玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子ABP7的啟動子克隆及其活性分析

王銀曉， 趙 軍

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，作物基因組與遺傳改良研究室玉米功能基因組創(chuàng)新團(tuán)隊；農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程，北京100081

玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子ABP7的啟動子克隆及其活性分析

王銀曉， 趙 軍?

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，作物基因組與遺傳改良研究室玉米功能基因組創(chuàng)新團(tuán)隊；農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程，北京100081

bHLH類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，在花的形態(tài)建成、光和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著重要作用，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)理尚待深入研究。從玉米中克隆了bHLH類轉(zhuǎn)錄因子ABP7，初步研究結(jié)果顯示它可能參與了籽粒形成、激素應(yīng)答等多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控。為進(jìn)一步闡明ABP7基因上游調(diào)控途徑，克隆了ABP7的5′側(cè)翼序列，利用原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系驗證了其啟動子活性，并對其順式作用元件進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，位于ABP7基因起始密碼子上游長為2 266 bp的DNA序列具有啟動子活性，能夠啟動報告基因的表達(dá)，并且存在許多潛在的與GA、IAA和ABA激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，為進(jìn)一步鑒定ABP7基因發(fā)揮作用的信號途徑、上游調(diào)控因子和分子機(jī)理以及ABP7基因在玉米生長發(fā)育和逆境應(yīng)答中的功能奠定了基礎(chǔ)。

bHLH；啟動子；瞬時表達(dá)

bHLH類轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，是一個巨大的轉(zhuǎn)錄因子家族[1]，其參與調(diào)控了大量的生物學(xué)過程。目前在植物中已經(jīng)克隆到500多條bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因序列[2]。對這些基因的研究表明，在植物中bHLH類轉(zhuǎn)錄因子主要與生長發(fā)育、脅迫應(yīng)答和次生代謝等生物學(xué)過程相關(guān)。如HECATE(HEC)基因涉及雌性生殖組織的發(fā)育調(diào)節(jié)，在HEC1、HEC2和HEC3 3種同源基因突變體的不同組合中，植物表現(xiàn)出了不同程度的不育[3]。位于擬南芥第 5號染色體上的GLABRA3(GL3)也是一個編碼bHLH蛋白的基因，其突變后會使表皮毛數(shù)量減少，反之，較高的表達(dá)則造成表皮毛數(shù)量的增加[4]。同樣，來自擬南芥的ICE1也是一種bHLH類轉(zhuǎn)錄因子，它能夠特異性地結(jié)合位于CBFs基因啟動子上的E-BOX (CANNTG)序列，調(diào)控CBFs基因的表達(dá)，從而參與對逆境脅迫的應(yīng)答[5，6]?？偟膩碚f，盡管bHLH類轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育的各個階段都發(fā)揮著重要的作用，但與動物中的bHLH類蛋白相比，在植物中的研究起步較晚，對其表達(dá)調(diào)控的信號途徑和分子機(jī)制的研究還有待深入研究。

本課題組在前期研究中從授粉后17 d的玉米幼胚的cDNA文庫中克隆了bHLH類轉(zhuǎn)錄因子ABP7(未發(fā)表數(shù)據(jù))。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的初步研究結(jié)果顯示，ABP7可能參與了逆境和激素應(yīng)答、籽粒發(fā)育等多個生物學(xué)過程的調(diào)控[7]，但其發(fā)揮作用的信號途徑和上游調(diào)控因子還不清楚。因此，本文克隆了ABP7的5′側(cè)翼序列，分析了其序列特征并在瞬時表達(dá)體系中證明了其具有啟動子活性，為進(jìn)一步闡明ABP7上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和ABP7在玉米中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的玉米齊319自交系和構(gòu)建瞬時表達(dá)載體的載體骨架均由本實驗室保存；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化所用的纖維素酶R10(cellulase R10)和離析酶R10(macerozyme R10)由日本Yakult公司生產(chǎn)；GUS酶促反應(yīng)底物4-甲基傘型酮-B-D-葡糖苷酸(4-MUG)和產(chǎn)物4-甲基傘形酮(4-MU)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、甘露醇(mannitol)、聚乙二醇4000(PEG4000)和氯化鉀等無機(jī)鹽購自Sigma公司；啟動子克隆所用的Trans Start Fastpfu DNA聚合酶及pEasy-blunt原核表達(dá)載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；用于酶切和PCR等DNA片段純化回收的試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Luciferase酶活測定試劑盒(Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer)購自Promega公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 啟動子克隆 取玉米齊319大喇叭口期長約5 cm、寬1 cm的葉片，用CTAB法[8]提取玉米葉片基因組DNA，于-20℃保存。根據(jù)已知的玉米B73自交系基因組序列設(shè)計引物，正向引物位于B73基因組ABP7基因起始密碼子上游2 274 bp，反向引物位于ABP7編碼區(qū)第一個外顯子中，距離起始密碼子300 bp。引物序列Foward:5′-TTCGCTTTCATGTAATCGTTGTGC-3′，Reverse:5′-CTGAAGAATCCAGTCTGCGC-3′。以提取的齊319自交系基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和克隆。PCR反應(yīng)體系(50μL)如下:1×pfu Buffer，0.3 mmol/L dNTPs，0.4 pmol/L正、反向引物，50 ng基因組模板，20 units Fastpfu DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增程序為:94℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸70 s，33個循環(huán)；72℃延伸5 min?；厥誔CR產(chǎn)物，同pEasy-blunt原核表達(dá)載體連接，構(gòu)建的pEasy-blunt-Pabp7載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后，篩選得到陽性克隆。

1.2.2 Pabp7:GUS瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)實驗室保存的p IG46(含mini35S:GUS)瞬時表達(dá)載體的序列圖譜設(shè)計方案。用 PCR方法將Pabp7序列兩端加上ClaⅠ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點，其中正向引物位于-2 266 bp，反向引物位于-1 bp，引物序列 Foward:5′-ATCGATTTCGCTTTCATGTAATCGTTGTGC-3′，Reverse:5′-CTGCAGGCTGTCCGTTGAAAGAGAG-3′，以pEasyblunt-Pabp7質(zhì)粒為模板，PCR體系如下:1×pfu Buffer，0.3 mmol/L dNTPs，0.4 pmol/L正、反向引物，50 ng基因組模板，20 U Fastpfu DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，54℃退火20 s，72℃延伸70 s，33個循環(huán)；72℃延伸5 min。ClaⅠ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切所得PCR產(chǎn)物和p IG46載體，回收Pabp7目的片段及pIG46載體片段。連接轉(zhuǎn)化，篩選得到陽性克隆即為Pabp7:GUS瞬時表達(dá)載體。

1.2.3 Pabp7:GFP瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建 同Pabp7:GUS瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建相似，所用骨架為pIG46-Pabp7:GUS瞬時表達(dá)載體。用PCR方法將GFP-Tnos序列兩端加上PstⅠ和Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點，引物序列Forward:5′-CTGCAGATGAGTAAAGGAGAAGAA-3′，Reverse:5′-GAATTCCCGATCTAGTAACATAGATG-3′，以實驗室保存的pRTL(含35S:GFP)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的片段，PCR體系和反應(yīng)條件同Pabp7:GUS瞬時表達(dá)載體的構(gòu)建過程。PstⅠ和Eco RⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切所得PCR產(chǎn)物和p IG46-Pabp7:GUS載體，回收得到 GFP-Tnos目的片段及 p IG46-Pabp7:GUS載體片段。連接轉(zhuǎn)化，篩選得到陽性克隆即為Pabp7:GFP瞬時表達(dá)載體。

1.2.4 玉米原生質(zhì)體分離及轉(zhuǎn)化 采用CsCl密度梯度離心法純化5～8 mg的質(zhì)粒DNA[9]，選取黑暗條件下生長的齊319二葉一心的玉米幼苗，取其第一片真葉中部5～6 cm，將其切成寬為1 mm左右的細(xì)絲置于10mL酶解液(1.5%纖維素酶 R10，0.4%離析酶 R10，0.02 mol/L KCl，0.02 mol/L MES，0.4 mol/L甘露醇，0.01 mol/L GaCl2，0.1%BSA)中，避光酶解5 h，酶解過程始終保持40 r/min持續(xù)震蕩。此過程細(xì)胞壁不斷酶解，使玉米葉肉原生質(zhì)體從組織中分離出來。

參考Yoo等[10]和謝禮[9，11]的PEG誘導(dǎo)葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化法，對實驗細(xì)節(jié)略加改動。主要改動包括:①在洗去酶解液后，用W5溶液(0.154 mol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES，0.125 mol/L GaCl2)輕柔重懸收集到的原生質(zhì)體，冰上放置40min，以達(dá)到徹底沉降原生質(zhì)體的目的；②完成原生質(zhì)體沉降后，50 g離心1 min，以避免過高的離心力導(dǎo)致細(xì)胞間壓力過大，減小對原生質(zhì)體的傷害；③加入220μL 30%的PEGGa2＋溶液(30%PEG，0.1 mol/L GaCl2，0.2 mol/L甘露醇)后，室溫誘導(dǎo)10 min，這樣既可以保證有較高的誘導(dǎo)效率，又可以減少PEG對原生質(zhì)體造成的傷害。

1.2.5 GUS酶活測定 收集過夜培養(yǎng)的原生質(zhì)體，100 g離心2 min，棄上清，向沉淀中加入Reporter Lysis Buffer裂解原生質(zhì)體，此時的溶液即為含有GUS蛋白和熒光素酶蛋白的粗提液。參照Loffler等[12]的GUS酶活測定方法，以4-MUG為底物，通過測定反應(yīng)生成的4-MU的量來檢測GUS的酶量。LUC酶活的測定按Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer試劑盒使用說明所述方法進(jìn)行。以組成型表達(dá)的LUC酶活值作為內(nèi)參，計算p IG46和Pabp7:GUS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體時GUS的相對表達(dá)量。

1.2.6 綠色熒光光蛋白(GFP)自發(fā)熒光觀察 將構(gòu)建的Pabp7:GFP載體轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，在LSM 700激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABP7啟動子的克隆和序列分析

為了研究ABP7上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要克隆和分析ABP7啟動子序列。由于ABP7基因最初是從玉米自交系齊319中克隆的，為保持研究的一致性，仍從該自交系中克隆ABP7啟動子序列。為此，參照B73基因組序列中ABP7基因的高度同源序列，分別在其起始 ATG的＋303 bp和-2 274 bp位點設(shè)計引物，以齊319基因組DNA為模板，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，并比較了所得序列在齊319和B73兩個自交系中的差異。

如圖1所示，從玉米齊319基因組中克隆了長為2 569 bp的DNA片段。經(jīng)測序和序列比對，其中2 266 bp位于ABP7基因起始密碼子ATG上游，303 bp位于ABP7基因編碼區(qū)內(nèi)。

圖1 ABP7基因5′側(cè)翼區(qū)的克隆

序列比較(圖2)發(fā)現(xiàn)，克隆的ABP7的5′側(cè)翼序列在齊319和B73自交系基因組間相似度高達(dá)99%；差異在于:有1個位點發(fā)生多堿基插入，2個位點存在核苷酸的轉(zhuǎn)換。具體來說，在-2 130 bp位點，較之B73，齊319中的ABP7的啟動子序列多出一段TATATATA序列；在-1 142 bp位點，齊319中為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸(A)，而B73中為鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸(G)；在-438 bp位點，在齊319中為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸(T)，取代了 B73中的胞嘧啶脫氧核糖核苷酸(C)。

2.2 啟動子活性檢測

為驗證克隆得到的ABP7的5′側(cè)翼序列是否具有啟動子活性，用Pabp7分別驅(qū)動GUS和GFP報告基因表達(dá)的兩種瞬時表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染玉米葉肉原生質(zhì)體，進(jìn)行了GUS酶活測定和GFP熒光觀察。

圖2 ABP7基因在兩個自交系中的序列差異分析Fig.2 Alignmen results in B73 and Qi319 of ABP7 gene.

GUS酶活測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Pabp7:GUS質(zhì)粒的原生質(zhì)體中GUS的相對酶活顯著高于轉(zhuǎn)染mini35S:GUS的原生質(zhì)體中的相對酶活(圖3A，彩圖見圖版一)。通過觀察GFP的發(fā)光情況可知，轉(zhuǎn)染Pabp7:GFP質(zhì)粒的原生質(zhì)體中可見GFP的自發(fā)熒光(圖3B)。這表明克隆到的長為2 266 bp的DNA片段具有啟動子活性，能夠啟動報告基因的表達(dá)。

2.3 啟動子結(jié)構(gòu)的分析

為獲得控制ABP7表達(dá)的上游調(diào)控因子的線索，本文利用PLACE[13]在線網(wǎng)站分析了ABP7啟動子的序列結(jié)構(gòu)(表1)。由分析結(jié)果可知，在克隆到的長為2 266 bp的ABP7啟動子中主要包含了核心啟動子序列和其上游的調(diào)控元件。核心啟動子序列包括:精確啟動必須的TATA區(qū)和控制轉(zhuǎn)錄頻率的CAAT區(qū)。上游調(diào)控元件主要分為3大類:①與基因表達(dá)組織特異性相關(guān)的元件，這類元件主要包括了CACTFTPPCA1、DOFCOREZM、DPBFCOREDCDC3、ACIPVPAL2和NTBBF 1ARROLB；②與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的元件，主要包括DPBFCOREDCDC3、NTBBF1ARROLB、CATATGGMSAUR、GARE2OSREP1、GCCCORE、SBOXATRBCS、SURECOREATSULTR11、ASF1MOTIFCAMV、TATCCAOSAMY和WRKY71OS；③與植物逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件，主要包括 ACGTATERD1、CBFHV、MYBCORE、P1BS、WRKY71OS和ABRELATERD1。

圖3 ABP7基因5′側(cè)翼區(qū)的啟動子活性檢測結(jié)果Fig.3 Promoter activity assays of the 5′flanking sequence of ABP7 in transformed protoplasts.

表1 ABP7啟動子中順式元件預(yù)測Table 1 Potential cis-acting elements in ABP7 promoter.

續(xù)表

2.4 ABP7啟動子的聚類分析

為了進(jìn)一步分析ABP7可能參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其具體作用，本實驗利用MEGA軟件Blast出同ABP7啟動子相似性較高的其他基因的啟動子序列，并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示，GrmZm2g14475(ABP7)基因啟動子與屬于玉米中的GrmZm2g083504基因啟動子的相似度最高，其次是高粱中Sb07g026610基因啟動子和水稻日本晴中 Os08g0524800基因啟動子，而與水稻中Os09g0501600基因啟動子和高粱中Sb03g043690基因啟動子的相似性最低。NCBI數(shù)據(jù)庫標(biāo)注顯示GrmZm2g083504為一種HLH轉(zhuǎn)錄因子，其可能參與了包括細(xì)胞伸長、花粉發(fā)育在內(nèi)的生長發(fā)育過程，而其他幾種基因啟動子和功能則研究較少，幾乎沒有相關(guān)報道。

圖4 ABP7啟動子的聚類分析圖Fig.4 Dendrogram of ABP7 promoter.

3 討論

本研究成功克隆了ABP7的5′側(cè)翼序列，并在玉米原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系中證實其能夠啟動下游基因的表達(dá)，是一個功能啟動子。這一結(jié)論得到了序列分析和比對結(jié)果的支持:所克隆的ABP7的5′側(cè)翼序列不但具有核心啟動子序列，還包括生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)和逆境應(yīng)答相關(guān)順式元件。本研究獲得的ABP7啟動子為進(jìn)一步分析ABP7基因所參與的信號途徑、上游調(diào)控因子和分子機(jī)理提供了研究靶標(biāo)，并為鑒定ABP7在玉米生長發(fā)育和逆境應(yīng)答中的功能提供了時空調(diào)控元件。

序列比對結(jié)果顯示，在克隆的ABP7啟動子序列中，存在與IAA、ABA、GA等激素信號響應(yīng)、逆境信號響應(yīng)和組織特異性表達(dá)相關(guān)的順式作用元件。例如，ACIPVPAL2元件可能是基因在維管組織中特異表達(dá)所必需的[14～16]；ACGTATERD1元件在擬南芥中可能與早期響應(yīng)干旱脅迫、誘導(dǎo)植物黃化的基因表達(dá)有關(guān)；GCCCORE是一種乙烯應(yīng)答元件，在調(diào)節(jié)茉莉酮酸酯應(yīng)答的基因表達(dá)中有重要作用，番茄的Pti4(ERF)通過GCC Box和non-GCC Box順式元件[Myb1(GTTAGTT)和GBox(CACGTG)]調(diào)控著防御相關(guān)基因的表達(dá)[17]；DPBFCOREDCDC3是 bZIP類轉(zhuǎn)錄因子DPBF-1和DPBF-2(Dc3啟動子結(jié)合因子-1和2)結(jié)合的核心序列，發(fā)現(xiàn)于胡蘿卜Dc3基因啟動子中，Dc3表達(dá)具有胚特異性，并且可以被ABA誘導(dǎo)[18，19]。這些結(jié)果暗示ABP7基因可能具有組織表達(dá)特異性并受多種激素的調(diào)控，在植物生長發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。據(jù)此，后續(xù)將以ABP7啟動子驅(qū)動的報告基因表達(dá)為指標(biāo)對ABP7基因可能參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、上游調(diào)控因子和分子機(jī)理開展深入研究；同時利用ABP7啟動子驅(qū)動ABP7過表達(dá)和下調(diào)表達(dá)在轉(zhuǎn)基因玉米中分析 ABP7在生長發(fā)育和逆境應(yīng)答中的作用。

比較分析ABP7啟動子在B73和齊319兩種自交系中的序列異同發(fā)現(xiàn)，在兩種自交系中ABP7啟動子的序列相似性高達(dá)99%，雖然較之B73，在齊319中存在8個核苷酸的插入和2個核苷酸的轉(zhuǎn)換，但是這些差異并沒有分布在預(yù)測到的可能的調(diào)控元件上。這暗示在B73和齊319兩個玉米自交系中，ABP7參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能沒有本質(zhì)的差異。

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The Promoter Cloning and Activity Analysis of Maize bHLH Transcription Factor ABP7

WANG Yin-xiao，ZHAO Jun?
Faculty of Maize Functional Genomics，Department ofCrop Genome Research and Genetic Improvement；National Key Facility forCrop Gene Resources and Genetic Improvement，Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China

Basichelix-loop-helix(bHLH)transcription factors are widely present in plants，which play important roles in flower morphogenesis，light signal transduction and hormonal signal transduction.However，the molecular mechanisms regulating their expression remain largely unknown.In this paper，we previously cloned a bHLH transcription factor gene from maize，designated ABP7，and preliminary data suggestted that it might be involved in multiple signal transduction pathways such as kernel development and hormone response.For further elucidation of the upstream pathways regulating ABP7 expression，we cloned the 5′flanking sequence of ABP7，verified its promoter activity by transient expression in maize protoplasts，and predicted its cisacting elements.The results showed that the cloned 2 266 bp 5′flanking region is a functional promoter which is capable to drive the expression of downstream reporter，and contains many potential cis-acting elements involved in the signaling of hormones such as GA、IAA and ABA，and responses to adverse environments.These results set a base for future studies in identification of upstream regulatory networks that control ABP7 expression，and in unraveling the specific roles of ABP7 in plant growth，development and stress response.

bHLH；promoter；transient expression

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.06

2015-05-08；接受日期:2015-06-02

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX0800941B)資助。

王銀曉，碩士研究生，主要從事植物非生物逆境傳導(dǎo)研究。E-mail:hengshuiyin＠163.com。?通信作者:趙 軍，研究員，博士，主要從事植物抗逆性和籽粒發(fā)育分子生物學(xué)和分子育種研究。E-mail:zhaojun01＠caas.cn