美洲大蠊提取物對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心血管氧化損傷的保護(hù)作用*

馬 俊， 曾遠(yuǎn)生， 劉 煒

(1. 重慶大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400044； 2. 重慶工商大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400067； 3. 重慶第二師范學(xué)院教師教育學(xué)院， 重慶 400067)

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美洲大蠊提取物對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心血管氧化損傷的保護(hù)作用*

馬 俊1△， 曾遠(yuǎn)生2， 劉 煒3

(1. 重慶大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400044； 2. 重慶工商大學(xué)體育學(xué)院， 重慶 400067； 3. 重慶第二師范學(xué)院教師教育學(xué)院， 重慶 400067)

目的：通過美洲大蠊提取物(PAE)對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌自由基代謝的影響，探討其對(duì)心肌氧化損傷的保護(hù)作用。方法：雄性SPF級(jí)健康SD大鼠40只，隨機(jī)分為安靜組、運(yùn)動(dòng)組、美洲大蠊提取物安靜組、美洲大蠊提取物運(yùn)動(dòng)組(n=10)。服藥組每天灌服2 ml美洲大蠊提取物 (美洲大蠊提取物按50 mg/kg配制,溶于2 ml蒸餾水中灌胃給藥)，對(duì)照組每次灌蒸餾水2 ml。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d后，美洲大蠊提取物運(yùn)動(dòng)組與運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行一次性力竭游泳運(yùn)動(dòng)建立力竭模型，記錄大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間。力竭運(yùn)動(dòng)結(jié)束時(shí)即刻取樣，檢測(cè)血清中丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，并檢測(cè)觀察心肌組織中一氧化氮合酶(NOS)基因的表達(dá)情況。結(jié)果：與安靜組相比，一次力竭游泳后, 運(yùn)動(dòng)組心肌SOD、GSH-Px 的活性明顯降低(P<0.01), 而MDA 含量顯著升高(P<0.01); 而美洲大蠊提取物能夠顯著提高力竭SD大鼠的心肌SOD、GSH-Px的活性(P<0.01), 降低MDA 含量(P<0.01)，eNos基因表達(dá)增高。結(jié)論：大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后心肌會(huì)發(fā)生氧化損傷，美洲大蠊提取物干預(yù)后能夠增加力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌的抗氧化能力，對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)所致心肌損傷具有一定的保護(hù)作用，進(jìn)而增強(qiáng)大鼠運(yùn)動(dòng)能力。

美洲大蠊提取物；大鼠；力竭運(yùn)動(dòng)；心血管；氧化損傷

periplaneta Americana extract; rats; exhaustive exercise; cadiovascular; oxidative damage

美洲大蠊俗稱蜚蠊，又稱蟑螂等，是蜚蠊科中體積最大的昆蟲，原產(chǎn)于南美洲。它是一種傳統(tǒng)的中藥材?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊表皮含有鞏膜質(zhì)和甲殼質(zhì)，鉀、鈣、鋁、鎂等元素。肌肉水解13種氨基酸。此外，身體不同部位分別含有豐富的甘氨酸、維生素、腺嘌呤等。據(jù)大量相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，美洲大蠊的醇提取物對(duì)癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，對(duì)心血管疾病的治療有明顯的效果[1]。人體在力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體能量需求量急劇增加，心肌細(xì)胞能量代謝加速，容易引起冠

狀動(dòng)脈供血不足。心肌細(xì)胞缺血缺氧，誘發(fā)自由基(reactive oxygen species, ROS)的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性氧應(yīng)激及心肌細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷[2-4]，從而使機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力下降。在正常情況下，生物體內(nèi)存在的強(qiáng)大氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，可將自由基維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)。當(dāng)平衡系統(tǒng)受到破壞，體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。篩選一種高效無毒高效抗氧化劑已成為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)日益關(guān)注的焦點(diǎn)。目前在劇烈運(yùn)動(dòng)應(yīng)激時(shí)，給予美洲大蠊提取物對(duì)心肌氧化損傷是否發(fā)揮作用的研究尚無報(bào)道。因此，本研究對(duì)處于力竭運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的SD大鼠灌服美洲大蠊提取物，通過心肌自由基代謝、抗氧化酶、心肌組織中MDA含量等指標(biāo)的測(cè)定，探討美洲大蠊提取物對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌過氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

選取40只SPF級(jí)健康SD雄性大鼠，體重(180±20)g，動(dòng)物由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0003)。美洲大蠊干蟲體(云南大理禾源賓館美蠊養(yǎng)殖基地)；酪氨酸(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1687-200811)；硅膠G(上海原葉生物科技有限公司)；RT-PCR Kit(北京中杉金橋生物有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物有限公司)；Marker I (北京天根生物有限公司)；DZKW-4水浴鍋上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠)；大鼠丙二醛(malondialdehyde, MDA)定量檢測(cè)試劑盒(ELISA)、大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 定量檢測(cè)試劑盒(ELISA)、大鼠谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)定量檢測(cè)試劑盒(ELISA)；梅特勒電子天平AE240(瑞士)；島津UV2550紫外-可見光分光光度儀(日本島津)；1708176凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；梯度PCR儀(Bio-Rad公司)；H-2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 美洲大蠊提取物的制備[5]預(yù)處理蟲體：分別用75%乙醇和蒸餾水緩和清洗美洲大蠊成蟲干體表面各2次，去除觸須和翅后，放入60℃烘箱烘干后，放置凍存盒里于-20℃冰箱中過夜保存。

水提：稱取10 g蟲體在碾缽中磨細(xì)后，加入蒸餾水10 ml再研磨成漿液，放置于-20℃冷凍20 min，如此反復(fù)研磨3次，使蟲體充分被研磨成勻漿。

離心處理：將研磨后的蟲體勻漿小心轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，加入蒸餾水30 ml,以4 000 r/min離心15 min，去除上層油狀物，取下層懸液用濾膜過濾，用蒸餾水反復(fù)沖洗濾膜3次，收集濾液。

濃縮醇析：水浴鍋中加熱(60℃～70℃)濃縮濾液至原有體積的1/4,室溫冷卻，以10 000 r/min離心10 min，去除上層油狀物，過濾并清洗濾膜，濾液合并后水浴加熱至60℃～70℃，趁熱加入95%乙醇并不斷攪拌，冷卻至室溫后，10 000 r/min離心15 min后過濾除去上清液，得白色沉淀提取物，用乙醇反復(fù)沉淀3次。

精制：往白色沉淀提取物中加入少量蒸餾水和1/10的活性炭，80℃加熱溶解30 min，不斷攪拌，趁熱過濾。重復(fù)上面操作2次，合并濾液和洗液，加入95%乙醇重結(jié)晶，得到大蠊水提取物。參考并依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6,7]對(duì)實(shí)驗(yàn)用的大蠊提取物的母液做了定量的含量測(cè)定試驗(yàn)和定性鑒別試驗(yàn)。在含量測(cè)定中，以大蠊提取物溶液中的酪氨酸作為測(cè)定對(duì)象，并以此通過轉(zhuǎn)換計(jì)算總氨基酸的濃度。

1.2.2 動(dòng)物分組及訓(xùn)練方案 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，將40只大鼠隨機(jī)分為安靜組、運(yùn)動(dòng)組、美洲大蠊提取物+安靜組、美洲大蠊提取物+運(yùn)動(dòng)組(n=10)。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物正常進(jìn)食, 飲水。連續(xù)灌胃14 d，每天灌胃1次，對(duì)照組每次灌蒸餾水2 ml，服藥組每天灌服2 ml美洲大蠊提取物 (美洲大蠊提取物按50 mg/kg配制,溶于2 ml蒸餾水中灌胃給藥)。最后一次灌胃后1 h，運(yùn)動(dòng)組和美洲大蠊提取物PAE+運(yùn)動(dòng)組大鼠分別放入2個(gè)相同的恒溫玻璃水槽(100 cm×60 cm×70 cm)中，水深為30 cm，水溫維持在(31±1)℃，進(jìn)行一次性力竭游泳試驗(yàn)，記錄力竭游泳時(shí)間。力竭標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas等[8]報(bào)道文獻(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)為SD大鼠沉入水下超過10 s。

1.2.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 SD大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后，立即經(jīng)心臟抽取全血4 ml，并迅速取出心肌組織。室溫靜置30 min、5 000 r/min離心12 min，并取上清血清，采用ELSIA的方法檢測(cè)血清中 SOD、MDA、GSH-Px指標(biāo)。

1.2.4 心肌組織中一氧化氮合酶表達(dá)的檢測(cè) 處死SD大鼠后，立即取出心臟在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙上拭干，并在冰上切成約100 mg 大小，用DEPC 水處理過的錫箔紙包裹，放入-70℃冰箱保存。用時(shí)取出，操作時(shí)避免RNA 酶污染。采用RT-PCR 方法對(duì)eNOS基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定性與半定量檢測(cè)。制備含溴乙錠2%的瓊脂糖凝膠, 取上述6 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行含溴乙錠的瓊脂糖凝膠(2%)電泳，用Bio-Rad 凝膠圖像成像分析系統(tǒng)掃描結(jié)果，Quantity One 軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察 HE染色光鏡觀察大鼠心臟組織形態(tài)變化：每組隨機(jī)選取3只大鼠的心臟、主動(dòng)脈弓，取小塊組織修整齊后置于中性福爾馬林固定液中固定，72h后常規(guī)石蠟包埋切片(4 μm)。二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)各15 min，100%乙醇5 min，95%乙醇 5 min，80%的乙醇 5 min，75%的乙醇 5 min，蒸餾水洗 2 min，蘇木素染色 5 min，水洗，1%鹽酸酒精分化 30 s，氨水返藍(lán)，置伊紅染 15 min，水洗，80%的乙醇 5 min，95%的乙醇 5 min，100%乙醇(Ⅰ、Ⅱ)各 5 min，二甲苯(Ⅰ)5 min，二甲苯(Ⅱ)5 min，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊提取物對(duì)SD大鼠力竭性游泳運(yùn)動(dòng)耐力的影響

與力竭組比較, 美洲大蠊提取物運(yùn)動(dòng)組能夠顯著提高SD大鼠的耐力(P<0.01，表1)。

GroupFrequencyActiontime(min) Resting1080.25±4.56PAE+resting1087.78±6.79Exhausted10118.45±8.76PAE+exhaus-ted10160.18±7.47**##

PAE： Periplaneta americana extract

**P<0.01vsresting group;##P<0.01vsexhausted group

2.2 美洲大蠊提取物對(duì)力竭性游泳運(yùn)動(dòng)后SD大鼠心血管氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響

與安靜組相比, 運(yùn)動(dòng)組一次力竭游泳后, 心肌SOD、GSH-Px 的活性明顯降低(P<0.01，表2), 而MDA 含量顯著升高(P<0.01，表2); 而美洲大蠊提取物能夠顯著提高力竭SD大鼠的心肌SOD、GSH-Px活性(P<0.01，表2), 降低MDA 含量(P<0.01，表2)。

GroupFrequencyMDA(ng/L)SOD(U/L)GSH-Px(U/L)Quiet1016.16±9.4030.20±2.67190.26±48.54Exhausted1024.49±7.38**19.40±4.44**159.85±50.59**PAE+Quiet1016.21±8.8529.59±45.82187.24±57.90PAE+Exhaus-ted1019.30±8.99##28.47±44.59##179.77±58.71##

MDA: Malondialdehyde； SOD： Superoxide dismutase； GSH-Px： Glutathione peroxidase； PAE： Periplaneta Americana extract

**P<0.01vsquiet group;##P<0.01vsexhausted group

2.3 美洲大蠊提取物對(duì)力竭游泳運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織eNOS表達(dá)的影響

RT-PCR半定量分析。美洲大蠊提取物作用后能夠增加力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織中eNOS基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)(圖1)。安靜組大鼠心肌組織中eNOS mRNA表達(dá)為0.7647±0.0387； PAE給予安靜組后大鼠心肌組織中eNOS mRNA表達(dá)變較安靜組比較不明顯為0.7584±0.0124；力竭游泳運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織eNOSmRNA表達(dá)明顯降低為0.1467±0.0263,較安靜組和PAE+安靜組相比差別顯著性意義(P<0.05)；而PAE+力竭游泳運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織eNOS mRNA表達(dá)為0.687±0.0241，較力竭游泳運(yùn)動(dòng)組明顯升高，具有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 美洲大蠊提取物對(duì)力竭游泳運(yùn)動(dòng)大鼠主動(dòng)脈弓、心肌組織病變的影響

力竭游泳運(yùn)動(dòng)主動(dòng)脈弓基本正常，局部可見粘液變性,心臟間質(zhì)略顯疏松水腫，可見較多脂肪組織。部分纖維間可見肌漿凝聚，但不明顯。美洲大蠊提取物作用力竭運(yùn)動(dòng)主動(dòng)脈弓基本正常，局部可見粘液變性，心臟組織也基本正常(圖2，見彩圖頁Ⅰ)。

Fig. 1 Cardiac tissue eNOS mRNA expression levels in each group A: Quiet group； B: PAE+quiet group； C: PAE+exhausted group； D: Exhausted group； PAE： Periplaneta Americana extract

3 討論

機(jī)體在正常狀態(tài)下，存在完善的氧化-抗氧化的平衡體系[9,10]。內(nèi)源性的抗氧化酶SOD可以有效清除氧自由基[11], 保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，減少細(xì)胞毒性。多項(xiàng)研究報(bào)道[10]，當(dāng)人體進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體負(fù)荷急劇增加, 機(jī)體耗氧量也急速升高，從而引起機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)活性的降低，氧自由基ROS大量產(chǎn)生，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 生成增加。低濃度的ROS能夠調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的功能，但是大量的ROS產(chǎn)生，超過了機(jī)體抗氧化防御的能力，就會(huì)攻擊細(xì)胞膜的多不飽和脂肪酸，啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改變細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和酶的活性和功能，誘發(fā)心血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力下降，進(jìn)而造成力竭運(yùn)動(dòng)性心血管疾病的發(fā)生[12]。進(jìn)一步的研究表明，給予抗氧化劑干預(yù)后，可以提高機(jī)體抗氧化酶的活性，清除大量自由基, 降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng), 從而延緩或消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生[13-15]，提高運(yùn)動(dòng)機(jī)體的耐力。目前，通過從天然藥物中探尋能夠清除體內(nèi)自由基的物質(zhì)，利用這些物質(zhì)與自由基結(jié)合，以阻斷自由基對(duì)人體的攻擊，將成為現(xiàn)代醫(yī)藥、保健業(yè)的熱點(diǎn)[16,17]。美洲大蠊是傳統(tǒng)的中藥材，其全身不同部位分別含有豐富的多元醇、肽類及氨基酸等，對(duì)心血管疾病具有明顯的療效。本實(shí)驗(yàn)給予美洲大蠊提取物干預(yù)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠后，通過觀察其對(duì)SD大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后心肌氧化應(yīng)激損傷的各項(xiàng)指標(biāo)的影響，來探討美洲大蠊提取物抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在力竭運(yùn)動(dòng)過程中，美洲大蠊提取物通過提高抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低MDA 含量，同時(shí)又可刺激血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激相關(guān)基因eNOS的表達(dá)，使心肌組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減少，從而細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化的損傷，延長(zhǎng)了大鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間，提高機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力，從而在保護(hù)心臟的過程中發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)其抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的目的。以美洲大蠊提取物作為研究目標(biāo)，有望為日后揭示美洲大蠊提取物在力竭運(yùn)動(dòng)過程中保護(hù)機(jī)體免受過氧化損傷的機(jī)制提供理論依據(jù)。

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