針刺對缺血缺氧性腦癱乳鼠的治療作用*

李素慧， 孫洪濤， 王延民， 魏正軍

(1. 武警后勤學院附屬醫(yī)院儀器設(shè)備科， 2. 武警后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院， 天津 300162)

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針刺對缺血缺氧性腦癱乳鼠的治療作用*

李素慧1， 孫洪濤2△， 王延民2， 魏正軍2

(1. 武警后勤學院附屬醫(yī)院儀器設(shè)備科， 2. 武警后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院， 天津 300162)

目的：探討針刺治療促進腦癱乳鼠運動功能恢復(fù)的作用機制。方法：采用改良的缺氧缺血性腦病(HIE) 造模方法建立腦癱乳鼠模型，將60只乳鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、針刺組 (n=20)，觀察各組乳鼠運動功能情況并評分，測定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量，檢測大腦病變區(qū)域的突觸素(SYP)和神經(jīng)生長相關(guān)蛋白(GAP-43)的表達。結(jié)果：針刺治療組運動功能評分較模型組運動功能評分顯著增加(P<0.05)；血清SOD活性較模型組顯著增加(P<0.01)；血清MDA含量較模型組MDA含量明顯降低(P<0.01)；腦組織SYP和GAP-43的表達較模型組SYP和GAP-43活性的表達明顯增加(P<0.05)。結(jié)論：針刺療法能通過降低MDA的活性、升高SOD的含量、進一步上調(diào)病變部位的大腦皮質(zhì)區(qū)的SYP及GAP-43 的表達從而改善缺血缺氧性腦癱乳鼠的運動功能。

針刺治療；腦性癱瘓；生長相關(guān)蛋白；突觸素；乳鼠

腦癱患兒的治療及功能恢復(fù)是目前醫(yī)學界研究的重點和難點，針灸作為傳統(tǒng)的中醫(yī)治療方法，在腦性癱瘓的臨床治療中廣泛應(yīng)用，其對腦癱患者運動功能的恢復(fù)起到了一定的治療效果[1，2]，但對于針刺治療的作用機制研究較少。本研究建立腦癱乳鼠模型，采用針刺治療，對乳鼠進行運動功能評估，并對乳鼠血清血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde ，MDA)含量和大腦病變區(qū)域(synaptophysin，SYP)神

經(jīng)生長相關(guān)蛋白(growth associated protein-43,GAP-43)的表達情況進行檢測，觀察針刺治療的效果，探討針刺療法促進腦癱乳鼠運動功能恢復(fù)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

購自于北京中山生物工程有限公司的抗GAP-43和抗SYP單克隆抗體、SAB試劑盒、DAB顯色試劑盒；購自于南京建成生物研究所的SOD和MDA試劑盒。日本Olympus手術(shù)顯微鏡；美國HMIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)。

1.2 實驗動物與分組

7日齡新生SD乳鼠(清潔級，天津醫(yī)科大學動物實驗中心提供)60只，雌雄各半，平均體重(15.5±1.1)g，在20℃～22℃相對濕度45%～50%的動物房中飼養(yǎng)，光照周期10～12 h。將乳鼠隨機分為三組 (n=20)：假手術(shù)組、模型組及針刺組，且每組動物再隨機分為14 d和28 d兩個亞組(n=10)。分組結(jié)束后，將其送回各自母鼠籠中繼續(xù)母乳喂養(yǎng)。

1.3 模型制備

采用改良的缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)實驗動物造模方法[3]。將模型組及針刺組乳鼠仰臥位置于手術(shù)板上，采用10%的水合氯醛 (4 ml/kg) 進行腹腔麻醉。先將乳鼠的四肢及頭部固定，碘伏消毒，取頸前正中切口，分離左頸總動脈。選用0號線埋線結(jié)扎，縫合切口后立即將乳鼠放置于37℃水封閉的缺氧箱中(箱內(nèi)持續(xù)充以體積濃度為92%氮氣和8%氧氣的混合氣體，氣體流量為 1 L/min)，2.5 h后取出，繼續(xù)保溫1 h后觀察乳鼠的行為，若乳鼠行走時向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈或向手術(shù)對側(cè)傾倒走路不穩(wěn)，即可認定為腦癱模型制作成功。假手術(shù)組乳鼠只取頸前正中切口，分離出左頸總動脈，不做結(jié)扎只縫合切口。

1.4 針刺組治療方法

術(shù)后24 h開始針刺治療，根據(jù)“動物針灸穴位圖譜”(中國針灸學會實驗針灸研究分會制定)選穴。針刺取穴：百會、合谷、曲池、前三里、后三里、涌泉；針刺方法：從上到下，從左至右，毫針淺刺，每次穴位針刺3 min，不留針，每天1次，連續(xù)28 d。

1.5 觀察指標及測定方法

1.5.1 運動功能評估 分別于針刺后14 d及28 d從各組隨機選出10只乳鼠，對其進行BBB運動功能等級評分[4]，評估其運動功能。評分共分三部分：第一部分為0～7分，評判動物后肢各關(guān)節(jié)活動；第二部分為8～13分，評判后肢的步態(tài)及協(xié)調(diào)功能；第三部分為14～21分，評判運動中爪的精細動作，三項滿分為21分。實驗時保持房間內(nèi)的安靜，在自然光線下進行測試。將乳鼠放置于寬大活動場地，待其活動自如后開始評估，分別從不同方向?qū)θ槭筮M行評定。1.5.2 SOD活性和MDA含量的檢測 以4 ml/kg劑量將10%的水合氯醛腹腔注射麻醉乳鼠，經(jīng)腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明測定大鼠血清SOD活性和MDA的含量。

1.5.3 GAP-43和SYP 表達的檢測 麻醉乳鼠經(jīng)腹主動脈采血后，再經(jīng)心臟灌注4% 的多聚甲醛，然后將其固定，開顱，暴露出大腦，取從前鹵向后2 mm的冠狀位腦片，用10%中性甲醛溶液固定24 h，常規(guī)處理后切片，SABC 法染色，進行GAP-43和SYP的免疫組化染色測定，具體操作步驟按照試劑盒上的說明進行。采用美國HMIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)測定平均光密度 (OD值) 。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組乳鼠不同時間的運動功能評分變化

與假手術(shù)組比較，模型組乳鼠運動功能評分明顯降低(P<0.05)；經(jīng)28 d針刺治療，針刺組乳鼠的運動功能評分明顯升高(P<0.05，表1)。說明針刺可以促進腦癱乳鼠的運動功能的恢復(fù)。

Group14d28dS19.4±0.1919.3±0.17M6.9±0.18*7.4±0.16*A7.7±0.23*11.3±0.29*#

S： Sham operation group； M： Model group； A： Acupuncture group

*P<0.05vssham operation group;#P<0.05vsmodel group

2.2 各組乳鼠不同時間血清SOD和MDA含量的變化

與假手術(shù)組比較，乳鼠模型組血清SOD活性顯著性降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，針刺組SOD活性顯著性增加(P<0.05，P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01，表2)。

GroupSOD(U/ml)MDA(nmol/ml)14d28d14d28dS154.5±12.90157.9±15.33.50±0.493.62±0.56M116.5±13.76**129.4±10.4**10.46±1.77**9.83±1.43**A136.4±13.96**147.1±12.7##7.72±0.89**##6.48±1.26**##

S： Sham operation group； M： Model group； A： Acupuncture group； SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde

**P<0.01vssham operation group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.3 各組乳鼠不同時間大腦病變區(qū)SYP和GAP-43表達的變化

與假手術(shù)組比較，模型組SYP 14 d的表達顯著降低(P<0.05)，針刺組SYP 14 d的表達無顯著差異(P<0.05)，模型組和針刺組乳鼠GAP-43的表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

GroupSYPGAP-4314d28d14d28dS0.162±0.0150.164±0.0130.090±0.0240.092±0.028M0.140±0.023*0.228±0.019*0.179±0.016*0.211±0.042*A0.152±0.0200.262±0.028**#0.182±0.024**0.288±0.025**#

S： Sham operation group； M： Model group； A： Acupuncture group； SYP： Synaptophysin； GAP-43： Growth associated protein 43

*P<0.05，**P<0.01vssham operation group;#P<0.05vsmodel group

3 討論

小兒腦性癱瘓是指從出生前到出生后l個月內(nèi)由各種原因所引起的腦損傷或發(fā)育缺陷所導(dǎo)致的運動障礙及姿勢異常[5]。早產(chǎn)、產(chǎn)傷、圍產(chǎn)期窒息及核黃疽等造成的新生兒腦組織缺血缺氧均是引起小兒腦性癱瘓的原因。臨床表現(xiàn)主要有中樞性運動障礙及姿勢異常，同時伴有不同程度的智力障礙、癲癇及視覺障礙、聽覺障礙、語言行為障礙等?；純簩L期或終生殘疾，直接影響兒童的身心健康和人口素質(zhì)的提高。目前，人們一直在積極探索腦癱的有效治療方法。有關(guān)文獻表明，傳統(tǒng)的針灸療法已被證實有良好療效，但文獻只是單純?yōu)榱俗C實其療效，而對其作用機制的研究相對較少。

正常機體存在抗氧化和氧化系統(tǒng)，兩系統(tǒng)互相制約而保持著動態(tài)平衡。腦組織在缺血缺氧狀態(tài)下，機體將會產(chǎn)生大量自由基，使過氧化產(chǎn)物蓄積，引起腦組織損傷。MDA是氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，可以作為過氧化產(chǎn)物的標志物[6，7]。SOD是機體中主要的抗氧化酶，其活性代表著組織清除體內(nèi)自由基的能力。SOD可以催化氧自由基的歧化反應(yīng)，使之轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，從而降低過氧化損傷，調(diào)節(jié)機體抗氧化和氧化體系的平衡[8]。本實驗結(jié)果表明腦癱乳鼠經(jīng)過針刺治療能夠使SOD的含量升高、使MDA的含量降低，改善腦缺血缺氧引起的腦損傷。

多數(shù)腦癱是多部位的腦組織缺血缺氧，其神經(jīng)元的損傷不容忽視，神經(jīng)元可以通過重塑和功能重組來修復(fù)。大腦可塑性包括現(xiàn)有突觸功能的變化、突觸發(fā)生、皮質(zhì)重組和可能的神經(jīng)再生。SYP是一種分布于突觸囊泡膜上且與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的特異性糖蛋白。它既可作為突觸發(fā)生的標志，又能反映出突觸的密度和傳遞效能，與遞質(zhì)的釋放關(guān)系密切，可影響突觸可塑性[9]。SYP在突觸形成的起始階段、突觸結(jié)構(gòu)的保持以及突觸傳遞過程中都是必需的，是突觸重建的重要標志。SYP的免疫組化結(jié)果可準確反映神經(jīng)突觸的密度，模型組乳鼠腦缺血缺氧損傷后，大量的神經(jīng)細胞死亡或凋亡，突觸結(jié)構(gòu)崩潰，病變腦區(qū)神經(jīng)元發(fā)生病變，導(dǎo)致神經(jīng)突觸末梢的蛻變甚至丟失，同時神經(jīng)細胞的代謝減弱、蛋白的合成能力下降，軸漿運輸功能隨之下降，所以模型組SYP的表達首先是降低的；其后，自然修復(fù)和突觸代償功能促進神經(jīng)細胞再生、突觸重建，SYP的表達能力明顯增高，這與國外文獻報道的基本一致[10]。SYP表達能力的提高可以反映神經(jīng)傳遞的增加，這種神經(jīng)傳遞的增加在一定程度上也能改善認知與肢體活動功能[11]。

GAP-43是一種與神經(jīng)軸突生長密切相關(guān)的神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，在神經(jīng)生長部位的表達較為豐富，在神經(jīng)細胞、雪旺細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中分布較為廣泛，它能夠促進神經(jīng)元發(fā)育，是神經(jīng)細胞的生長、再生及突觸形成和重建的標志性物質(zhì)[12]，是神經(jīng)元再塑性的一項重要的觀察指標。GAP-43與神經(jīng)細胞發(fā)育、突觸的可塑性、神經(jīng)再生等密切相關(guān)[13]。模型組乳鼠缺血缺氧，神經(jīng)細胞受到損傷時，可以通過突觸、軸突的再生，使受損的神經(jīng)元重新建立聯(lián)系進行代償，神經(jīng)可塑性增加[14]。GAP-43呈高水平表達提示神經(jīng)纖維正處于再生活躍狀態(tài)，神經(jīng)元突觸、軸突再生增強。

本研究結(jié)果顯示，針刺組治療28 d時SYP和GAP-43的表達較模型組顯著性升高，說明針刺可以通過上調(diào)受損腦組織SYP和GAP-43的表達，并延長其高表達時程，來改善腦組織缺血缺氧損傷后神經(jīng)細胞的軸突再生和突觸的重塑，促進損傷神經(jīng)細胞的修復(fù)。

針刺穴位治療腦癱，把中醫(yī)的經(jīng)絡(luò)學說和現(xiàn)代醫(yī)學的大腦功能定位相結(jié)合，在腦康復(fù)醫(yī)學中具有獨特的意義。通過針刺相關(guān)穴位，可以促進腦組織病變區(qū)側(cè)枝循環(huán)的形成，可解除血管痙攣，改善腦組織供血，同時激活抑制狀態(tài)的腦細胞，增強機體免疫力，有助于疾病的恢復(fù)。腦癱運動功能障礙屬祖國中醫(yī)學“痿證”范疇，針刺治療以選陽明經(jīng)脈腧穴為主。另外，針刺經(jīng)穴，可以疏通經(jīng)脈，上達巔頂，直接刺激大腦皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從而改善患肢的運動功能。本研究認為針刺療法可以通過提高SOD的活性和降低MDA的含量來抑制氧化損傷，可以促進大腦組織的GAP-43和SYP的表達，來完成腦組織的重塑與功能重組，從而促進腦癱乳鼠運動功能的恢復(fù)。

近年來, 中醫(yī)針灸治療腦癱越來越被醫(yī)學界所重視, 尤其是針灸表現(xiàn)出來的獨特療效,已經(jīng)被廣大患者所選擇。針灸治療腦癱將有廣闊的研究前景，臨床觀察結(jié)果[15]提示，腦癱患兒越早治療越好。中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟時，其可塑性及代償功能均較強，可通過穴位刺激療法促進軸突的發(fā)育，故治療效果較好；腦癱患兒隨著年齡的增長，伴隨的臨床癥狀越來越明顯，異常身體姿勢固定化，引起繼發(fā)性肌肉萎縮、肌腱攣縮、肌張力降低、功能障礙等臨床癥狀，治療可逆性差，療效相對較差。故對腦癱患兒應(yīng)當早診斷、早治療。本研究為針刺治療小兒腦癱提供了理論依據(jù)和支持，為今后腦癱治療研究提供了基礎(chǔ)。

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Therapeutic effect of acupuncture treatment on ischemic hypoxic neonate rats with cerebral palsy

LI Su-hui1, SUN Hong-tao2△, WANG Yan-min2, WEI Zheng-jun2

(1. Department of Instrument and Equipmement, 2. Department of Neurology, Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces, Tianjin 300162, China)

Objective: To explore the mechanisms of acupuncture treatment promoting the motor function recovery of neonate rats with cerebral palsy. Methods: The improved hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) means was performed to establish the model of neonate rats with cerebral palsy. All neonate rats were randomly divided into 3 groups: sham group, model group and acupuncture group (n=20). We observed and scored motor function of rats, measured the levels of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in serum, and also measured the expression of synaptophysin(SYP) and growth associated protein-43(GAP-43) in the diseased region of cerebral tissue. Results: The motor function scores (11.3±0.29) and the serum level of SOD (147.1±12.7) U/ml in acupuncture treatment group were higher than those of model group (P<0.05). The serum level of MDA was lower in acupuncture treatment group than that of model group (P<0.05). The expression of SYP and GAP-43 in the diseased region of cerebral tissue of acupuncture treatment group were higher than those of model group (P<0.05). Conclusion: Acupuncture-therapy could improve the motor function of neonate rats with cerebral palsy by decreasing the content of MDA in serum, increasing the contents of SOD in serum， and prolonging the upregulation of SYP and GAP-43 expressions in brain tissue.

acupuncture therapy; cerebral palsy; growth associated protein; synaptophysin; neonate rat

2014-11-05

2015-06-03

R245.3

A

1000-6834(2015)05-473-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.023

△【通訊作者】Tel: 022-60577145; E-mail: chenmo333@163.com