麥洼牦牛NOBOX 基因克隆與序列分析

李博浩，符 梅，蘭道亮，熊顯榮，李 鍵.＊

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041）

NOBOX（新生兒卵巢同源基因）是一個(gè)卵母細(xì)胞特異性表達(dá)的同源基因，在早期濾泡發(fā)生中起重要的作用［1］。NOBOX 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的卵巢特異性表達(dá)同源盒基因，最早可于小鼠胚胎形成的15.5d以后檢測(cè)到，其mRNA 和蛋白質(zhì)都可在生殖細(xì)胞和各級(jí)卵泡中檢測(cè)到。同源盒基因均含有180bp的高度保守序列，且在進(jìn)化上高度保守，位于靠近3′端的分散的外顯子上。這段序列編碼60個(gè)氨基酸的同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD）。HD 折疊成4個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)，X 射線晶體學(xué)研究表明，螺旋Ⅰ與Ⅱ平行，螺旋Ⅲ與前2個(gè)基本垂直，Ⅱ、Ⅲ螺旋和它們之間的轉(zhuǎn)折形成HTH（helix－turn－h(huán)elix）結(jié)構(gòu)。NOBOX 基因敲除小鼠表現(xiàn)為原始卵泡發(fā)育停滯，不能進(jìn)入初級(jí)卵泡以后的生長(zhǎng)發(fā)育階段。在出生后14d，卵巢被纖維組織填充，卵巢原始卵泡所剩無(wú)幾，原因可能是NOBOX 基因失活后，其下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)異常而導(dǎo)致卵巢衰竭與不孕。通過免疫組化檢測(cè)并觀察NOBOX 基因敲除新生仔鼠和正常小鼠的卵巢組織切片，發(fā)現(xiàn)在缺失NOBOX 基因的仔鼠卵巢中，一些卵巢特異性表達(dá)的基因如Gdf9、Bmp15、Oct4 的表達(dá)顯著下降。因此，我們推斷NOBOX 可能直接或間接地調(diào)控卵母細(xì)胞特異基因的轉(zhuǎn)錄［2］。

牦牛是生活在高原環(huán)境下的特有物種，其繁殖具有明顯的季節(jié)性，繁殖率為60%～75%，成活率為45%～75%，其繁殖性能低等問題一直制約著牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。牦牛繁殖率低除與其生長(zhǎng)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)狀況等有關(guān)外，也與其受精后的胚胎發(fā)育潛能有直接的關(guān)系。目前尚未見到關(guān)于牦牛NOBOX 基因克隆的報(bào)道，本試驗(yàn)通過RT－PCR 技術(shù)首次克隆得到牦牛NOBOX 基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，并對(duì)獲得的目的基因進(jìn)行了序列分析，為進(jìn)一步研究牦牛卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育的分子機(jī)制上積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 屠宰麥洼牦牛的不同組織，采自成都市青白江區(qū)某屠宰場(chǎng)，屠宰后分別采集3頭公牦牛與3頭母牦牛心、肝、脾、肺、腎、睪丸、腦、大腸、肌肉和卵巢10種組織，所有樣品采集好后立即投入液氮中速凍，之后置－70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 感受態(tài)大腸埃希菌DH5α為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；pMD19－T 克隆載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒為Axygen（北京）公司產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶為Fermentas公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的牛NOBOX（登錄號(hào)為HQ589330.1）基因序列，用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分兩段擴(kuò)增麥洼牦牛的NOBOX 基因片段。引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 用于擴(kuò)增NOBOX 基因的引物序列Table 1 Primer sequences for amplification of NOBOX genes

1.2.2 組織RNA 的提取和cDNA 的合成 根據(jù)RNA 裂解液Trizol說明書，取牦牛組織100mg，加入1 mL Trizol液氮研磨提取總RNA，按照Fermentas 公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄酶說明書，采用20μL 反轉(zhuǎn)錄體系：oligo dT18 1μL，5×Reaction buffer 4μL，RibolockTMRNase Inhibitor（20 g／L）1 μL，10mmol／L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMMMμLV Reverse transcriptase（200g／L）1μL，模板1μL，最后用RNase free dH2O 補(bǔ)足20μL。按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃60min；70 ℃5min，合成cDNA，置－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 目的基因的克隆 以牦牛組織cDNA 為模版，引物為F1，R1；F2，R2，進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50μL。所有PCR 產(chǎn)物經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，用Axygen 的凝膠回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，取適量已純化PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19－T 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在Amp＋瓊脂平板上涂菌。挑取單個(gè)菌落接種于含Amp＋的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中。經(jīng)PCR 鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送往Invitrogen（英濰捷基上海）公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 目的基因序列分析 將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，用DNA Star和Cltulax等軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增與拼接

牦牛NOBOX 基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1。由圖1可知，擴(kuò)增片段大小分別在889bp和1 086bp左右，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小基本相符。利用擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果的重復(fù)序列進(jìn)行拼接，克隆獲得牦牛目的基因序列。

圖1 牦牛NOBOX 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of NOBOX gene in yak

2.2 基因序列分析

擴(kuò)增到的牦牛NOBOX 基因片段大小為1 975bp（GenBank登錄號(hào)：KJ863560），開放閱讀框全長(zhǎng)1 500bp，編碼499 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為53.12ku，理論等電點(diǎn)為6.008。氨基酸組成中，正電荷殘基總數(shù)41個(gè)，負(fù)電荷殘基總數(shù)47個(gè)，整個(gè)蛋白帶負(fù)電荷。

將牦牛NOBOX 基因開放閱讀框編碼的氨基酸序列在http：／／cn.expasy.org／進(jìn)行ScanProsite分析，得到1 個(gè)HOMEOBOX 2 蛋白家族標(biāo)記，為QVRKKTRTLYRSDQLEELERLFQDDHYPDSD KRREIAQTVGVTPQRIMVWFQNRRAKWRK（第115位～第175位氨基酸，編號(hào)：PS50071）。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

用DNA Star軟件的子程序Protean預(yù)測(cè)牦牛NOBOX 基因的親水性、柔韌性、表面可能性及抗原性，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，牦牛NOBOX 基因親水性殘基所占比例遠(yuǎn)大于疏水性殘基，因此推測(cè)其編碼蛋白整體表現(xiàn)為親水性。NOBOX 基因柔韌性區(qū)域分布相對(duì)均勻，提示該蛋白肽段的柔韌性較大，形成抗原表位的可能性較大，容易與抗體結(jié)合。從圖2還可以明顯看出，抗原表位區(qū)域較大，并且與柔韌性區(qū)域和表面可能性區(qū)域出現(xiàn)了較多的重疊區(qū)，這些區(qū)域相對(duì)易于變形，便于抗原、抗體的自由結(jié)合，可能是抗原位點(diǎn)的富集區(qū)。

2.4 同源性比較

利 用DNA Star 軟 件 子 程 序 MegAlign 的Clustal W 方法與GenBank 中公布的部分物種NOBOX 基因序列進(jìn)行同源性比較結(jié)果如圖3 所示。結(jié)果顯示：8條基因序列的同源性介于48.2%～97.0%之間；與牦牛NOBOX 基因同源性最高的是牛的NOBOX 基因序列，為97.0%；最低的是大鼠的NOBOX 基因序列，為48.2%；其次，與山羊的的NOBOX 基因序列同源性較接近，為85.3%；與野豬和人的NOBOX 基因序列同源性分別為69.5%和67.3%。該結(jié)果說明牦牛NOBOX 基因序列具有較高的保守性。

圖2 牦牛NOBOX 基因親水性、柔韌性及抗原性的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Predictive results of hydrophilicity，flexibility，surface probability and antigenicity of NOBOX gene in yak

圖3 NOBOX 基因的核苷酸序列同源性比較Fig.3 Homological alignment of NOBOX gene nucleotide sequences

2.5 NOBOX 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用 在 線 軟 件（http：／／npsa－pbil.ibcp.fr／cgibin／npsa automat.pl？page＝npsa gor4.html）對(duì)耗牛NOBOX 基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。如 圖4 所 示，該 蛋 白α－螺 旋（Alpha helix）占13.43%；自由卷曲（random coil）占79.96%；延伸鏈（extended strand）占6.61%。

圖4 NOBOX 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of secondary structure of NOBOX protein

2.6 進(jìn)化樹分析

用MEGA 5.0軟件的Neighbor－Joining法，重復(fù)1 000次，對(duì)獲得的8 條NOBOX 基因序列構(gòu)建Bootstrap驗(yàn)證的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖5所示。由圖5可見，牦牛與牛NOBOX 基因的親緣關(guān)系最近，與山羊、野豬、老虎、人形成一個(gè)分支，大鼠和小鼠形成另一個(gè)分支。

圖5 NOBOX 基因的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of NOBOX gene nucleotide sequences

3 討論

本研究利用PCR 技術(shù)首次擴(kuò)增獲得了牦牛NOBOX 基因，測(cè)序結(jié)果表明，其與牛的基因序列相比，具有極高的同源性，通過同源序列的比較，他們的同源性高達(dá)97%，說明NOBOX 基因在不同物種中具有保守性。

NOBOX作為同源盒蛋白家族成員，通過DNA－同源盒結(jié)構(gòu)域相互作用調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在卵子早期發(fā)生過程發(fā)揮重要作用［3］。在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的最初階段，主要依賴于母體RNA 和卵子發(fā)生過程中合成的蛋白質(zhì)［4－5］。新生卵巢同源基因（NOBOX）是來(lái)自于新生卵巢的轉(zhuǎn)錄因子，在表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）的硅片減法中被確定［3］。NOBOX的mRNA 和蛋白在整個(gè)卵泡中優(yōu)先表達(dá)，并控制著幾個(gè)與卵泡成熟有關(guān)的其他基因［6］。在Rajkovic A等［6－7］之 前 的 試 驗(yàn) 中 得 到，NOBOX 基 因 敲 除 小 鼠 不育的原因包括卵泡發(fā)育受阻及很多生殖細(xì)胞特定基因與miRNA 表達(dá)的干擾。此外，在卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）相關(guān)的NOBOX 基因突變已在人類中得到體現(xiàn)［8－9］。原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）患 者 的NOBOX 基因是部分高加索POI和（或）POF患者的致病基因，但不是亞洲POI和（或）POF 人群的常見的致病基因［10－11］。目前已經(jīng)有科學(xué)家嘗試用海參花醇提物對(duì)卵巢早衰小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，并且證明了海參花醇提物可增加子宮內(nèi)膜厚度，對(duì)卵巢早衰發(fā)揮防治作用，對(duì)雌性小鼠生殖系統(tǒng)有促進(jìn)作用［12］。最新研究還指出，NOBOX 是FOXL2關(guān)鍵的伙伴基因，互相作用并共同參與卵巢發(fā)育［13－14］，而后者更對(duì)性別的影響起著至關(guān)重要的作用［15－16］。因此，繼續(xù)深入的研究NOBOX 基因，將會(huì)對(duì)人類醫(yī)學(xué)及治愈卵巢早衰等疾病，有著巨大的影響。

本研究首次成功克隆了牦牛NOBOX 基因，并進(jìn)行了相關(guān)序列分析，旨在為進(jìn)一步深入研究NOBOX 基因在牦牛卵泡發(fā)育等方面所發(fā)揮的功能和作用提供基礎(chǔ)。

3.1 NOBOX 基因結(jié)構(gòu)和功能

目前已見到關(guān) 于人［17］、小鼠［3，7］、牛［18］、豬［19］等NOBOX 基因克隆的報(bào)道，但是關(guān)于牦牛的尚未見到。Swamy K 等［18，20］從牛的各組織中提取克隆了NOBOX 基因，包括肝臟、腎臟、肌肉、心臟、大腦、下丘腦、脾、肺、小腸及胎兒的卵巢，并通過試驗(yàn)，證明其具有1 500bp開放閱讀框，編碼500個(gè)氨基酸，與其他物種氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)具有很高的相似性，這與本試驗(yàn)克隆所得目的基因序列的開放閱讀框大小、編碼氨基酸個(gè)數(shù)及分子質(zhì)量大小基本相似。蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NOBOX 基因所編碼的蛋白質(zhì)以親水性區(qū)域?yàn)橹?，柔韌性區(qū)域分布相對(duì)均勻，提示該蛋白肽段的柔韌性較大，形成抗原表位的可能性較大，容易與抗體進(jìn)行嵌合，抗原與抗體結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生蛋白構(gòu)象變化［21］?？乖砦粎^(qū)、柔韌性區(qū)域和表面可能性區(qū)域出現(xiàn)了較多的重疊區(qū)，這些區(qū)域相對(duì)易于變形，便于抗原、抗體的自由結(jié)合，可能是抗原位點(diǎn)的富集區(qū)，綜上所述，并且通過研究得出，NOBOX 是一卵子特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是參與早期卵泡發(fā)育過程的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。

3.2 NOBOX 基因同源性和遺傳進(jìn)化關(guān)系

核苷酸序列同源性分析及進(jìn)化分析顯示NOBOX 基因與其他哺乳動(dòng)物的核苷酸序列同源性參差不齊，從48.2%～97.0%不等，其中與牛的同源性最高，同時(shí)與牛的親緣關(guān)系也最近。

綜上所述，本研究成功克隆了牦牛NOBOX 基因，并進(jìn)行了序列分析，其基因序列與其他物種基因序列相比，尤其在近緣物種中NOBOX 具有較高的保守性。具有一定的保守性，提示可能與該基因在生物體內(nèi)發(fā)揮的重要作用有關(guān)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育分子機(jī)制上提供基礎(chǔ)。

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