紙過濾除去殘余的菌絲，先用5mL 的1.0mol／L 山梨醇沖洗2次，濾液5 000r／min離心15 min，棄上清，再用5mL的1.0mol／L山梨醇重懸，5 000r／min離心15min，棄上清，此過程重復3次，將制備好的原生質體重懸于適量的1.0mol／L山梨醇，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 培養(yǎng)方式的篩選 分別取1.2.1中固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)的菌絲，按1.2.2中試驗步驟制備原生質體，分別比較菌絲培養(yǎng)7d后固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)的方式原生質體的產量。

1.2.4 菌齡的篩選 取固體培養(yǎng)的菌絲，按1.2.2中的試驗步驟制備原生質體，分別比較菌齡為7、15、30、35d時原生質體的產量。

1.2.5 孵育溫度和孵育時間的篩選 固體培養(yǎng)15d的菌絲，以10g／L蝸牛酶＋10g／L纖維素酶＋1g／L溶壁酶組成的復合酶溶液為酶解系統(tǒng)。據(jù)報道，絲狀真菌菌絲細胞壁的酶解最適溫度一般為20 ℃～40℃，因此本試驗分別比較28、30、35、37℃時孵育3h后原生質體的產量；35 ℃孵育1、2、3、4、4.5h后原生質體的產量。

1.2.6 菌絲與酶解液質量體積比的篩選 固體培養(yǎng)15d的菌絲，以10g／L 蝸牛酶＋10g／L 纖維素酶＋1g／L溶壁酶組成的復合酶溶液為酶解系統(tǒng)，分別比較質量體積比為1∶10、1∶25時，原生質體的釋放量。

1.2.7 原生質體的再生 將新鮮制備的原生質體2倍稀釋，取200μL分別涂布于含有1.0mol／L 山梨醇的PDA 固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉培養(yǎng)基、YCM瓊脂培養(yǎng)基、CM 瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基上，置22 ℃培養(yǎng)15d，對形成的菌落進行計數(shù)（A），為消除由殘余菌絲再生出的菌落所帶來的誤差，同時將原生質體涂布于未添加1.0mol／L 山梨醇的培養(yǎng)基上，其再生菌落數(shù)作為對照（B），并根據(jù)下列公式計算不同培養(yǎng)基中原生質體的再生率。

1.2.8 再生菌絲及野生菌株菌絲中SW 的檢測

1.2.8.1 再生菌絲及野生菌株菌絲中SW 的提取分別刮取再生出的真菌菌絲和野生菌株菌絲0.5g～1g，65 ℃烘至恒重，然后研磨成粉末于10mL離心管中，加入體積分數(shù)為30mL／L 的乙酸溶液8mL，60℃超聲波提取3次，每次30min，合并3次提取液，3 000r／min 離心15 min，收集上清液并用旋轉蒸發(fā)儀濃縮揮干［12］。2mL 的pH 4.5檸檬酸鹽緩沖液溶解，12 000r／min離心5 min，取上清液，用pH 4.5 檸檬酸鹽緩沖液定容至10 mL，4 ℃保存待用。

1.2.8.2 再生菌絲及野生菌株菌絲中SW 含量的檢測 分別配制4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625μg／mL等9個梯度的SW 標準溶液。取40μL不同濃度的苦馬豆素標準品溶液分別加入96孔板的各孔中，每個濃度的溶液同時做3個重復，另將60μL 檸檬酸鹽緩沖液加入空白孔中作為空白對照，然后在每孔中加入95μL 的底物溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃孵育1h；孵育結束后在每孔加入20μL的酶溶液，但空白對照中不加酶溶液，輕微振蕩混勻，置37 ℃孵育1h。孵育結束后，每孔加入100μL 的反應終止液，輕微振蕩混勻，置405nm 波長處測定各孔吸光度值。以ɑ－甘露糖苷酶抑制率y對SW 濃度x進行回歸分析，繪制標準曲線。將1.2.8.1中制備的待檢液做適當?shù)南♂尯螅缓蟀凑丈鲜龅姆椒y定其中SW 的含量，將ɑ－甘露糖苷酶的抑制率代入回歸方程計算出樣品溶液中SW 的含量，并與野生型菌株中SW 含量作對比。

2 結果

2.1 原生質體的制備

2.1.1 原生質體的形成及釋放 當酶反應1h后，菌絲部分隔膜開始斷裂（圖1A）；反應2h后，菌絲的隔膜完全溶解，呈念珠狀（圖1B），此時原生質體開始從菌絲側面的細胞壁破口處釋放出來（圖1C）；反應3h～4h后，菌絲中大量細胞破壁，原生質體大量的釋放，其濃度達105個／mL以上，呈圓球形散在分布（圖1D）。

圖1 Undifilum oxytropis NX－FEL001原生質體的形成過程Fig.1 Process of release of the Undifilum oxytropis NX－FEL001protoplast

2.1.2 真菌培養(yǎng)方式對原生質體制備的影響 試驗結果表明，在裂解酶溶液的作用下，固體和液體振蕩培養(yǎng)的NX－FEL001 的菌絲細胞壁均可被溶解，但固體培養(yǎng)方式獲得的真菌菌絲經裂解液作用后產生的原生質體數(shù)量要顯著高于液體振蕩培養(yǎng)方式，原生質體的產量高達0.5×105個／mL，而液體振蕩培養(yǎng)原生質體的產量僅為0.4×105個／mL。

2.1.3 菌齡對原生質體制備的影響 處于不同生長時期的菌絲體對酶解液的敏感程度也存在較大的差異，當培養(yǎng)7d時，菌絲細胞壁過早溶解，并導致原生質體發(fā)生自溶，釋放量少；當菌齡為15d時，真菌細胞壁逐漸增厚，但又不會過多損傷釋放的原生質體，原生質體的產量最高。但隨著菌齡的增加，菌絲體細胞壁的結構越趨穩(wěn)定，對酶解液的敏感度下降，原生質體產量趨向于降低（圖2）。

圖2 菌齡對原生質體產量的影響Fig.2 Effects of cultivation time on protoplast yield

2.1.4 孵育溫度和孵育時間對原生質體釋放的影響 結果表明，35 ℃時原生質體的釋放量最大，原生質體的制備率最高，可達2.7×105個／mL。酶解液孵育1h后，僅有部分菌絲的細胞壁溶解，并釋放出少量的原生質體，但隨著孵育時間的延長，大部分菌絲的細胞壁溶解，釋放的原生質體逐漸增加，當孵育3h時，從溶解的菌絲中釋放的原生質體的數(shù)量最多，孵育4h后其數(shù)量反而降低（圖3A）?？赡芤驗槊附獾臅r間過長，原生質體的質膜損傷，導致原生質體破碎。因此，本試驗確定最佳孵育時間是3h（圖3B）。

圖3 孵育溫度和時間對原生質體產量的影響Fig.3 Effects of digesting temperature and time on protoplast yields

2.1.5 菌絲與酶解液質量體積比對原生質體釋放量的影響 結果顯示，菌絲和酶解液的質量體積之比為1∶10 時，有利于原生質體的釋放，釋放量達3.2×105個／mL；菌絲和酶解液的質量體積之比為1∶25時，原生質的釋放量達2.5×105個／mL，遠小于質量體積比為1∶10時原生質體的釋放量。

2.2 原生質體的再生

2.2.1 再生培養(yǎng)基組分對原生質體再生率的影響

菌株NX－FEL001原生質體可分別在含1 mol／L山梨醇的蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基、馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基、PDA 固體培養(yǎng)基、CM 瓊脂培養(yǎng)基、YCM瓊脂培養(yǎng)基上再生，但不同培養(yǎng)基上的再生能力存在一定的差異，其再生率分別為6.7%、6.4%、7.1%、7.9%、8.5%，其中在YCM 培養(yǎng)基上再生能力最強，而在馬鈴薯浸粉瓊脂培養(yǎng)基上再生能力較差（圖4）。

圖4 再生培養(yǎng)基的組分對原生質體再生率的影響Fig.4 Effects of regeneration medium on protoplast regeneration rate

2.2.2 再生真菌的形態(tài)特征 純化的原生質體，22 ℃培養(yǎng)30d后，在YCM 瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)白色（圖5A），而在其他培養(yǎng)基上再生出的菌落呈黑褐色，與野生菌株相一致（圖5B～圖5D），但不同再生培養(yǎng)基上菌絲的鏡下顯微形態(tài)無明顯差異，與野生菌株的形態(tài)特征相一致（圖5E，圖5F）。

2.2.3 再生真菌中SW 的含量 通過對原生質體再生后菌落菌絲中SW 含量的檢測，發(fā)現(xiàn)再生的真菌仍具備合成SW 的能力，其菌絲中SW 含量為168.3μg／g，野生型菌絲中的SW 含量為165.6μg／g。

3 討論

目前，子囊菌的轉化技術已經相對比較成熟，但是因為產SW 瘋草內生真菌生長比較緩慢，不容易獲得該內生真菌的原生質體，原生質體技術在該類真菌上的應用還處在發(fā)展的過程中。原生質體的制備是一切原生質體操作技術的前提，裂解酶的種類、配比、酶解的時間、溫度、滲透壓穩(wěn)定劑等都會不同程度的影響原生質體的釋放和再生能力。

在本試驗中U.oxytropis菌絲在蛋白胨無機鹽固體培養(yǎng)基上22 ℃培養(yǎng)15d，按照菌絲與酶解液質量體積比為1∶10，35 ℃恒溫、80r／min振蕩孵育3 h，原生質體釋放量最高；原生質體在YCM 培養(yǎng)基上，22 ℃培養(yǎng)9d可以再生形成菌落，培養(yǎng)15d其再生率可達8.5%；原生質體在YCM 培養(yǎng)基上再生后其菌落顏色與野生型U.oxytropis不一致，呈白色，其他培養(yǎng)基上再生后的菌落顏色與野生型菌株相一致。菌絲形態(tài)與野生型U.oxytropis相一致，經檢測再生后菌絲仍然能夠產生苦馬豆素，與Mukherjee S等［15－16］研究結果相一致。原生質體的制備只是去除了真菌細胞的細胞壁。原生質體的再生過程是細胞壁再生過程，并未改變真菌的遺傳性狀，不會影響菌株合成SW 的能力。

圖5 再生真菌的形態(tài)特征觀察Fig.5 Morphological observation of mycelia

菌絲細胞壁的結構的形成受培養(yǎng)方式的影響，間接地影響菌絲對裂解酶的敏感程度。本試驗評估了液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的方式對原生質體釋放的效果，表明固體培養(yǎng)菌絲能釋放出更多的原生質體，與朱建勇等［13］研究結果一致。固體培養(yǎng)基獲得的真菌培養(yǎng)物中的菌絲體排列較疏松，經研磨后，菌絲體能夠與酶解液充分接觸，有利于原生質體的釋放。而液體振蕩培養(yǎng)后所得的真菌培養(yǎng)物呈球狀、索狀，菌絲體排列致密，導致菌絲與酶解液不能完全充分的接觸，將不利于原生質體的釋放。

菌絲處于不同生長時期，其細胞壁的結構組成有所不同。菌齡過小，細胞壁薄，酶解后所形成的原生質體大小不均勻，且容易溶解；菌齡過大，菌絲細胞壁較厚，細胞壁不易破碎，不利于原生質的釋放［12］。本試驗最終確定22 ℃培養(yǎng)15d，有利于U.oxytropis原生質體的釋放。

酶的本質是蛋白質，幾乎所有酶參與的反應都受溫度、時間條件的影響。不同種類的酶都有其作用的最適溫度、時間，在該溫度、時間下其活性最高，偏離該溫度、時間，酶的活性將會受到抑制，甚至變性失去活性；酶解溫度越低、時間過短，菌絲質膜不能完全溶解，細胞壁不能徹底被剝除，原生質體制備率過低；孵育溫度過高、時間過長，會對一些早期釋放的原生質體質膜造成損傷，導致原生質體的穩(wěn)定性下降［13］。本試驗最終確定35 ℃恒溫孵育3h，混合酶液活性最佳，原生質體的釋放量最大，高達2.7×105個／mL。

菌絲與酶解液的質量體積比過大，不利于菌絲與混合酶解液的接觸，細胞壁破損不完全，阻礙了原生質體的釋放；菌絲與酶解液的質量體積比過小，混合酶液濃度相對過大，會導致原生質體的質膜破損和溶解，降低其再生能力。試驗最終確定菌絲與酶解液的質量體積比1∶10。

再生培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)的方式會影響原生質體細胞壁的再生能力，導致再生率不同［13］。本試驗只做了5種固體培養(yǎng)方面的研究，發(fā)現(xiàn)YCM 培養(yǎng)基上再生效果最好，與徐峰等［14］試驗結果相一致。有關原生質體在液體培養(yǎng)基中再生菌絲的形態(tài)及再生能力有待進一步研究。

U.oxytropis原生質體的制備及再生為進一步研究SW 合成機理及產SW 內生真菌原生質體的制備提供思路，為后續(xù)開展U.oxytropis菌株原生質體誘變、融合、轉化、誘變育種奠定基礎。一方面從瘋草毒性來說，通過原生質體技術構建低毒或無毒的瘋草；另一方面，從SW 藥用價值來說，通過該技術構建高產SW 的突變菌株。

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