黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單通道鈣電流的影響*

周曉敏, 柴 花, 王伊林, 黃 俠, 趙雅君, 趙 明

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 通遼 028000)

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黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單通道鈣電流的影響*

周曉敏, 柴 花, 王伊林, 黃 俠, 趙雅君, 趙 明△

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 通遼 028000)

目的：觀察黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單通道鈣電流的影響，探討黃芪總黃酮改善病毒性心肌炎小鼠血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制。方法：36只雄性Balb/c小鼠分為正常對(duì)照組、病毒性心肌炎組和黃芪總黃酮組(n=12)，病毒性心肌炎組應(yīng)用柯薩奇B3病毒制作BALB /c 小鼠病毒性心肌炎模型， 7 d處死小鼠取心臟 Langendorff離體心臟逆向灌流法分離小鼠心室肌細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞貼附式方式記錄心室肌細(xì)胞鈣電流，分析對(duì)鈣單通道電流的影響。結(jié)果：黃芪總黃酮組可使病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞鈣通道開(kāi)放時(shí)間減少，開(kāi)放概率明顯降低 (P<0.05)，關(guān)閉時(shí)間明顯增高(P<0.05)。結(jié)論：黃芪總黃酮通過(guò)降低病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞鈣通道開(kāi)放時(shí)間、增加關(guān)閉時(shí)間、降低開(kāi)放概率抑制心室肌細(xì)胞鈣電流，抑制心肌細(xì)胞鈣超載，改善病毒性心肌炎小鼠血流動(dòng)力學(xué)。

黃芪總黃酮；病毒性心肌炎；單通道鈣電流

total flavonoids of astragalus; viral myocarditis; single channel Ca2+current

病毒性心肌炎( viral myocarditis, VMC) 是由病毒感染引起的心肌實(shí)質(zhì)或間質(zhì)的局限性或彌漫性病變[1],病毒性心肌炎致使心肌收縮力下降引起的心力衰竭是病毒性心肌炎患者死亡的重要原因[2]。心力衰竭是指心肌的舒縮功能障礙而導(dǎo)致泵血能力降低,是多種心血管疾病的終末共同通路，死亡率高，是臨床上需要解決的問(wèn)題。

中藥黃芪具有顯著的益氣強(qiáng)心作用。在臨床上被用于治療心絞痛、高血壓、病毒性心肌炎、腦梗塞、心律失常等[3]。黃芪總黃酮(total flavonoids of astragalus，TFA)是從蒙古黃芪中分離的主要活性成分,TFA中主要含有 6種單體化合物,經(jīng)光譜分析分別鑒定為B-谷甾醇(1)、芒柄花素(2)、毛蕊異黃酮(3)、B-谷甾醇-3-O-B-D-葡萄糖苷(4)、芒柄花素-7-O-B-D-吡喃葡萄糖苷(5)、毛蕊異黃酮-7-O-B-D-吡喃葡萄糖苷(6),經(jīng)計(jì)算這六種化合物在TFA分離出的單體化合物中重量組合比例為23∶11∶12∶3∶22∶29[4]。本研究小組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可以改善病毒性心肌炎小鼠血流動(dòng)力學(xué)[5]，但作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)觀察黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單通道鈣電流的影響，研究其對(duì)病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單通道鈣通道開(kāi)放時(shí)間、開(kāi)放概率、關(guān)閉時(shí)間的作用，進(jìn)而揭示黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞鈣循環(huán)的作用，探討黃芪總黃酮改善病毒性心肌炎心力衰竭小鼠血流動(dòng)力學(xué)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物藥品與儀器

36只雄性Balb/c小鼠，4周齡, 體質(zhì)量13～15 g；CVB3(Nancy株)購(gòu)自吉林大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心病毒室, 病毒原液效價(jià)為10-3 TCID 50/L。膜片鉗放大器200-B為美國(guó)AXON公司產(chǎn)品。

1.2 病毒性心肌炎BALB/c小鼠模型的制備

選清潔級(jí)雄性小鼠36只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、病毒性心肌炎組和黃芪總黃酮組(n=12)。病毒感染組與黃芪總黃酮組腹腔內(nèi)無(wú)菌注射含0.1 ml 10-950TCID CVB3，正常對(duì)照小鼠組不注射CVB3病毒而注射0.1 ml生理鹽水，每日注射1次，共3 d。黃芪總黃酮組小鼠每日腹腔注射0.2 ml黃芪總黃酮20 mg/L。從注射病毒起每日觀察小鼠的一般狀態(tài), 主要觀察小鼠的反應(yīng)，詳細(xì)記錄小鼠飲食, 毛色, 活動(dòng)和排泄情況。

1.3 小鼠心室肌細(xì)胞急性分離方法

7 d后急性處死各組BALB/c小鼠后,迅速開(kāi)胸取出心臟, 置于冰冷有鈣臺(tái)氏液中。行主動(dòng)脈插管后固定于Langendorff灌流架上逆向灌流心臟, 有鈣臺(tái)氏液115 min, 無(wú)鈣臺(tái)氏液6 min, 酶溶液13 min, 貯存液3 min。灌流完畢后, 沿房室溝處剪下心室部分, 用眼科剪將心室肌剪成小碎塊, 置于盛有貯存液的三角燒杯中, 在37℃的水浴箱中輕輕震蕩10 min, 吸取上清液置于離心管中, 離心5 min后棄上清液, 加入貯存液, 于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單通道鈣電流的記錄方法

應(yīng)用膠原酶常規(guī)分離小鼠心室肌細(xì)胞。玻璃微電極拉制后，在其尖端涂覆硅酮樹(shù)酯(Sylgaud)，然后進(jìn)行拋光，充灌電極液后細(xì)胞外液中電阻為1～2 MΩ，玻璃微電極接觸到細(xì)胞的表面以后，通過(guò)負(fù)壓吸引作用使電極尖端與細(xì)胞膜表面形成10 GΩ以上的高阻封接后，使微電極尖端下的細(xì)胞膜片與周?chē)?xì)胞膜形成電—化學(xué)絕緣，形成細(xì)胞貼附式記錄方式。將保持電壓設(shè)置在-50 mV，階躍至0 mV，持續(xù)時(shí)間為1 000 ms，采樣頻率為1 kHz，采樣32條曲線，每個(gè)細(xì)胞記錄32 s，記錄鉗制電壓下的單通道鈣電流。Pclamp 6.01 程序采集、分析、處理數(shù)據(jù)用Pstat程序分析單通道總的開(kāi)放時(shí)間、關(guān)閉時(shí)間、用總的記錄時(shí)間除以總的開(kāi)放時(shí)間計(jì)算單通道的開(kāi)放概率。本實(shí)驗(yàn)每組共記錄10個(gè)心室肌細(xì)胞單通道電流。

1.5 實(shí)驗(yàn)所用溶液

含Ca2+臺(tái)式液成分為：(mmol/ml)：NaCl 143, KCl 5.4,CaCl2·2H2O 1.8, MgCl2·6H2O 0.5, NaH2PO4·2H2O 0.25, HEPES 5。調(diào)pH值至7.4。 無(wú)Ca2+臺(tái)式液去掉上述臺(tái)式液配方中的Ca2+成分即可，其余成分均相同。細(xì)胞貯存液(mmol/ml)：KOH 70， L-谷氨酸 50 ，KCl 40，Taurine 20，KH2PO420，MgCl2·6H2O3，Glucose 10，HEPES 10，EGTA 0.5， 用KOH調(diào)pH值至7.4。

記錄鈣離子通道溶液細(xì)胞灌流液(mmol/l)：Aspartic acid 130,KOH 100，KCl 30,MgCl2·6H2O 0.5，HEPES 10，EGTA 1， 用CsOH調(diào)pH值至7.4。電極液：(mmol/l)：BaCl250,TEA 70,EGTA 0.5,HEPES 10.用CsOH調(diào)pH值至7.4。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況及心肌病理改變：

對(duì)照組小鼠活動(dòng)正常全部存活，病毒性心肌炎組小鼠在注射CVB3 后出現(xiàn)豎毛、蜷縮、不喜進(jìn)食、活動(dòng)減少等體征, 注射CVB3后第3天起, 病毒性心肌炎組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡,至第7天共死亡2只。對(duì)照組及黃芪總黃酮治療組小鼠無(wú)死亡，注射CVB3后7 d，對(duì)照組及黃芪總黃酮治療組隨機(jī)處死10只，病毒性心肌炎組處死剩余小鼠。病毒性心肌炎組病變嚴(yán)重，外觀心肌呈淡黃色，質(zhì)地較軟，呈松弛擴(kuò)張狀態(tài)狀態(tài)，與正常對(duì)照組小鼠相比心臟擴(kuò)大。光鏡觀察：對(duì)照組小鼠心肌纖維排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，未見(jiàn)心肌纖維變性壞死等病理性改變。病毒性心肌炎模型組病理改變明顯，可見(jiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞壞死和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)明顯水腫。黃芪總黃酮組小鼠心肌也出現(xiàn)一定程度的病理變化，與病毒性心肌炎模型組比較，病變程度輕、病變范圍小,心肌纖維排列尚可，結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維間隔略增寬，間質(zhì)輕度水腫，偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

Fig.. 1 Changes of mice myocardial pathology (HE ×200) A： Control group； B： Virus myocarditis group；C： Total flavonoids of Astragalus group

2.2 小鼠心室肌細(xì)胞單鈣通道的特點(diǎn)

記錄小鼠心室肌細(xì)胞單鈣通道電流，先將保持電壓維持在-50 mV，階躍至0 mV，持續(xù)時(shí)間100 ms，采樣32條曲線，共計(jì)3.2秒。應(yīng)用6.02軟件分析。鈣通道的幅值為(1.03±0.09 pA，n=10)，鈣通道的平均開(kāi)放時(shí)間為(1.01±0.11) ms，平均關(guān)閉時(shí)間為(14.52±1.43) ms。開(kāi)放概率為(13.35±4.25)%。在電極液中加入Bay k 8644(一種鈣通道特異激動(dòng)劑)，可明顯增加單鈣通道電流的平均開(kāi)放時(shí)間(2.95±0.28) ms，縮短鈣通道關(guān)閉時(shí)間(8.79±0.71) ms，使增加開(kāi)放概率增加到(35.86±3.12)%。在電極液中加入維拉帕米(Ver) 25 μmol/L 可完全抑制單鈣通道的開(kāi)放，這和文獻(xiàn)報(bào)道一致[6](圖2)。

Fig. 2 Using the exponential fitting the channel mean open and the average closing time, use the formula to calculate the single channel current amplitude and the original single calcium channel curve A： Single channel current amplitude； B：Control group； C： Bay k 8644； D： Calcium current in ventricular cells of each group

2.3 病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單鈣通道的變化

Fig. 3 Effect of total flavonoids of Astragalus with exponential fitting on viral myocarditis in mouse ventricular myocytes of single calcium channel mean open time and closed time

應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)方法，記錄對(duì)照組小鼠與注射病毒7 d后的小鼠心室肌細(xì)胞單通道鈣電流，結(jié)果表明，病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單鈣通道平均開(kāi)放時(shí)間增加(1.28±0.78) ms，平均關(guān)閉時(shí)間縮短(11.10±1.03) ms，開(kāi)放概率增加(28.33±7.41)%，與對(duì)照組圖比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.4 黃芪總黃酮對(duì)病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞單鈣通道的作用

應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)方法，記錄病毒性心肌炎小鼠+黃芪總黃酮7 d后的單通道鈣電流，與對(duì)照組相比，黃芪總黃酮組小鼠心肌細(xì)胞單通道鈣電流開(kāi)放時(shí)間(1.28±0.36)ms縮短(P<0.05)，關(guān)閉時(shí)間(11.10±1.17)ms明顯延長(zhǎng)(P<0.05,表1,圖4)。

GroupOpeningtime(ms)Closingtime(ms)Openingprobability(%)Control1.01±0.1114.52±1.4313.35±4.25BayK2.95±0.288.79±0.7135.86±3.12Virusmyocardi-tis1.95±0.479.22±1.2628.33±7.41Virus+astragals1.28±0.36*11.10±1.17*18.35±6.41*

*P<0.05vsviral myocarditis group

3 討論

病毒性心肌炎可以造成嚴(yán)重后果乃至死亡,死亡原因大多是因?yàn)楸霉δ苁軗p或耗竭。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)心律失常及心力衰竭發(fā)病機(jī)制都與細(xì)胞內(nèi)鈣超載密切相關(guān)。心肌細(xì)胞內(nèi)的肌漿網(wǎng)可攝取和釋放鈣離子, 在調(diào)節(jié)胞漿內(nèi)的游離鈣離子方面起著重要作用, 研究表明心肌衰竭與肌漿網(wǎng)的異常鈣調(diào)節(jié)有關(guān)[7]。引起鈣超載的原因有: 心肌細(xì)胞動(dòng)作電位平臺(tái)期鈣內(nèi)流增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶2(SERCA2)表達(dá)減少或活性降低及肌纖維膜蛋白復(fù)合體介導(dǎo)的鈉鈣交換障礙等[8]。本研究觀察到黃芪總黃酮通過(guò)降低病毒性心肌炎小鼠心室肌細(xì)胞鈣通道開(kāi)放時(shí)間、增加關(guān)閉時(shí)間、降低開(kāi)放概率抑制心室肌細(xì)胞鈣電流，通過(guò)干擾細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流, 進(jìn)而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放鈣減少，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而緩解了鈣超載心肌損傷的程度, 促使心肌主動(dòng)松弛而改善心臟舒張功能, 并間接地改善收縮性心功能不全的程度。上述機(jī)制可能是黃芪總黃酮可以改善病毒性心肌炎小鼠血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制之一。

Fig. 4 Effeces of total flavonoids of astragalus on single channel Ca2+current of ventricular myocytes in viral myocarditis group

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內(nèi)蒙古自治區(qū)科技廳資助項(xiàng)目(2011BS1101)

2014-09-23 【修回日期】2014-10-30

R331.3；R332

A

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10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.017

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