李 曙, 金 鑫, 龍雪峰, 賈金禮, 張根葆, 洪 云
(1. 皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 2. 藥理學(xué)教研室, 3. 臨床醫(yī)學(xué)院, 4. 弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科, 安徽 蕪湖 241002)
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尖吻蝮蛇毒抑瘤組分Ⅰ對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性的影響*
李 曙1, 金 鑫2, 龍雪峰3, 賈金禮1, 張根葆1, 洪 云4△
(1. 皖南醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 2. 藥理學(xué)教研室, 3. 臨床醫(yī)學(xué)院, 4. 弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科, 安徽 蕪湖 241002)
目的:觀察尖吻蝮蛇毒抑瘤組分Ⅰ(AAVC-Ⅰ) 對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)遷移活性的影響,探討AAVC-Ⅰ抑制血管生成的可能機(jī)制。方法:體外培養(yǎng)HUVECs,分別用AAVC-Ⅰ(0、20、40、80 μg/ml)處理細(xì)胞后再孵育24 h。劃痕實(shí)驗(yàn)和趨化小室實(shí)驗(yàn)觀察AAVC-Ⅰ對內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性的影響;采用RT-PCR、Western blot法檢測藥物作用前后P選擇素(P-selectin)和細(xì)胞間粘附因子(ICAM-1)mRNA和蛋白水平的變化。結(jié)果:與正常組HUVECs比較,AAVC-Ⅰ各濃度組細(xì)胞遷移能力都有不同程度降低,P-selectin和ICAM-1 mRNA表達(dá)均明顯下降。結(jié)論:AAVC-Ⅰ可能通過下調(diào)P-selectin和ICAM-1 mRNA和蛋白水平抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性。
蝮蛇毒抑瘤組分; 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞; 遷移
血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管內(nèi)壁形成的重要組成部分,其遷移活性影響血管的生成[1],而血管生成在生理和病理活動中發(fā)揮重要的作用,尤其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要[2,3]。因此抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移生成血管是治療腫瘤的重要靶點(diǎn),已成為尋找抗癌藥的重要方向。
蛇毒是含有多種生物活性蛋白的混合物,研究證明蛇毒具有廣泛的生物學(xué)活性。目前已經(jīng)從蛇粗毒中成功的分離出多種酶類和肽類物質(zhì),這些物質(zhì)被證實(shí)除了具有抗栓、止血、鎮(zhèn)痛作用外,還具有抗腫瘤的作用[4]。近年已有報(bào)道,一種名為Salmosin的蝮蛇毒抑瘤成分主要通過干擾內(nèi)皮細(xì)胞粘附過程
阻止血管生成起到抗瘤作用[5]。以往本課題組以尖吻蝮蛇蛇毒為對象,提取、分離和純化出蛇毒抑瘤活性物質(zhì) (component I from agkistrodon acutus venom,AAVC-Ⅰ)[6],具有明顯地抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性[7,8]。為了深入了解該蛇毒組分抗腫瘤增殖的可能特性,本實(shí)驗(yàn)以人血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)為靶細(xì)胞,觀察AAVC-Ⅰ對內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用,及其抑制內(nèi)皮細(xì)胞生成血管的可能機(jī)制。
1.1 材料
HUVECs(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司),AAVC-Ⅰ(皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所,純度99%),細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(Hyclone公司),0.25%EDTA胰酶(碧云天生物技術(shù)),Transwell小室(Corning公司),鼠抗 GAPDH抗體、兔抗P-selectin抗體、兔抗ICAM-1抗體(BOSTER生物公司),HRP標(biāo)記羊抗兔IgG/ HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(ZSGB生物公司)。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將原代培養(yǎng)的HUVECs接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi),37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基,當(dāng)生長至90%融合時(shí),PBS沖洗3次,加入0.25%胰蛋白酶消化傳代,2~5代生長良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 將1 ml的細(xì)胞懸液接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,使每孔含有2.8×105cells,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,用槍頭在鋪滿細(xì)胞的孔板上劃痕。水平和垂直的劃十字形,去除劃痕導(dǎo)致脫落的細(xì)胞,顯微鏡下拍照,測量劃痕寬度,隨機(jī)分為四組:空白組,不加任何處理因素;AAVC-Ⅰ低濃度組(20 μg/ml);AAVC-Ⅰ中濃度組(40 μg/ml);AAVC-Ⅰ高濃度組(80 μg/ml)組;放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,取出拍照。計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率,劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%[9]。
1.2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 每孔上室(即BD小室中)加入2×104cells,用300 μl無血清培養(yǎng)液重懸,下室(即24孔板中)加入680 μl含血清培養(yǎng)液,在37℃培養(yǎng)箱中孵育36 h,用棉簽擦掉上層小室內(nèi)HUVEC,將小室放入,固定液,室溫固定 15 min之后,用 0.1%結(jié)晶紫染色 20 min,用 PBS 洗4次,晾干,顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。按照公式計(jì)算加藥對細(xì)胞侵襲的抑制率:抑制率%=(空白組-給藥組) /空白組×100%[10]。
1.2.4 PCR檢測P-selectin和ICAM-1 mRNA的表達(dá)Trizol一步法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用凝膠分析系統(tǒng)分析,條帶強(qiáng)度用積分光密度值(IOD)表示(積分光密度=平均光密度×發(fā)光面積)。GAPDH引物上下游:5-CCACTAGGCGCTCACTGTTC-3,5-ATGGAATTTGCCATGGGTGGA-3;ICAM-1引物上下游:5-CAACCTCAGCCTCGCTATGG-3,5-AACAACTTGGGCTGGTCA CA-3;p-selectin引物上下游:5-ACATCAAGAGTCCGTCAGCC-3,5-CAGAAGCCAAGCATTCCAGC-3
1.2.5 Western印跡檢測法檢測P-selectin和ICAM-1 蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)、分組,24 h后,各組均采用一步提取法提取總蛋白,-80℃冰箱保存,SDS-PAGE電泳(10%)。NC膜放入封閉緩沖液室溫封閉1 h;孵育一抗,4℃過夜;孵育二抗,37℃×1 h;最后用PBS漂洗3次,每次5 min;采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色,拍照、顯影。自動圖像分析儀對蛋白條帶掃描、分析。
2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果
HUVECs培養(yǎng)、劃痕后,與空白組比較,實(shí)驗(yàn)組分別用20、40和80 μg/ml AAVC-Ⅰ培養(yǎng)24 h,爬行速度降低,遷移距離明顯縮短,劃痕愈合率低于空白組(P<0.05,圖1,見彩圖頁Ⅰ),且濃度越高,抑制效果越明顯。
Tab. 1 Migratory ability of HUVECS after treated by AAVC-Ⅰobserved by scratch assay
GroupMigratoryability(%)Blank82.6±6.53AAVC-I20μg/ml55.4±6.18*AAVC-I40μg/ml41.5±4.39**AAVC-I80μg/ml29.7±2.18**
AAVC-I:Component I from agkistrodon acutus venom; HUVECs: Human umbilical vein endothelial cells
*P<0.05,**P<0.01vsblank group
2.2 內(nèi)皮細(xì)胞侵襲能力的變化
通過對Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察,AAVC-Ⅰ處理后穿過人工基底膜的HUVECs比未經(jīng)處理的細(xì)胞少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,表2,圖2,見彩圖頁Ⅰ)??梢夾AVC-Ⅰ對HUVECs細(xì)胞體外的侵襲力具有抑制作用。
Tab. 2 Image of HUVECS invasion after treated by AAVC-Ⅰ
GroupInhibilityrateofinvasive(%)Blank 100AAVC-I20μg/ml72.3±8.31*AAVC-I40μg/ml57.4±6.59**AAVC-I80μg/ml48.8±6.02**
AAVC-I: Component I from Agkistrodon acutus venom; HUVECs: Human umbilical vein endothelial cells
*P<0.05,**P<0.01vsblank group
2.3 AAVC-Ⅰ對人臍靜脈HUVECs細(xì)胞P-selectin和ICAM mRNA表達(dá)水平的影響
通過對RT-PCR檢測結(jié)果分析,與空白組比較,AAVC-Ⅰ各濃度組內(nèi)皮細(xì)胞中P-selectin和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平均有不同程度的下降,差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,表3)。
2.4 AAVC-Ⅰ對人臍靜脈HUVECs細(xì)胞P-selectin和ICAM-1蛋白表達(dá)水平的影響
通過Western blot檢測結(jié)果分析,與空白組比較,AAVC-Ⅰ各濃度組內(nèi)皮細(xì)胞中P-selectin和ICAM-1蛋白表達(dá)水平均有不同程度的下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,表4)。
Tab. 3 Expression of P-selectin and ICAM-1 mRNA in HUVECS in all groups
GroupP-select/GAPDHICAM/GAPDHBlankgroup1.15±0.141.42±0.11AAVC-I20μg/ml0.73±0.09*0.89±0.12*AAVC-I40μg/ml0.48±0.04**0.68±0.08**AAVC-I80μg/ml0.39±0.05**0.37±0.02**
AAVC-1: Component I from agkistrodon acutus venom; HUVECs: Human umbilical vein endothelial cells
*P<0.05,**P<0.01vsblank group
Tab. 4 Protein expression of P-selectin and ICAM-1 in HUVECs in all groups
GroupP-select/GAPDHICAM/GAPDHBlankgroup0.86±0.060.82±0.04AAVC-I20μg/ml0.59±0.07*0.76±0.06AAVC-I40μg/ml0.27±0.02**0.48±0.03**AAVC-I80μg/ml0.19±0.03**0.35±0.03**
AAVC-1: Component I from agkistrodon acutus venom; HUVECs: Human umbilical vein endothelial cells
*P<0.05,**P<0.01vsblank group
內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性在多種生理活動中起著重要的作用,研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移是毛細(xì)血管和微靜脈的新毛細(xì)血管性血管生成的關(guān)鍵[11],同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移活性失調(diào)可直接影響心血管疾病[12,13]和腫瘤[2,3]發(fā)生發(fā)展,尤其以腫瘤最為突出。其生長過程需要持續(xù)的血管生成來為其輸送血液及提供營養(yǎng)物質(zhì),因而內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性異常,導(dǎo)致新生血管加快,最終有利于心血管疾病和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14,15]。選擇素家族是一類異親型結(jié)合Ca2+依賴的細(xì)胞粘著分子,能與特異糖基識別并結(jié)合,P-選擇素是粘附分子選擇素家族的重要成員,分布在血管內(nèi)皮、血小板上,主要參與介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的起始粘附,在內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性中起著重要的作用。Morbidelli等[16]證明P-選擇素能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族,其分布很廣[17],在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中起著重要作用[18],且在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)最強(qiáng)。內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1的表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,最終誘導(dǎo)血管生成。
因此了解內(nèi)皮細(xì)胞功能與臟器損傷的關(guān)系, 使人們能更好掌握某些疾病發(fā)生發(fā)展。近年來也開發(fā)出多種以內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)的血管生成抑制劑,并在臨床腫瘤治療中取得較好療效。蛇毒是一類天然混合毒素,含有許多活性成分,已有報(bào)道在蝮蛇毒、蝰蛇毒中含有抗血管生成活性物質(zhì),最近Kim DS等[19-21]從蝮蛇中提取的名為Salmosin的抑瘤成分能夠在體外抑制血小板聚集和腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移,且發(fā)現(xiàn)與抗腫瘤內(nèi)血管生成有一定關(guān)系;同時(shí)通過對該成分調(diào)節(jié)金屬蛋白酶-9和金屬蛋白酶組織抑制因子-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行研究,對其抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)研究。這些都表明蛇毒中的活性成分是開發(fā)靶向抗腫瘤藥物的重要生物資源。本課題組前期從皖南尖吻蝮蛇中純化的AAVC-Ⅰ抑瘤成分可以在體外明顯抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、腫瘤生長[6,22]。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AAVC-Ⅰ能夠有效的抑制腫瘤(K562/A549)細(xì)胞的增殖,藥物濃度和作用時(shí)間呈依賴關(guān)系。但該成分能否靶向作用于內(nèi)皮細(xì)胞抑制血管生成,抑腫瘤細(xì)胞的增殖值得進(jìn)一步探討。
本實(shí)驗(yàn)以HUVECs細(xì)胞作為靶細(xì)胞,通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),HUVEC細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移活性,AAVC-Ⅰ可降低HUVEC細(xì)胞遷移活性,并具有濃度依賴性。并且RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)證明AAVC-Ⅰ可能通過降低P-selectin 和ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性及血管生成,從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果一定程度上提示了該抗瘤組分對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性具有一定的影響。
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Effect of AAVC-I on the migration of human umbilical vein endothelial cells
LI Shu1, JIN Xin2, LONG Xue-feng3, JIA Jin-li1, ZHANG Gen-bao1, HONG Yun4△
(1. Department of Pathophysiology, 2. Department of Pharmacology, 3. Department of Clinical Medicine, 4. Department of Ultrasonography, Yijishan Hospital, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)
Objective: To investigate the effect of component I from agkistrodon acutus venomon (AAVC-I) the migration of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), and to elucidate the possible anti-angiogenic mechanism of AAVC-I . Methods: The effect of AAVC-I on the migration of HUVECs which was cultivated in vitro and treated with AAVC-1 at four concentrations: 0、20、40、80 μg/ml, was observed by methods of scratch wound-healing and Transwell assay. The expression level of mRNA and protein of P-selectin and intercellular cell adhension molecule-Ⅰ(ICAM-1) were examined by RT-PCR and Western blot assay. Results: Compared with the blank group, the migration ability of HUVECs in each AAVE-I treated group was reduced in a dose-dependent manner, and the expression level of the mRNA and protein of P-selectin and ICAM-1 were decreased. Conclusion: AAVC-I inhibits the migration of endothelial cell, which is acted by down-regulation of the expression content of mRNA and protein of P-selectin and ICAM-1.
component I from agkistrodon acutus venomon; human umbilical vein endothelial; migration
校重點(diǎn)科研基金項(xiàng)目(wk2014ZF06);安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085QH169);省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃(AH20 1410368138)
2014-01-05 【修回日期】2015-02-25
R73-3
A
1000-6834(2015)05-407-04
10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.007
△【通訊作者】Tel: 0553-3932476; E-mail: yxx2003@126.com