應(yīng)用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選冷應(yīng)激大鼠血漿差異表達(dá)蛋白*

劉艷芝， 郭景茹， 彭夢玲， 馬 莉， 甄 莉， 計(jì) 紅， 楊煥民

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 大慶 163319)

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應(yīng)用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選冷應(yīng)激大鼠血漿差異表達(dá)蛋白*

劉艷芝， 郭景茹， 彭夢玲， 馬 莉， 甄 莉， 計(jì) 紅， 楊煥民△

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 大慶 163319)

目的：應(yīng)用同重同位素相對與絕對定量(iTRAQ)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選冷應(yīng)激大鼠血漿差異表達(dá)蛋白。方法：將30只健康SPF級雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為冷應(yīng)激組A和常溫飼養(yǎng)組B，將A、B兩組分別隨機(jī)分為3組，即A1、A2、A3組和B1、B2、B3組(n=5)。常溫飼養(yǎng)溫度為(24.0±0.1)℃，冷應(yīng)激溫度為(4.0±0.1)℃。兩組實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)不同溫度處理12 h后，用肝素鈉抗凝負(fù)壓管腹主動(dòng)脈采血，分離血漿，提取血漿蛋白、定量、酶解、iTRAQ標(biāo)記、強(qiáng)陽離子交換色譜(SCX分離)和質(zhì)譜分析。結(jié)果：共鑒定出1 085個(gè)蛋白，篩出39個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中29個(gè)表達(dá)上調(diào)蛋白，10個(gè)表達(dá)下調(diào)蛋白。經(jīng)生物信息學(xué)分析，篩出3個(gè)與動(dòng)物冷應(yīng)激相關(guān)的重要差異表達(dá)蛋白，分別為：組織相容性蛋白HA-1、Ras相關(guān)蛋白Rap1b、整合蛋白β-1。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功篩出冷應(yīng)激大鼠血漿差異表達(dá)蛋白，iTRAQ技術(shù)為篩選大鼠冷應(yīng)激蛋白診斷標(biāo)志物提供了一個(gè)良好的平臺，為深入研究動(dòng)物冷應(yīng)激發(fā)生機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。

冷應(yīng)激；大鼠；iTRAQ；差異表達(dá)蛋白

應(yīng)激反應(yīng)最早是由Hans Selye提出[1]，它是一種動(dòng)物生理反應(yīng)的基本現(xiàn)象。冷刺激是寒區(qū)常見的應(yīng)激原之一，它可使畜產(chǎn)品質(zhì)量降低，動(dòng)物死亡率增加，給寒區(qū)畜牧業(yè)造成巨大損失。冷應(yīng)激可使動(dòng)物產(chǎn)生一系列復(fù)雜的生理調(diào)節(jié)反應(yīng)，如對動(dòng)物的生產(chǎn)性能、生理免疫、抗氧化功能、血液中部分生化指標(biāo)等造成影響[2]。畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家早已高度關(guān)注動(dòng)

物應(yīng)激問題[3]。近年來國內(nèi)學(xué)者也逐漸開始重視動(dòng)物應(yīng)激發(fā)生機(jī)制的研究。盡管應(yīng)激研究取得了許多進(jìn)展，但應(yīng)激的評估指標(biāo)、方法及其發(fā)生機(jī)理并未取得實(shí)質(zhì)性的成果。國內(nèi)外科研工作者針對動(dòng)物應(yīng)激的研究僅著眼于單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)分子的作用，缺乏在蛋白質(zhì)水平的系統(tǒng)性、整體性的研究，且尚無公認(rèn)的應(yīng)激診斷標(biāo)志物，故限制了應(yīng)激發(fā)生機(jī)制的深入研究，也給動(dòng)物與人類應(yīng)激疾病的臨床診斷帶來了困難。

同重同位素相對與絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在2004年推出的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)[4]。它可以同時(shí)對多種不同樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量比較，可對正常與疾病、治療前后、疾病發(fā)展過程、細(xì)胞培養(yǎng)的不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)和量的變化進(jìn)行研究[5]。本研究旨在應(yīng)用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，篩選冷應(yīng)激大鼠血漿差異表達(dá)蛋白，通過生物信息學(xué)分析篩出在冷應(yīng)激中起調(diào)控作用的重要差異蛋白，并進(jìn)一步探索它們在冷應(yīng)激發(fā)生機(jī)制中的關(guān)鍵作用，同時(shí)為進(jìn)一步篩選大鼠冷應(yīng)激的蛋白診斷標(biāo)志物奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Triple TOF 5600液相色譜電離串聯(lián)質(zhì)譜(AB SCIEX)；LC-20AB液相系統(tǒng)(島津公司)；4.6×250 mm型號的Ul tremexSCX柱；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 5430R)；600 V電泳儀(GE Healthcare EPS601)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和分組

選用12周齡，體重(340±20)g的健康SPF級雄性Wistar大鼠30只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)前將大鼠進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，均按標(biāo)準(zhǔn)采食量飼喂和自由飲水預(yù)飼1周。將大鼠隨機(jī)分為2組，分別為冷應(yīng)激組A和常溫飼養(yǎng)組B。為了減小實(shí)驗(yàn)誤差，增加技術(shù)重復(fù)，將A、B兩組分別隨機(jī)分為3組，即A1、A2、A3組和B1、B2、B3組，每組各5只大鼠，冷應(yīng)激時(shí)將每組單籠飼養(yǎng)的5只大鼠放在同一室內(nèi)同時(shí)刺激。冷應(yīng)激溫度為(4.0±0.1)℃，常溫飼養(yǎng)溫度為(24.0±0.1)℃，光照按12 h標(biāo)準(zhǔn)晝夜交替，冷應(yīng)激時(shí)間為12 h。冷應(yīng)激試驗(yàn)均在人工智能氣候室進(jìn)行。

1.3 樣品的采集和處理

經(jīng)12 h冷刺激后(冷刺激時(shí)間為晚20∶00至次日早8∶00)，于次日早8∶00同時(shí)將冷應(yīng)激組與常溫飼養(yǎng)組的大鼠從人工智能氣候室中取出，采用濃度為1.5%的戊巴比妥鈉溶液，按0.2 ml/100 g體重的劑量對大鼠進(jìn)行麻醉。使用肝素鈉抗凝負(fù)壓管采集大鼠腹主動(dòng)脈血液；采集的血液3 000 r/min離心10 min；分離血漿于15 ml離心管中，用封口膜密封，凍存于-80℃冰箱以備用。

1.4 蛋白質(zhì)提取及濃度測量

將A1、A2、A3和B1、B2、B3各組組內(nèi)的每5個(gè)樣品各取200 μl血漿等體積混合成一個(gè)樣本，各取20 μl血漿樣品，加1 ml冷丙酮沉淀過夜，4℃條件下25 000 r/min離心15 min，去上清，風(fēng)干后加300 μl蛋白裂解液復(fù)溶，冰浴超聲5 min后，4℃下25 000 r/min離心15 min，取上清，即為蛋白原樣。使用Bradford定量法對蛋白濃度進(jìn)行測量。從蛋白原樣中精確取出20 mg用Protein Enrichment Large-Capacity Kit富集蛋白；加入終濃度為10 mmol/L的DTT，56℃水浴1 h；加入終濃度55 mmol/L的IAM暗室靜置45 min；加入5倍體積的冷丙酮，-20℃沉淀蛋白液過夜；4℃條件下25 000 r/min離心20 min，除上清；風(fēng)干沉淀中殘余丙酮后，加300 μl蛋白裂解液復(fù)溶，冰浴超聲5 min后，4℃下25 000 r/min離心15 min，取上清，即為富集后的蛋白樣品。使用Bradford定量法對蛋白濃度進(jìn)行測量。

1.5 SDS電泳

配置濃度為12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠。將A1、A2、A3和B1、B2、B3每個(gè)樣品分別與4×loading buffer混合，95℃加熱5 min。每個(gè)樣品上樣量為30 μg，Marker上樣量10 μg。120 V恒壓電泳120 min。然后用考染液染色2 h，脫色液脫色3～5次，每次30 min。

1.6 蛋白質(zhì)酶解

從富集好的A1、A2、A3和B1、B2、B3每個(gè)蛋白樣品中精確取出100 μg蛋白；蛋白與酶按20∶1的比例加入胰蛋白酶(Trypsin)，37℃酶解4 h；上述比例再補(bǔ)加Trypsin一次，37℃繼續(xù)酶解8 h。

1.7 iTRAQ標(biāo)記、SCX分離及液相串聯(lián)質(zhì)譜分析

胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段；0.5 mol/L TEAB復(fù)溶肽段，按照手冊進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記；一組肽段被不同的iTRAQ標(biāo)簽標(biāo)記，室溫培養(yǎng)2 h；標(biāo)記后的各組肽段混合。采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)、分離柱為4.6×250 mm型號的Ultremex SCX柱對樣品進(jìn)行液相分離。分離后樣品經(jīng)Triple TOF 5 600的液相色譜電離串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MSMS)分析采集數(shù)據(jù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

1.8.1 原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜原始文件轉(zhuǎn)換成mgf格式后被使用，mgf文件主要包含了二級質(zhì)譜(MS/MS)譜圖的信息。本次使用的數(shù)據(jù)庫是Uniprot_RAT(34908sequences)，然后應(yīng)用Mascot以mgf為原始文件，選擇建立好的數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，當(dāng)差異倍數(shù)(Ratio值)大于1.2倍或小于1.0，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P-value值小于0.05時(shí)，視為冷應(yīng)激組與常溫飼養(yǎng)組之間的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)差異蛋白。

1.8.2 生物學(xué)功能分析 將篩選出來的血漿差異表達(dá)蛋白進(jìn)行以下3種生物學(xué)功能分析：以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出在差異蛋白中顯著性富集的Pathway富集分析；找出差異蛋白中顯著富集的GO功能條目，從而給出差異蛋白質(zhì)與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)的GO富集分析；預(yù)測差異蛋白可能的功能并對其做功能分類統(tǒng)計(jì)的COG分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)共鑒定到了1 085個(gè)蛋白質(zhì)，以差異倍數(shù)大于1.2或小于1.0，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P-value值小于0.05時(shí)，視為差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)。通過分析，共鑒定到39種差異表達(dá)蛋白，其中表達(dá)上調(diào)的差異蛋白29種(表1)，表達(dá)下調(diào)的差異蛋白10種(表2)，其中有些蛋白重復(fù)出現(xiàn)不同的亞型，功能相近，說明差異蛋白篩選結(jié)果比較理想。

Tab. 1 Up-regulated proteins between cold stress and control group of rat

GroupIDRatioGlyceraldehyde-3-phosphatedehy-drogenaseP047971.251Myl6proteinQ641191.448333333Myosin-9Q8VDD51.271333333Proteindisulfide-isomeraseA6Q630811.299333333Fermitinfamilyhomolog3,Q8K1B81.273666667Minorhistocompatibilitypro-teinHA-1Q3TBD21.607666667Integrinalpha-IIbQ9QUM01.368666667ATP-dependent6-phospho-fructokinase,platelettypeP478601.710666667IgheavychainVregionT601P018081.607666667CreatinekinaseM-typeP073101.83Integrin-linkedproteinkinaseO552221.407Glycoprotein5,plateletO087701.885RasGTPase-activatingprotein3Q9QYJ21.383666667COP9signalosomecomplexsubunit5O358641.268Coronin-1AQ91ZN11.367333333Integrinbeta-1P491341.292FetubproteinQ9QX791.625ProteinIghv13-1(Fragment)P018011.477333333Alpha-actinin-1Q9Z1P21.337333333cAMP-dependentproteinki-nasetypeII-betaregulatorysubunitP123691.257333333Plastin-2Q612331.416333333Ras-relatedproteinRap-1bQ626361.436666667Myl9proteinQ9CQ191.546333333FilaminalphaQ8BTM81.583Tubulinbeta-2AchainQ4R5B31.266333333Nidogen-1P084601.199666667Alpha-2-antiplasminQ612471.237666667VaspproteinP704601.401666667cGMP-specific3',5'-cyclicphos-phodiesteraseO547351.317

ID is the “Uniprot_Swissprot Accession” of a protein in Uniprot _RAT(34908sequences).Some uncharacterized protein are searched again in the database

Tab. 2 Down-regulated proteins between cold stress and control group of rat

GroupIDRatioSecretedphosphoprotein24Q627400.879666667Isoform2ofMurinoglobulin-1Q036260.768hepatictriacylglycerollipaseP078670.902333333Napsin-AO090430.807666667coagulationfactorXIID3ZTE00.814333333beta-galactosidealpha-2,6-sia-lyltransferase1P137210.884333333IgkappachainV-VIregionXRPC44P016750.655333333GbaproteinP174390.652alpha-2-macroglobulinP062380.585Iggamma-2BchainCregionP207610.749666667

2.2 生物學(xué)功能分析

經(jīng)Pathway富集分析，冷應(yīng)激組與常溫飼養(yǎng)組之間的差異蛋白最顯著富集的兩條pathway通路是黏著斑通路(focal adhesion)和白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移(leukocyte transendothelial migration)，其中MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)存在于以上兩個(gè)pathway中。顯著富集于黏著斑通路中的10個(gè)差異蛋白分別是：組織相容性蛋白HA-1(minor histocompatibility protein HA-1，PI3K)、Ras相關(guān)蛋白Rap1b(Ras-related protein Rap-1b，Rap1)、整合蛋白β-1(integrin beta-1，ITGB)、整合蛋白2b(integrin alpha-IIb，ITGA)、α輔肌動(dòng)蛋白1(Alpha-actinin-1，actinin)、細(xì)絲蛋白α(filamin alpha，F(xiàn)ilamin)、鐵蛋白家族同族體3(fermitin family homolog 3,Talin)、血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(Vasp protein ,VASP)、整合素連接激酶(integrin-linked protein kinase,ILK)、肌球蛋白輕鏈6(Myl6 protein,MLC)；顯著富集于白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的6個(gè)差異蛋白，分別是：ITGB、PI3K、Rap1、MLC、VASP、actinin；顯著富集于MAPK信號通路中的3個(gè)差異蛋白，分別是：Rap1、filamin、PI3K。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)代謝通路均與冷應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。其中，PI3K、Rap1和ITGB在這3個(gè)顯著性富集的pathway中重復(fù)出現(xiàn)，并在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。GO富集分析結(jié)果排名前三的分別是：分子功能為整合(46.15%)、催化活性(26.15%)、酶調(diào)節(jié)(12.31%)；所處的細(xì)胞位置為細(xì)胞器(11.52%)、高分子復(fù)合物(9.42%)、細(xì)胞膜(7.33%)；參與的生物過程為單一生物過程(8.72%)、生物調(diào)節(jié)(8.14%)、刺激反應(yīng)(8.14%)。經(jīng)COG分析差異蛋白的功能主要包括：通用功能預(yù)測(28.13%)、細(xì)胞骨架(23.53%)，細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂與染色體分區(qū)(9.38%)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(12.5%)，糖類運(yùn)輸和代謝(6.25%)。

3 討論

比較蛋白質(zhì)組學(xué)是近幾年發(fā)展起來的功能強(qiáng)大的組學(xué)技術(shù)之一，它可以用來尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)既可以為生理病理機(jī)理研究提供線索，又可以為相關(guān)診斷提供分子標(biāo)志物。目前，比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究已逐步應(yīng)用到動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的研究中，熱休克蛋白70、解耦聯(lián)蛋白、金屬硫蛋白、冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白等應(yīng)激蛋白研究較多，但至今并未確定哪種蛋白在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用的比較成熟的定量方法主要有兩種：一種基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色，另一種基于質(zhì)譜檢測iTRAQ技術(shù)。而iTRAQ技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)有：定量敏感、反應(yīng)速度快；標(biāo)記完全，標(biāo)記效率高達(dá)97%以上；較高的重復(fù)性，能簡化譜的復(fù)雜程度、提高離子強(qiáng)度；可對多達(dá)八種不同樣本同時(shí)進(jìn)行定量分析；定性與定量同時(shí)進(jìn)行。所以本研究采用iTRAQ技術(shù)篩選冷應(yīng)激大鼠血漿差異表達(dá)蛋白，并通過pathway、GO和COG分析差異表達(dá)蛋白在冷應(yīng)激發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。

通過生物信息學(xué)分析，在所獲得的差異表達(dá)蛋白中，PI3K、Rap1和ITGB這3種差異表達(dá)蛋白與動(dòng)物冷應(yīng)激密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)pathway富集通路之黏著斑通路中包含MAPK信號通路，MAPK家族信號通路又包括4條代謝途徑，其中一條JNK途徑存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，其作用過程涉及多層次的細(xì)胞調(diào)節(jié)，對生理、病理刺激(包括冷應(yīng)激)可做出不同反應(yīng)，同時(shí)其可將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，并引起細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等生物學(xué)反應(yīng)[6-10]。也有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激、細(xì)胞因子、生長因子、神經(jīng)酰胺等因素能激活JNK，JNK激活后的效應(yīng)主要與細(xì)胞應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)[11]。PI3K、Rap1和ITGB存在MAPK信號通路中的JNK途徑中，即ITGB-FAK-PI3K-PIP3-Vav-Rac-JNK和ITGB-FAK-p130Cas-Crk-GRF2 -Rap1-JNK。其中，ITGB是整合蛋白的一個(gè)亞基，是一種跨膜蛋白，可與細(xì)胞外基質(zhì)、血漿蛋白和細(xì)胞表面分子連接，促使黏著斑的形成。ITGB激活FAK后，繼續(xù)激活PI3K和Rap1，進(jìn)而激活JNK途徑對細(xì)胞黏附和遷移、增生和分化及凋亡產(chǎn)生影響[12]，繼而在冷應(yīng)激的生理反應(yīng)中發(fā)揮作用。三種蛋白均為差異上調(diào)蛋白。如上所述，它們均會(huì)促進(jìn)黏著斑通路形成，積極參與冷應(yīng)激反應(yīng)，也充分驗(yàn)證了MAPK信號通路和黏著斑通路與冷應(yīng)激發(fā)生機(jī)制有密切關(guān)系。

冷應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥，各種炎癥細(xì)胞在致炎因素的刺激下，需要從外周血管遷移到炎癥部位或到次級淋巴組織，發(fā)揮殺傷病原微生物等炎癥細(xì)胞趨化作用。炎癥細(xì)胞需要克服的第一道屏障就是血管內(nèi)皮細(xì)胞層或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞層，即白細(xì)胞內(nèi)皮遷移。而白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移是本實(shí)驗(yàn)差異蛋白顯著富集的一個(gè)代謝途徑之一。其中PI3K、Rap1和ITGB在此途徑中參與的通路過程為：Gi-PI3K-TEC-Vav-Rac2和Gi-EPAC-Rap1-ITGAL/ITGB2-Pyk2-Vav-Rac2。遷移的第一步是形成板狀偽足，其形成主要受Rac調(diào)節(jié)。研究表明Gi通過PI3K途徑激活Rac。Rac在被Gi激活時(shí)必需有PI3K的參與，抑制PI3K的活性將阻止Rac的順利激活，所以差異表達(dá)上調(diào)的PI3K在此途徑中發(fā)揮促進(jìn)白細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的至關(guān)重要作用。而Rap1參與包括細(xì)胞生長、分化、肥大、增殖以及上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程[13]，Rap1在內(nèi)皮遷移與血管生成的作用相對明確，Rap1缺失可以導(dǎo)致血管生成、內(nèi)皮細(xì)胞遷移及增殖的功能受損以及MAPK信號通路的受阻[14]。ITGB在此代謝途徑中的作用同黏著斑通路，促使黏著斑形成，黏著斑的形成有助于信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)細(xì)胞遷移。進(jìn)而在冷應(yīng)激的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用iTRAQ結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)成功篩選冷應(yīng)激大鼠血漿差異表達(dá)蛋白，通過生物信息學(xué)分析選出在冷應(yīng)激中發(fā)揮調(diào)控功能的差異蛋白PI3K、Rap1和ITGB，并進(jìn)一步探討了它們在代謝途徑中的重要作用，且發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)促進(jìn)了冷應(yīng)激發(fā)生機(jī)制的深入研究，也為進(jìn)一步篩選大鼠冷應(yīng)激的蛋白診斷標(biāo)志物奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

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Screening differentially expressed plasma proteins in cold stress rats based on iTRAQ combined with mass spectrometry technology

LIU Yan-zhi, GUO Jing-ru, PENG Meng-ling, MA Li, ZHEN Li, JI Hong, YANG Huan-minΔ

(College of Animal Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Objective: Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) combined with mass spectrometry were used to screen differentially expressed plasma proteins in cold stress rats. Methods: Thirty health SPF Wistar rats were randomly divided into cold stress group A and control group B, then A and B were randomly divided into 3 groups(n=5): A1,A2,A3 and B1,B2,B3.The temperature of room raising was(24.0±0.1)℃, and the cold stress temperature was(4.0±0.1)℃. The rats were treated with different temperatures until 12 h. The abdominal aortic blood was collected with heparin anticoagulation suction tube. Then, the plasma was separated for protein extraction, quantitative, enzymolysis, iTRAQ labeling, SCX fractionation and mass spectrometry analysis. Results: Totally, 1 085 proteins were identified in the test, 39 differentially expressed proteins were screened, including 29 up-regulated proteins and 10 down-regulated proteins. Three important differentially expressed proteins related to cold stress were screened by bioinformatics analysis (Minor histocompatibility protein HA-1, Ras-related protein Rap-1b, Integrin beta-1). Conclusion: In the experiment, the differentially expressed plasma proteins were successfully screened in cold stress rats. iTRAQ technology provided a good platform to screen protein diagnostic markers on cold stress rats, and laid a good foundation for further study on animal cold stress mechanism.

cold stress; rat; iTRAQ; differentially expressed proteins

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372398)；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(C2015041)

2015-01-07 【修回日期】2015-03-02

S852.21

A

1000-6834(2015)05-392-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.003

△【通訊作者】Tel: 0459-6819201; E-mail: yanghuanmin@aliyun.com