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    制作花粉樣片校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡放大倍數(shù)及示值誤差方法

    2015-06-09 22:39:30吳小麗
    計(jì)量技術(shù) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:樣片示值倍數(shù)

    蔣 聰 張 松 陳 龍 吳小麗

    (重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院,重慶 401123)

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    制作花粉樣片校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡放大倍數(shù)及示值誤差方法

    蔣 聰 張 松 陳 龍 吳小麗

    (重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院,重慶 401123)

    主要介紹了制作花粉樣片校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡的放大倍數(shù)及示值誤差的方法。通過對雙光子熒光顯微鏡的構(gòu)成及其工作原理的分析,在用傳統(tǒng)方法不能實(shí)現(xiàn)對系統(tǒng)的放大倍數(shù)及示值誤差進(jìn)行校準(zhǔn)的情況下,研發(fā)制作了一套標(biāo)準(zhǔn)花粉樣片,用樣片作為標(biāo)準(zhǔn)參照物對雙光子熒光顯微鏡的放大倍數(shù)及示值誤差進(jìn)行校準(zhǔn),并通過不確定度分析對該方法的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。

    花粉樣片;雙光子熒光顯微鏡;光學(xué)放大倍數(shù);示值誤差;測量不確定度

    0 引言

    隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)發(fā)展,雙光子熒光顯微鏡是為了觀察和研究活體細(xì)胞的動態(tài)生命過程而研發(fā)的一種新型顯微鏡,它結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,為了不損傷細(xì)胞,雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是最高的,雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔,提高了熒光檢測效率。為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)和藥理學(xué)等研究領(lǐng)域中重要的研究手段。

    由于它的特殊工作原理,其放大倍數(shù)和示值誤差的校準(zhǔn)無法采用普通顯微鏡的校準(zhǔn)方法來實(shí)現(xiàn),對普通顯微鏡我們通過測微尺進(jìn)行校準(zhǔn),而現(xiàn)在所有的測微尺都無法在雙光子熒光顯微鏡的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中掃描成像。為此,必須選擇一種能夠在雙光子熒光顯微鏡下掃描成像的標(biāo)準(zhǔn)器具。目前世界上只有個別發(fā)達(dá)國家制作有標(biāo)準(zhǔn)熒光球作為校準(zhǔn)這種顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)器,其價值昂貴,且準(zhǔn)確度極高,有的只有幾納米,國內(nèi)量值溯源也有一定困難。我們通過分析比較,嘗試了多種方法,最后采用了生物顯微鏡常用的測試材料花粉顆粒,制作成花粉樣片來進(jìn)行校準(zhǔn)。

    1 花粉樣片的制作與標(biāo)定

    首先采用做分析實(shí)驗(yàn)的花粉顆粒在玻璃上制成樣片,并對其進(jìn)行分區(qū),然后在萬能工具顯微鏡上觀察,以形狀較好的位置容易區(qū)分的花粉顆粒作為標(biāo)準(zhǔn)顆粒進(jìn)行標(biāo)定,給出標(biāo)準(zhǔn)顆粒的直徑值。

    為了對顯微鏡較為全面的量程范圍進(jìn)行校準(zhǔn),需要選擇幾種直徑不同的花粉進(jìn)行標(biāo)定,通過萬能工具顯微鏡,很容易發(fā)現(xiàn),不同的花粉顆粒其顏色和尺寸差別是很大的。選取四類不同花粉顆粒,直徑從0.01~0.12mm。由于自然花粉不一定都呈現(xiàn)完美的圓形,必須采用單一顆粒在固定方向上標(biāo)定其直徑,以避免校準(zhǔn)環(huán)節(jié)引入花粉形狀誤差。

    花粉樣片圖見圖1。

    圖1 花粉樣片圖

    2 校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)和示值誤差

    對已交付運(yùn)行中的一套北京博銳雙光子科技有限公司制造的BR-SUP01型“超高速雙光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺系統(tǒng)”進(jìn)行了校準(zhǔn)測試,方法如下:將制作的花粉樣片在萬能工具顯微鏡下標(biāo)定后,放于雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上,依次將標(biāo)定了直徑的一組花粉顆粒用雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行測試,將測試值與萬能工具顯微鏡上的標(biāo)定值進(jìn)行比較,得到放大倍數(shù)和示值誤差。

    相對放大倍數(shù)誤差計(jì)算公式:

    Δβ=[(Li-L0)/L0]100%

    (1)

    式中:Δβ為相對放大倍數(shù)誤差;L0為萬能工具顯微鏡標(biāo)定的花粉顆粒直徑;Li為雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測得的花粉顆粒直徑。

    示值誤差計(jì)算公式:

    ΔL=(Li-L0)

    (2)

    以下給出一組具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析演算過程:

    系統(tǒng)測試狀況:測量物鏡為40X,掃描與圖像采集速度為40fps。測量10個花粉顆粒,其測試數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表1所示。

    表1 花粉顆粒測試數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果 (單位:μm)

    以該組數(shù)據(jù)的最大相對差值計(jì)算雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)相對誤差:

    Δβ=[(Li-L0)/L0]100%=0.048×100%=4.8%

    以該組數(shù)據(jù)的最大相對差值計(jì)算雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的示值誤差:

    (1)組建企業(yè)集團(tuán)財(cái)務(wù)公司。組建財(cái)務(wù)公司能夠極大地降低企業(yè)集團(tuán)在金融市場中的交易成本,提高利潤與企業(yè)綜合競爭力。具體而言有以下優(yōu)勢:財(cái)務(wù)公司擴(kuò)張性強(qiáng),能夠吸引外部有益投資;能夠從側(cè)面拓展企業(yè)業(yè)務(wù),促進(jìn)企業(yè)集團(tuán)綜合競爭力的提高;具有較為直接的融資能力,切實(shí)滿足企業(yè)集團(tuán)加強(qiáng)內(nèi)部資金管理以及融資的需求;能夠?yàn)槠髽I(yè)集團(tuán)與金融機(jī)構(gòu)的結(jié)算方式提高創(chuàng)新,打造高效便捷集團(tuán)內(nèi)部結(jié)算系統(tǒng)。

    ΔL=(Li-L0)=1.6μm

    校準(zhǔn)結(jié)論:該雙光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺的放大倍數(shù)誤差小于5%,示值誤差小于2μm,符合JJF 1402—2013《生物顯微鏡校準(zhǔn)規(guī)范》要求。

    3 不確定度分析

    數(shù)學(xué)模型:

    ΔL=(Li-L0)

    式中:ΔL為測量點(diǎn)的示值誤差,mm;Li為測量點(diǎn)的標(biāo)稱長度,mm;L0為對應(yīng)測量點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)線紋尺長度,mm。

    式中:c1=1;c2=1

    標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定:

    花粉樣片標(biāo)定誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(L0):

    可以取標(biāo)準(zhǔn)量引入誤差e=2μm,

    測量時瞄準(zhǔn)誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Li):

    瞄準(zhǔn)時采用單線瞄準(zhǔn),其瞄準(zhǔn)精度a =60″,系統(tǒng)采用10X目鏡,物鏡放大倍數(shù)40X,這時顯微鏡系統(tǒng)的整體放大倍率為K=400X,引用生物顯微鏡規(guī)范的公式進(jìn)行計(jì)算,其瞄準(zhǔn)誤差為:

    該項(xiàng)瞄準(zhǔn)誤差主要以均勻分布的方式影響,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

    合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

    擴(kuò)展不確定度

    U=k×uc=2×1.2=2.4μm

    k=2

    顯微鏡視場范圍為0.2mm,則物鏡放大倍數(shù)誤差的測量不確定度為

    4 結(jié)論

    通過對制作花粉樣片校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)方法的不確定度分析,得到該方法的不確定UΔβ=1.2%,滿足1/3標(biāo)準(zhǔn)器的選擇原則,因此,在沒有直接標(biāo)準(zhǔn)器時,可以用間接方法,通過制作花粉樣片來校準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡平臺實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的放大倍數(shù)。

    [1] JJF 1402—2013《生物顯微鏡校準(zhǔn)規(guī)范》

    [2] JJF 1071—2010《國家計(jì)量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》

    [3] JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》

    [4] 鄔國耀.萬能工具顯微鏡使用功能的拓展.計(jì)量技術(shù),2002(8)

    10.3969/j.issn.1000-0771.2015.4.17

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