H4亞型禽流感病毒套式RT－PCR 檢測方法的建立

吳嬡瓊，謝芝勛，胡庭?。x麗基，羅思思，鄧顯文，謝志勤，黃 莉，黃嬌玲，曾婷婷

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530004；2.廣西獸醫(yī)研究所畜禽疫苗新技術重點實驗室，廣西南寧530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A 型流感病毒屬的禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種禽類的感染／疾病綜合征，主要引起禽類的全身或呼吸系統(tǒng)疾?。?］。AIV亞型眾多，根據(jù)表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性差異，已鑒別出16 種HA 亞型（H1－H16）和9 種NA（N1－N9）亞型［1］；根據(jù)AIV 致病力的差異可分為高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HP－AIV）和低致病性禽流感病毒（Lowly pathogenic avian influenza virus，LP－AIV）［2］。HP－AIV 引起的家禽AI以全身感染、高發(fā)病率和高死亡率為特征。LP－AIV 引起的家禽AI臨床癥狀表現(xiàn)溫和，病死率不高，但影響家禽的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。

H4亞型AIV 屬于LP－AIV，能隱性感染各種家禽及野生鳥類［3］，宿主范圍比較廣，包括雞、火雞、鴨、野鴨、野鳥、鴕鳥、鸚鵡等，還可以跨物種傳播，感染哺乳動物［4］。薛峰等［5］報道，在江蘇鹽城國家級自然保護區(qū)對野鴨、丹頂鶴等野禽AIV 檢測中，H4亞型AIV 分離率最高（38.5%）。雖然絕大多數(shù)LP－AIV 致病力低，但LP－AIV 可能為感染人類的AIV 提供基因［6］，潛在危害性不容忽視。因此，應加強對H4亞型AIV 的監(jiān)測。

目前，國內(nèi)建立的AIV 快速檢測方法多數(shù)都是針 對 其 他 亞 型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、H9［7－11］亞型，而針對H4亞型AIV 的快速檢測方法未見報道。所以，本研究建立的H4亞型AIV 的套式RT－PCR 方法，旨在為H4亞型AIV 的臨床監(jiān)測提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 5株H4亞型AIV、其他AIV 亞型（H1、H3、H6、H9）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、禽呼腸病毒（ARV）及雞毒支原體（MG）由廣西獸醫(yī)研究所生物技術實驗室保存；H5、H7亞型AIV RNA由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈。

1.1.2 主要試劑 SPF 雞胚為北京梅里亞公司產(chǎn)品；DNA／RNA 試劑盒為北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品；RNA 反轉錄試劑、dNTP 和2×Taq PCR Mix為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物設計與合成 根據(jù)H4 亞型AIV 的HA 基因核苷酸序列的保守區(qū)域，應用生物學軟件Primer Premier 5.0 設 計 并 篩 選 了2 對 特 異 性 引物，即外引物和內(nèi)引物（表1）。其中，外引物擴增目的片段為342bp，內(nèi)引物擴增目的片段為199bp。引物由Invitrogen公司合成。

表1 外引物和內(nèi)引物序列Table 1 The sequence of inner and outer primers

1.1.4 病毒 RNA 的抽提與反轉錄 參照DNA／RNA 抽提試劑盒使用說明書抽提病毒RNA 和ILTV 及MG DNA，用隨機引物將RNA 反轉錄成cDNA，置于－30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 套式RT－PCR條件的優(yōu)化 2次PCR 均為25μL反應體系，其他體系組分不變（2×PCR Master Mix 12.5μL、模板2μL），分別針對引物濃度、反應循環(huán)數(shù)及退火溫度進行優(yōu)化。第1輪PCR 擴增，外 引 物 上、下 游 引 物 各0.1 μL ～0.5 μL（25.0pmol／μL）范圍，循環(huán)數(shù)15、18、21、25、30.5個梯度，退火溫度50℃～60℃優(yōu)化反應體系。第2輪PCR 以第1輪PCR 產(chǎn)物10倍倍比稀釋物為模板，優(yōu)化第2輪PCR 反應模板濃度，引物濃度、反應循環(huán)數(shù)及退火溫度優(yōu)化同第1輪。

1.2.2 特異性試驗 用本研究建立的套式RTPCR 方法，同時擴增H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9亞型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG 和ARV 的核酸，以超純水作為陰性對照，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)15g／L 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.3 敏感性試驗 測定H4亞型AIV RNA 的濃度，并按10倍倍比稀釋H4亞型AIV RNA，其濃度分別為3.6ng／μL、360、36.0、3.60pg／μL、360、36.0、3.6fg／μL。對各濃度的病毒RNA 進行反轉錄后，分別進行普通RT－PCR 和套式RT－PCR 擴增，并設陰性對照，PCR 產(chǎn)物經(jīng)15g／L瓊脂糖凝膠電泳，觀測結果。

1.2.4 臨床樣品檢測 將106份從廣西南寧市活禽市場采集的口腔和泄殖腔拭子進行RNA 提取，反轉錄為cDNA，應用本試驗建立優(yōu)化好的套式RT－PCR 方法進行擴增，重復3次，保證試驗的準確性。對106份樣品進行抗生素處理，用雞胚分離病毒，用傳統(tǒng)的病毒血清學檢測方法進行鑒定。

2 結果

2.1 套式RT－PCR條件優(yōu)化結果

本試驗經(jīng)過對套式RT－PCR 條件的優(yōu)化，最后確定最佳的反應條件為：兩輪的反應體系都是25μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，2μL cDNA，引物 上、下 游 各0.2 μL（25 pmol／μL），加 純 水 至25μL。第1 輪 反 應 模 式 為：95 ℃5 min；95 ℃50s，55 ℃40s，72 ℃1 min，21 個 循 環(huán)；72 ℃10min，12 ℃結束反應。第2輪反應模式為：95 ℃5min；95 ℃50s，56 ℃40s，72 ℃1min，21個循環(huán)；然后進入72℃延伸10min，12℃結束反應。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)15g／L瓊脂糖凝膠電泳，結果表明，第1輪特異性擴增產(chǎn)物大小為342bp，與預期結果相符；第2輪特異性擴增產(chǎn)物大小為199bp，與預期結果相符（圖1）。

2.2 特異性試驗結果

將各病原體待檢測的cDNA 進行套式RTPCR 特異性擴增后，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電脈結果表明只在H4亞型AIV 的cDNA 處出現(xiàn)了大小199bp的目的條帶，其他病原體的cDNA 與陰性對照都無條帶出現(xiàn)（圖2）。說明本試驗建立的套式RT－PCR 檢測方法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗結果

結果表明，普通RT－PCR 最低能檢測到36pg／μL的病毒含量（圖3）。而套式RT－PCR最低能檢測到360fg／μL的病毒含量（圖4）。經(jīng)比較，套式RT－PCR比普通RT－PCR 靈敏性高100倍。

2.4 臨床樣品檢測結果

在廣西南寧市活禽市場106 份樣品中，套式RT－PCR 檢測結果有3份呈H4亞型AIV 陽性（圖5）；病毒分離鑒定結果為3份陽性樣品。表明所建立的套式RT－PCR 檢測結果與病毒分離鑒定結果一致。

圖1 套式RT－PCR 優(yōu)化結果Fig.1 The optimization results of nested RT－PCR

圖2 套式RT－PCR 特異性試驗結果Fig.2 The specificity assay of nested RT－PCR

圖3 常規(guī)RT－PCR 的敏感性試驗結果Fig.3 The sensitivity assay of conventional RT－PCR

圖4 套式RT－PCR 的敏感性試驗結果Fig.4 The sensitivity assay of nested RT－PCR

圖5 套式RT－PCR的臨床樣品檢測結果Fig.5 The detection results of clinical samples by nested RT－PCR

3 討論

AIV 是一種高度接觸性、急性傳染病，可引起感染家禽從呼吸系統(tǒng)病變到全身敗血的癥狀。自首次發(fā)現(xiàn)AIV 以來的100 多年里，世界各地不斷有AI的暴發(fā)和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。H4亞型AIV 屬于低致病禽流感病毒，多從水禽和野鳥體內(nèi)分離到，在鴨、鵝和野鳥等體內(nèi)持續(xù)存在，且可能傳播給雞［12］。并且，H4亞型AIV 廣泛分布于世界各地，許多國家都分離到H4亞型AIV，在中國也分離到了H4亞型AIV。因此，加強對H4亞型AIV 檢測和鑒別具有很重要的意義。

本研究通過H4亞型AIV HA 基因比對分析，設計并篩選了2對特異性引物，針對H4 亞型AIV模板進行兩輪PCR 擴增，通過對反應體系和條件的優(yōu)化，建立了H4亞型AIV 套式RT－PCR 方法。用本研究所建立的套式RT－PCR 方法，對H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9 亞型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG 和ARV 的 核 酸 進 行 擴 增，結 果 該RT－PCR 方法只能擴增H4亞型AIV，而對其他亞型AIV 及禽呼吸道疾病病原體不擴增，表明該PCR 方法具有高度特異性；用本研究所建立的套式RT－PCR 方法和常規(guī)RT－PCR 方法分別進行敏感性試驗，結果套式RT－PCR 方法較常規(guī)RT－PCR 方法更敏感。對活禽市場106份樣品分別用本研究建立的套式RT－PCR方法進檢測和傳統(tǒng)的病毒血清學檢測方法進行鑒定，兩者結果一致。綜上所述，本研究建立的套式RT－PCR 方法特異性強、敏感性好、精確度高，為監(jiān)測H4亞型AIV 提供了有效的檢測方法。

套式RT－PCR 是在常規(guī)RT－PCR 技術基礎上發(fā)展和改良而來的。常規(guī)RT－PCR 是通過1對引物進行特異性擴增，套式RT－PCR 比常規(guī)RT－PCR 增加了1對引物，這對引物結合在第1次PCR 擴增產(chǎn)物的內(nèi)部，通過兩輪擴增，建立套式RT－PCR檢測方法。與常規(guī)RT－PCR 相比，套式RT－PCR 具有以下兩方面的優(yōu)勢：①當樣品模板量低時，常規(guī)RT－PCR可能檢測不到樣品，套式RT－PCR 通過第2輪在第1輪PCR 產(chǎn)物內(nèi)部進一步擴增，可增加檢測的敏感性，提高檢測的準確性，避免漏檢陽性樣品。經(jīng)過本研究敏感性試驗的驗證，表明所建立的套式RTPCR 比常規(guī)RT－PCR 敏感性高出100倍；②客觀來說，一對引物不是萬能的，當非特異性擴增不能完全避免的時候，如第1輪擴增產(chǎn)生了非特異性片段，第2輪不能在第1輪PCR 產(chǎn)物上繼續(xù)進行擴增，提高了套式RT－PCR的特異性。值得注意的是，由于第2輪PCR 擴增的模板是第1輪的擴增產(chǎn)物，最好對第1輪產(chǎn)物進行稀釋，避免第1輪的引物殘留，影響第2輪擴增，因此，本研究經(jīng)過對其優(yōu)化，確定第1輪的產(chǎn)物需稀釋100倍后作為第2輪的模板，達到了很好的PCR 擴增效果。此外，在套式RT－PCR 操作過程中，應注意防止模板和擴增產(chǎn)物污染，因而模板加入、擴增產(chǎn)物稀釋和PCR 反應體系配制（包括第1輪和第2輪）應分區(qū)域進行，并加入陰性對照進行比較，從而保證試驗的精確性。雖然套式RTPCR 需進行2 次PCR 反應，但每次的反應時間相比，較于普通RT－PCR均縮短了1倍左右，總體反應時間與普通RT－PCR 相同，但套式RT－PCR 方法特異性更強、敏感性更好、精確性更高。

本研究建立的H4 亞型AIV 套式RT－PCR 方法具有精確性高、特異性好、靈敏度高等特點，為H4亞型AIV 的快速檢測提供了方法，對有效防控H4亞型AIV 有重要意義，為AIV 的監(jiān)測和快速診斷提供了方法，具有良好的應用前景。

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