藍(lán)藻無(wú)菌化方法研究進(jìn)展

李天麗， 鄭凌凌， 張 琪， 宋立榮

中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072

藍(lán)藻無(wú)菌化方法研究進(jìn)展

李天麗， 鄭凌凌， 張 琪， 宋立榮?

中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072

隨著微藻產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，藍(lán)藻作為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的資源受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，其多糖和蛋白的開發(fā)已被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。為了更深入清晰地挖掘藍(lán)藻的特性和功能，研究者首先需獲得無(wú)菌的純種藻株，這是深入開展藍(lán)藻生理生化、遺傳和毒性等研究的基礎(chǔ)。重點(diǎn)綜述了如何根據(jù)藍(lán)藻的結(jié)構(gòu)及生理特性選擇合適的無(wú)菌化方法，介紹了基于藍(lán)藻與污染菌之間差異性的無(wú)菌化方法，以期為藍(lán)藻的無(wú)菌化工作提供參考。

藍(lán)藻；無(wú)菌化方法

藍(lán)藻，又被稱為藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)，是一類結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、進(jìn)化歷史悠久、能進(jìn)行光合作用的原核生物，為單細(xì)胞、絲狀或非絲狀的群體。近年來(lái)，藍(lán)藻因其部分種類可引發(fā)水華[1]而受到越來(lái)越多的關(guān)注。另一方面，藍(lán)藻具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其多糖和蛋白可被開發(fā)應(yīng)用于食品醫(yī)藥[2～4]、日用化工[5]和環(huán)保[6]等領(lǐng)域。然而，由于無(wú)法獲得藍(lán)藻的無(wú)菌株制約了科學(xué)家們對(duì)于藍(lán)藻的研究開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化，其主要原因在于從自然界中獲取的藍(lán)藻不是無(wú)菌的，它們通常與細(xì)菌黏附在一起，而細(xì)菌與藍(lán)藻的關(guān)系是多種多樣的，有的細(xì)菌會(huì)促進(jìn)藍(lán)藻的生長(zhǎng)[7]，有的細(xì)菌與藍(lán)藻在一起會(huì)產(chǎn)生溶藻或者抑藻效應(yīng)[8，9]。獲得藻種的無(wú)菌培養(yǎng)株對(duì)于其生理生化、分子遺傳、毒性及分類等研究都是必要的，細(xì)菌或者霉菌的存在會(huì)對(duì)研究產(chǎn)生干擾，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，故藍(lán)藻的無(wú)菌化是順利完成很多實(shí)驗(yàn)的前提。另外，藻種無(wú)菌化程度也是衡量藻株質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一，為了提高保藏藻株的質(zhì)量，國(guó)際上主要的藻種庫(kù)都十分關(guān)注藻株的無(wú)菌化問(wèn)題，如法國(guó)巴斯德研究所菌物保藏中心(Pasteur Culture Collection，PCC)藻種庫(kù)長(zhǎng)期以來(lái)在藍(lán)藻的純化方面做了很多工作[10，11]，在藍(lán)藻無(wú)菌株的獲得方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行純化存在諸多的困難，如步驟繁瑣、純化周期長(zhǎng)以及易反復(fù)感染等，基于此，本文根據(jù)近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)藍(lán)藻的無(wú)菌化技術(shù)進(jìn)行歸類綜述，以期為藍(lán)藻的研究開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化研究提供技術(shù)參考。

1 基于藍(lán)藻的結(jié)構(gòu)及生理特性的純化方法

藍(lán)藻被稱為是極端環(huán)境的開路先鋒，實(shí)行荒漠化治理后的沙原戈壁，最先生長(zhǎng)出的生物往往是藍(lán)藻，它是荒漠中生物結(jié)皮形成最關(guān)鍵的必須生物[12]，在溫泉或極地，潮濕土壤中或干燥的巖石上，都會(huì)有藍(lán)藻的存在。藍(lán)藻之所以適應(yīng)環(huán)境的能力如此強(qiáng)大，是與其結(jié)構(gòu)和生理特性密不可分的。與其他微藻不同，藍(lán)藻屬于原核生物，沒(méi)有細(xì)胞核和色素體，但有些結(jié)構(gòu)和生理特性是藍(lán)藻所特有的，在有些種類的絲狀藍(lán)藻中，我們能同時(shí)觀察到多達(dá)4種細(xì)胞類型:可以進(jìn)行光合放氧及CO2固定的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、具有滑行運(yùn)動(dòng)能力的藻殖段的細(xì)胞、休眠的厚壁孢子以及可固定空氣中氮素的異形胞[13]?？梢愿鶕?jù)這些結(jié)構(gòu)和特性對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行純化。

1.1 可產(chǎn)生厚壁孢子的藍(lán)藻

某些藍(lán)藻在生長(zhǎng)受到脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具備休眠和繁殖功能的厚壁孢子，以適應(yīng)不良的環(huán)境，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境恢復(fù)正常后，厚壁孢子會(huì)萌發(fā)成正常的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。厚壁孢子能夠耐受較高的溫度，可以根據(jù)這一特性對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行純化。Wieringa[14]利用高溫(47～48℃，15～75min)對(duì)缺氮條件下培養(yǎng)的魚腥藻、念珠藻等進(jìn)行處理，得到了系列無(wú)菌株。此方法適用于可產(chǎn)生厚壁孢子的藍(lán)藻，且污染的細(xì)菌不能產(chǎn)生孢子。

另外，針對(duì)可分化產(chǎn)生厚壁孢子的藍(lán)藻，可采用一些具備較強(qiáng)的殺菌或者抑菌效果的化學(xué)試劑進(jìn)行處理以達(dá)到除菌效果。Vaz等[15]利用次氯酸鈉對(duì)3株念珠藻進(jìn)行了純化:用BG-110(缺氮培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)，直至分化產(chǎn)生大量的厚壁孢子，再用稀釋的次氯酸鈉溶液(1%、2%、3%)分別處理10 s、20 s、30 s，涂布于BG-110(缺氮培養(yǎng)基)固體平板，培養(yǎng)至少2周。結(jié)果顯示，用次氯酸鈉溶液處理10 s即可達(dá)到除菌的效果，此方法操作簡(jiǎn)單快速、成本低，適用于可產(chǎn)生厚壁孢子的藍(lán)藻。

1.2 具有趨光運(yùn)動(dòng)特性的藍(lán)藻

約一半的單細(xì)胞藍(lán)藻和四分之三的絲狀藍(lán)藻在固體培養(yǎng)基中可表現(xiàn)出趨光運(yùn)動(dòng)的特性[10]，Vaara等[16]利用這一特性，對(duì)偽魚腥藻、顫藻、鞘絲藻、席藻和魚腥藻等進(jìn)行了純化:在 1%的BG11固體平板上劃水平線，然后將少量藻種接種到平板中央，26℃單向光照下(50～100 lx)培養(yǎng)，光照方向與劃線方向平行，過(guò)夜培養(yǎng)后在顯微鏡下挑取。對(duì)比實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，絲狀藍(lán)藻在劃線平板上的滑動(dòng)距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未劃線平板上的滑動(dòng)距離，在滑動(dòng)過(guò)程中，藍(lán)藻可進(jìn)行自清潔，與吸附的細(xì)菌分離開來(lái)，最終達(dá)到除菌的目的。

1.3 具有偽空胞的藍(lán)藻

有些種類的藍(lán)藻細(xì)胞(如微囊藻、束絲藻、魚腥藻和阿氏顫藻等)中含有偽空胞，在顯微鏡下這些偽空胞呈現(xiàn)黑色、紅色或紫色。藍(lán)藻可以通過(guò)偽空胞調(diào)節(jié)自身的浮力進(jìn)行垂直遷移，以獲取適宜的光能和充足的營(yíng)養(yǎng)鹽[17]。由于偽空胞的存在，可造成藍(lán)藻細(xì)胞與污染菌之間的懸浮性差異，可利用這種差異性對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行純化。Shirai等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有些微囊藻藻株單純使用平板涂布的方法無(wú)法得到無(wú)菌株，于是嘗試?yán)酶缴c微囊藻的不同懸浮特點(diǎn)進(jìn)行分離，在平板涂布方法基礎(chǔ)上嘗試了兩步離心法:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的藻液用無(wú)菌水稀釋100倍，漩渦震蕩，取1 mL細(xì)胞懸浮液于1.5 mL離心管中，150 g，20℃離心30 min，使得具有偽空胞的微囊藻細(xì)胞停留在液體上層，而細(xì)菌的數(shù)量減少三分之二，隨后2 000～3 000 g，20℃離心5 min，高速離心用以去除上層液體中的細(xì)菌，取上層液體1μL在CB瓊脂糖固體平板上進(jìn)行涂布，長(zhǎng)出單個(gè)藻落后進(jìn)行挑取培養(yǎng)，獲得了無(wú)菌微囊藻。

1.4 具有異形胞的藍(lán)藻

有些藍(lán)藻和固氮菌一樣，具有固氮酶，能夠?qū)⒖諝庵杏坞x氮素進(jìn)行同化，為細(xì)胞自身生長(zhǎng)提供含氮化合物。在進(jìn)行顯微觀察時(shí)，成熟的異形胞比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞體積稍大，色素減少，包被加厚。異形胞的存在使得固氮藍(lán)藻能夠在缺氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可以利用缺氮培養(yǎng)基進(jìn)行純化以提高藻-菌比例，再結(jié)合其他純化方法得到無(wú)菌株[6]。作者利用BG-110(缺氮)固體平板培養(yǎng)基對(duì)魚腥藻和念珠藻進(jìn)行劃線純化，在反復(fù)劃線數(shù)次后發(fā)現(xiàn)污染菌的數(shù)量大大減少，但仍需結(jié)合其他純化方法才能得到無(wú)菌株。若外源污染中含有固氮菌，則此法不宜采用。

1.5 細(xì)胞表面有多糖膠被的藍(lán)藻

很多藍(lán)藻細(xì)胞表面具有多糖膠被，由于多糖膠被與藍(lán)藻細(xì)胞很難完全分離，故黏附在多糖膠被上的細(xì)菌很難被去除。Fujishiro等[19]在對(duì)隱桿藻進(jìn)行純化時(shí)，通過(guò)對(duì)藻液進(jìn)行超聲后離心(14 000 g，10 min)的方法，去除了隱桿藻細(xì)胞表面的多糖，從而也去除了多糖黏附的細(xì)菌，再加入到40%～50%的碘克沙醇溶液中進(jìn)行超速離心(112 700 g，2 h)，最大程度地去除了細(xì)菌污染。

2 基于藍(lán)藻與污染菌之間差異性的純化方法

2.1 抗生素方法

抗生素是微生物的代謝產(chǎn)物或人工合成的類似物，可以干擾其他微生物的生長(zhǎng)或代謝。不同的抗生素可以通過(guò)不同的途徑來(lái)抑制細(xì)菌的繁殖，其抑菌機(jī)制主要分為4種類型:干擾細(xì)胞壁的合成、損傷細(xì)胞膜滲透性、抑制蛋白質(zhì)合成以及抑制核酸的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制[20]，可根據(jù)藍(lán)藻與細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受性差異來(lái)選擇合適的抗生素作為除菌的有力工具[21]。

利用抗生素對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行除菌的優(yōu)點(diǎn)是周期短、見(jiàn)效快，近年來(lái)越來(lái)越多的研究者選擇用此法進(jìn)行藍(lán)藻的純化。Han等[22]嘗試了7種抗生素用于念珠藻的無(wú)菌化，利用代謝組學(xué)的方法優(yōu)化和評(píng)估了抗生素處理，比較了念珠藻對(duì)各種抗生素的耐受性，深入研究了其中4種抗生素對(duì)念珠藻代謝活性的影響，以及去除抗生素后念珠藻的代謝修復(fù)及其所需時(shí)間，最終確定抗生素的最佳添加順序，依次為壯觀霉素(奇霉素)、慶大霉素、氨芐青霉素和卡那霉素。

Han等[23]為了獲得銅綠微囊藻的無(wú)菌株，在對(duì)其進(jìn)行超聲-過(guò)濾洗滌后，依次用卡那霉素(50μg/mL)、氨芐西林(100μg/mL)、亞胺培南(50μg/mL)25℃處理過(guò)夜，在此需要注意的是，在每種抗生素處理完后需進(jìn)行過(guò)濾洗滌以去除此種抗生素，再加入新抗生素處理。若同時(shí)加入3種抗生素，會(huì)因?qū)ξ⒛以寮?xì)胞殺傷力太大而致死。

在應(yīng)用抗生素進(jìn)行處理時(shí)，可加入有機(jī)質(zhì)來(lái)促進(jìn)污染菌的生長(zhǎng)，使得這些污染菌優(yōu)先被抗生素作用。Choi等[24]利用亞胺培南(100μg/mL)、新霉素(100μg/mL)、放線菌酮(20μg/mL)對(duì)鈍頂螺旋藻進(jìn)行連續(xù)處理，在加入抗生素的同時(shí)添加了0.1%的葡萄糖，以促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，且需在黑暗條件下處理，若在光照條件下處理，藻細(xì)胞會(huì)因生長(zhǎng)代謝旺盛而受到抗生素的迫害，導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。

不同藻株在不同環(huán)境中污染的雜菌類型不同，為了增強(qiáng)抗生素的除菌效果，可對(duì)污染菌進(jìn)行鑒定，從而有針對(duì)性地選擇合適的抗生素進(jìn)行處理。Hong等[25]對(duì)能源微藻——節(jié)球藻進(jìn)行了純化，再采用放線菌酮(20μg/mL)、亞胺培南(100μg/mL)對(duì)目的藻株進(jìn)行24 h的黑暗處理后在BG11平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，但只使得部分藻株得到了純化，對(duì)于未能純化干凈的藻株，對(duì)其污染細(xì)菌進(jìn)行了分離鑒定，有針對(duì)性地選擇了卡那霉素(100μg/mL)進(jìn)行處理，最后得到了無(wú)菌株。

由于藍(lán)藻是原核生物，與細(xì)菌的遺傳距離小，所以在利用抗生素除菌時(shí)，會(huì)對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞產(chǎn)生傷害，藻株對(duì)于不同的抗生素耐受性不同，故在用此法進(jìn)行除菌時(shí)，需檢測(cè)藻株對(duì)于抗生素的最低致死濃度[24]。

2.2 化學(xué)試劑方法

某些化學(xué)試劑具備較強(qiáng)的殺菌或者抑菌效果，但藍(lán)藻對(duì)其卻表現(xiàn)出一定的耐受性，根據(jù)這種差異性可選擇合適的化學(xué)藥品對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行純化，其純化效果主要取決于試劑種類的選擇、作用的濃度和處理的時(shí)間等，在具體操作中，需對(duì)作用濃度和處理時(shí)間進(jìn)行摸索，以求除菌效果顯著的同時(shí)對(duì)藻細(xì)胞的傷害降到最低。

除了利用次氯酸鈉溶液進(jìn)行藍(lán)藻純化外，根據(jù)藍(lán)藻和細(xì)菌對(duì)硫化物的耐受性不同，可采用硫化物處理的方法進(jìn)行純化。Bolch等[26]采用不同濃度的Na2S對(duì)8株銅綠微囊藻進(jìn)行純化，最后得到3株無(wú)菌株。此方法操作簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快，但是某些藍(lán)藻對(duì)硫化物的耐受性表現(xiàn)得比細(xì)菌還要低，則無(wú)法使用此方法進(jìn)行純化。

溶菌酶也可用于藍(lán)藻純化，Kim等[27]利用溶菌酶對(duì)水華魚腥藻進(jìn)行除菌:在藻種培養(yǎng)液中加入溶菌酶后于37℃作用60～90 min，離心洗滌后取50μL培養(yǎng)液涂布于1.5%BG11固體平板，待長(zhǎng)出后挑取單藻落培養(yǎng)，結(jié)果顯示1 g/L的溶菌酶濃度對(duì)水華魚腥藻的除菌效果最佳，且對(duì)藻細(xì)胞傷害不大。

此外，苯酚[28]、亞硫酸鈉[29]、疊氮化鈉、氟化鈉[30]等也被用于藍(lán)藻的純化。

2.3 紫外照射方法

紫外照射方法是基于藍(lán)藻和細(xì)菌在抵抗紫外照射方面的差異性上建立起來(lái)的，由于藍(lán)藻在紫外照射下會(huì)啟動(dòng)自身的保護(hù)機(jī)制[31～33]，因此相對(duì)細(xì)菌而言具有較高的抗UV能力。Gerloff等[34]采用紫外照射的方法獲得了無(wú)菌的聚球藻；李靜等[35]采用抗生素和紫外照射聯(lián)合處理的方法得到了微囊藻的無(wú)菌株。

3 其他方法

平板涂布與劃線是得到純培養(yǎng)物最傳統(tǒng)經(jīng)典的方法，日本學(xué)者Shirai等[36]應(yīng)用B-12和CB固體培養(yǎng)基對(duì)微囊藻進(jìn)行了無(wú)菌化:取0.1 mL的藻液(渦旋震蕩后稀釋100倍)加入到10 mL滅菌冷卻未凝固的固體培養(yǎng)基(0.4%～1%)中，倒平板，或?qū)⑾♂尩脑逡褐苯油坎荚谀痰墓腆w平板上，長(zhǎng)出藻落后進(jìn)行分離。Nishizawa等[37]在上述方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)偽魚腥藻進(jìn)行了純化，為了盡量得到單細(xì)胞，取指數(shù)生長(zhǎng)早期1 mL的藻液，加入直徑為1.8～2 mm的玻璃珠后漩渦震蕩30 s，然后400 g、20℃離心20min，將上清涂布在0.4%的固體CB瓊脂糖培養(yǎng)基上，待單藻落長(zhǎng)出后挑出培養(yǎng)。Hong等[38]利用平板劃線的方法從采自南極的藻墊樣品中分離出顫藻。此方法優(yōu)點(diǎn)在于成本低、操作方便，對(duì)藻細(xì)胞本身傷害??；缺點(diǎn)在于無(wú)菌化周期較長(zhǎng)，有時(shí)需反復(fù)涂布或劃線數(shù)次才能得到無(wú)菌株，且對(duì)于含膠被的藍(lán)藻來(lái)說(shuō)成功率較低，故此方法常常與其他無(wú)菌化方法聯(lián)合起來(lái)對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行除菌。

過(guò)濾洗滌方法，需根據(jù)藍(lán)藻細(xì)胞的形態(tài)和大小選擇合適的微孔濾膜或其他濾過(guò)材料，用無(wú)菌水或無(wú)菌培養(yǎng)基對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌，以降低雜菌的數(shù)量，再結(jié)合其他方法獲得無(wú)菌株[39，40]；

毛細(xì)吸管清洗法是采用毛細(xì)吸管在顯微鏡下對(duì)單個(gè)藻細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌以去除細(xì)菌的方法，此方法要求所用器皿全部經(jīng)過(guò)滅菌，且整個(gè)操作過(guò)程在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，王霞等[41]應(yīng)用此法獲得了銅綠微囊藻的無(wú)菌株。

4 綜合處理方法

以上所述方法各具特點(diǎn)，但各具局限性。某些藍(lán)藻與細(xì)菌黏附緊密，或樣品中存在其他的雜質(zhì)，單純使用一種方法難以達(dá)到理想的無(wú)菌化效果，因此需針對(duì)藻種具體的污染情況，采取多種方法聯(lián)合對(duì)藍(lán)藻進(jìn)行處理。

Sena等[42]采用過(guò)濾洗滌、化學(xué)方法等聯(lián)合對(duì)節(jié)旋藻進(jìn)行無(wú)菌化處理:第一步，對(duì)20mL培養(yǎng)液進(jìn)行過(guò)濾洗滌，即利用47μm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，用1 L無(wú)菌緩沖液進(jìn)行洗滌；第二步，高堿處理(pH 12，KOH)72 h，以去除原生動(dòng)物和微囊藻的污染；第三步，組合抗生素處理(氨芐青霉素61.6μg/mL，盤尼西林 85.8μg/mL，頭孢西丁76.9μg/mL，美羅培南38.9μg/mL)，在32℃、150 r/min黑暗處理48 h，離心洗滌去除抗生素；最后一步采用稀釋(1∶10 000)的方法去除色球藻，最終得到節(jié)旋藻的無(wú)菌株。

Li等[43]經(jīng)加熱、超聲、離心洗滌、平板劃線、單向光照培養(yǎng)等步驟得到純化的 Leptolyngbya nodulosa無(wú)菌株。Katoh等[6]利用平板涂布、抗生素處理(卡那霉素5μg/mL，放線菌酮30～50 μg/mL)、離心洗滌等方法從藍(lán)藻結(jié)皮中分離純化得到一株普通念珠藻無(wú)菌株。

5 無(wú)菌檢測(cè)方法

為了判斷是否已得到藻種的無(wú)菌株，需在除菌操作后對(duì)藻種進(jìn)行無(wú)菌化檢測(cè)。若利用抗生素方法進(jìn)行無(wú)菌化，則需在檢測(cè)之前必須經(jīng)過(guò)反復(fù)洗滌和多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，以去除抗生素的影響，避免判斷有誤。常用的無(wú)菌檢測(cè)方法有3種，其方法比較見(jiàn)表1。目前對(duì)于無(wú)菌檢測(cè)方法尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，每種方法具有其優(yōu)缺點(diǎn)，研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件同時(shí)選擇多種方法進(jìn)行檢測(cè)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

6 展望

藍(lán)藻的無(wú)菌化工作通常使研究者感到棘手、繁瑣且耗時(shí)，根據(jù)目的藍(lán)藻的結(jié)構(gòu)和生理特性而有針對(duì)性地選擇純化方法，可以提高純化效率，為藻種的生理生化、遺傳、毒性等研究奠定基礎(chǔ)。相對(duì)而言，生長(zhǎng)繁殖迅速且對(duì)化學(xué)藥物(抗生素、殺菌劑等)耐受性較強(qiáng)的藻類，利用傳統(tǒng)的無(wú)菌化方法較易獲得無(wú)菌藻株，而某些對(duì)化學(xué)藥物較敏感、或具有多糖膠被的單細(xì)胞群體或絲狀體，細(xì)菌常附生在多糖膠被中，用單一的傳統(tǒng)無(wú)菌化方法難以得到無(wú)菌株，因此需針對(duì)藻株的特性和具體染菌情況，設(shè)計(jì)有效可行的除菌方案。

表1 無(wú)菌檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of sterility testingmethods.

目前，隨著流式細(xì)胞儀和顯微操作儀器的發(fā)展，有望大大提高無(wú)菌化工作的效率，Cho等[44]采用超聲波處理-FACS熒光激活細(xì)胞揀選法，顯微鏡下挑取無(wú)菌藻落的方法獲得了小球藻的無(wú)菌株，此方法也可嘗試應(yīng)用于藍(lán)藻的無(wú)菌化，其避免了使用抗生素等化學(xué)試劑對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生的傷害，且操作簡(jiǎn)單快速。另外，在得到藍(lán)藻的無(wú)菌株后，如何長(zhǎng)久地保持藻株的無(wú)菌狀態(tài)更需要深入探究，可通過(guò)一些途徑如改變保藏方式以減少轉(zhuǎn)接頻率，規(guī)范化的無(wú)菌操作等，盡可能減少藻株與外界的接觸，嚴(yán)格控制污染途徑，以保持藻株的無(wú)菌狀態(tài)。

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Progress of Aseptic Purification Technique of Cyanobacteria

LITian-li，ZHENG Ling-ling，ZHANG Qi，SONG Li-rong?
Institute ofHydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China

With the vigorous development of the microalgae industry，people are paying much more attention to cyanobacteria according to its important economic value，as its polysaccharide and protein are applied in many fields.In order to excavate the characteristics and function of cyanobacteriamore in-depth and clearly，it is necessary to obtain axenic cultures of cyanobacteria，which is also regarded as the foundation for the further research on physiological，biochemical，genetic and taxonomic characteristics of cyanobacteria.This papermainly reviewed the chosen of appropriate aseptic purification methods based on their structures and physiological characteristics.Furthermore，the methods based on the differences between cyanobacteria and contaminated bacteria were introduced.The paper was expected to provide useful information for the works on purification of cyanobacteria.

cyanobacteria；aseptic purification technique

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.01

2015-07-06；接受日期:2015-08-24

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2014AA022001)；科技部基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目(2005DKA32300)資助。

李天麗，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事藻種培養(yǎng)與純化方面的研究。E-mail:getli333＠163.com。?通信作者:宋立榮，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事藻類生物學(xué)與湖泊生態(tài)學(xué)方面的研究。E-mail:lrsong＠ihb.ac.cn