低溫條件下大氣PM2.5對大鼠心臟抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的影響*

羅 斌， 王麗娜， 晚亞雄， 石艷榮， 牛靜萍， 羅小峰

(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所， 蘭州 730000)

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低溫條件下大氣PM2.5對大鼠心臟抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的影響*

羅 斌△， 王麗娜， 晚亞雄， 石艷榮， 牛靜萍， 羅小峰

(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所， 蘭州 730000)

目的：探討不同低溫條件下大氣細顆粒物(PM2.5)對大鼠心臟抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的影響。方法：將36只健康雄性Wistar大鼠按體重隨機分成6組(n=6)，分別給予0℃、10℃及20℃(常溫對照)的單純低溫刺激及低溫+PM2.5暴露。低溫+PM2.5暴露組給予低溫刺激及氣管滴注PM2.5(每次0.25 ml/8 mg)，單純低溫刺激組和常溫組給予無菌生理鹽每只每次0.25 ml，間隔48 h，連續(xù)3次。末次染毒48 h后處死大鼠，采用試劑盒法測定心肌組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)及C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平。結(jié)果：低溫+PM2.5暴露組大鼠心肌組織中MDA、SOD、IL-6及CRP水平顯著高于單純低溫組，尤其在0℃時，PM2.5對四指標的影響最為顯著(P<0.05)。各單純氣溫組間比較時，僅SOD在0℃組降低較為明顯，其余指標未出現(xiàn)顯著變化。各低溫PM2.5暴露組組間比較時，MDA、SOD、IL-6及CRP在0℃的PM2.5暴露組升高最為明顯，顯著高于其他各組(P<0.05)。交互作用檢測未發(fā)現(xiàn)低溫和PM2.5間存在顯著交互作用(P<0.05)。結(jié)論：低溫刺激可能會增加PM2.5的心臟毒性，使其抑制心肌組織抗氧化能力和促進炎癥的發(fā)生增加。

低溫；大氣PM2.5；大鼠心肌組織；抗氧化能力；炎癥反應(yīng)

cold stress； fine particulate matter； rat myocardial tissue； anti-oxidative capacity； inflammatory response

流行病學(xué)研究認為急性或長期暴露于大氣顆粒物能引起心血管疾病發(fā)病和死亡率的急劇增加[1, 2]。這種增加的機制可能為顆粒物暴露引起心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激損傷和炎癥等有關(guān)，通過抑制心肌組織抗氧化能力和增加氧化自由基的產(chǎn)生，并引起炎癥因子水平的升高，從而誘發(fā)心血管疾病[3, 4]。低溫作為心血管系統(tǒng)的又一危險因素，它與心血管疾病的增加呈負相關(guān)，氣溫越低心血管疾病危險性越大[5]。據(jù)報道低溫及大氣顆粒物在對心血管系統(tǒng)的影響中存在交互作用，低溫能增強PM2.5對心血管系統(tǒng)的毒性作用，造成心血管疾病發(fā)病率和死亡率的升高[6]。由此可見，低溫刺激下PM2.5的心血管系統(tǒng)毒性可能增強。環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，冷空氣擾動發(fā)生時會引起大氣PM2.5濃度升高。如發(fā)生于蘭州2014年4月的一次冷空氣過程，48 h最低溫下降了5℃，最低溫達2℃，同時該日蘭州地區(qū)大氣PM2.5濃度高達616 μg/m3。因此，低溫刺激下較高濃度的PM2.5暴露是否對心血管系統(tǒng)的影響更大是需要迫切解決的問題。本研究將利用低溫刺激與大氣PM2.5對大鼠進行聯(lián)合暴露，并從心肌抗氧化能力及炎癥反應(yīng)的角度來探討不同低溫條件下PM2.5對大鼠的心臟毒性。

1 材料與方法

1.1 PM2.5采集和處理

利用PM2.5采樣儀采集蘭州地區(qū)2014年4～5月大氣PM2.5，離地5 m以100 L/min流量連續(xù)采集于玻璃纖維濾膜上，剪成1 cm2大小的小塊，置于去離子水中超聲震蕩20 min，重復(fù)3次，功率500 W洗脫顆粒物。6層紗布過濾，除去玻璃纖維濾膜。將濾過液于4℃，12 000 r/min，離心20 min，收集下層沉淀液，真空冷凍干燥，于-20℃避光保存。染毒前，利用生理鹽水(normal saline，NS)將PM2.5制成懸液，超聲振蕩15 min, 使懸液混勻并高壓滅菌。

1.2 實驗動物及分組

36只健康雄性Wistar大鼠購買于甘肅省中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號:SCXK (甘) 2004～0006，體重(209.41±16.33) g。將36只大鼠按體重隨機分成6組(n=6)，于室溫(20±1)℃、相對濕度40%～60%，空白對照飼養(yǎng)7 d，期間給予充足的水和飼料。6組分別為常溫組(20℃)、常溫PM2.5染毒組(20℃+PM2.5)、低溫刺激組Ⅰ(10℃)，低溫刺激組Ⅱ(0℃)、低溫刺激Ⅰ+PM2.5染毒組(10℃+PM2.5)、低溫刺激Ⅱ+PM2.5染毒組(0℃+PM2.5)

1.3 低溫刺激及PM2.5染毒

適應(yīng)性飼養(yǎng)后，6組大鼠隨機接受不同的處理因素。具體暴露過程為：將大鼠放于氣象環(huán)境模擬箱中，給予低溫刺激4 h(氣壓及相對濕度同空白對照)，期間第2小時乙醚麻醉大鼠，并通過氣管滴注給予PM2.5組無菌PM2.5懸液(預(yù)降溫，每次8 mg/0.25 ml)染毒，而給予單純低溫組無菌NS每只每次0.25 ml，間隔48 h，連續(xù)染毒3次。

1.4 心肌組織勻漿制備及指標測定

末次低溫刺激和PM2.5暴露48 h后，腹腔注射水合氯醛(5%，0.6 ml/kg)，通過腹主動脈終末采血法處死大鼠，立即摘取心臟并稱重，按照1∶9生理鹽水利用勻漿器在冰浴中將其制成10%組織勻漿，4℃ 3 000 r/min離心20 min，取上清液分裝成5管，保存于-80℃，分別用于測定組織勻漿中總蛋白、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)(南京建成生物工程研究所)，C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)(RD Systems，Inc)。具體步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織抗氧化能力的變化

MDA在0℃及10℃的PM2.5暴露組均顯著高于相應(yīng)單純低溫刺激暴露組(P<0.05)，而且在0℃的PM2.5暴露組顯著高于常溫PM2.5組(P<0.05)。MDA在各單純氣溫刺激組間并無顯著差異。在SOD的結(jié)果中，0℃的PM2.5暴露組明顯低于相應(yīng)單純低溫刺激組及其他PM2.5暴露組(P<0.05)，而且在0℃單純低溫刺激組也明顯低于常溫對照組(P<0.05，表1)。盡管交互作用檢驗沒有發(fā)現(xiàn)顯著的交互作用，但這些結(jié)果可能提示PM2.5暴露在低溫時對大鼠心臟抗氧化能力影響更強。

Tab. 1 SOD and MDA level of myocardial tissue in cold stress alone groups and cold stress combined PM2.5 exposure groups

GroupsSOD(mgprot/ml)MDA(nmol/mgprot)20℃+saline2547.46±460.670.88±0.2120℃+PM2.52338.38±256.011.00±0.1010℃+saline2328.98±253.860.94±0.1110℃+PM2.52250.16±534.381.21±0.26*0℃+saline1991.52±273.52#1.06±0.09#0℃+PM2.51676.65±130.11*Δ1.29±0.28*Δ

SOD： Superoxide dismutase; MDA： Malondialdehyde

*P<0.05vscorresponding cold stress alone group；#P<0.05vsgroup of 20℃+saline；ΔP<0.05vsgroup of 20℃+PM2.5

2.2 各組大鼠心肌組織炎癥因子CRP和IL-6的影響的變化

IL-6及CRP在0℃的PM2.5暴露組濃度最高，顯著高于常溫20℃PM2.5暴露組(P<0.05)，并且高于相應(yīng)單純低溫刺激組(P<0.05)，各單純低溫刺激組間并無顯著差異。在10℃組及常溫組，CRP在PM2.5暴露組顯著高于相應(yīng)單純低溫刺激組(P<0.05)。盡管交互作用檢驗未發(fā)現(xiàn)顯著的交互作用，但上述結(jié)果提示PM2.5暴露在低溫時對大鼠心臟炎癥因子影響更大。

Tab. 2 IL-6 and CRP level of myocardial tissue in cold stress alone groups and cold stress combined PM2.5 exposure groups

GroupsIL-6(pg/ml)CRP(pg/ml)20℃+Sa-line16.25±1.46251.37±11.4320℃+PM2.517.25±0.83261.45±4.23*10℃+Sa-line16.19±0.96246.69±10.2210℃+PM2.516.9±2.35261.18±16.86*0℃+Saline17.53±1.16248.22±11.650℃+PM2.518.98±1.28*#285.46±18.76*#

IL-6: Interleukin-6； CRP: C-reactive protein

*P<0.05vscorresponding cold stress alone group；#P<0.05vsgroup of 20℃+PM2.5

3 討論

MDA含量的高低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，而SOD可以清除機體內(nèi)的自由基如O2、H2O2，缺乏或耗竭SOD會促使許多有毒化學(xué)物質(zhì)或不良環(huán)境因素對機體產(chǎn)生中毒作用或加重其中毒作用。因此,心肌組織中MDA和SOD的含量是衡量心肌組織氧化損傷和抗氧化能力大小的重要指標。IL-6與CRP作為典型的炎癥因子，能反映機體炎癥的發(fā)生情況。趙金鐲等發(fā)現(xiàn)PM2.5能夠引起WKY及SHR大鼠心肌組織中CRP及IL-6等炎癥因子水平的升高，并引起心肌細胞內(nèi)SOD活性下降及MDA的升高[7]。這與本研究的結(jié)果相似。本研究結(jié)果提示PM2.5暴露組大鼠心肌組織中MDA和SOD含量分別高于和低于非PM2.5暴露組，而且IL-6和CRP也顯著高于非PM2.5暴露組，說明急性PM2.5暴露不僅引起大鼠心肌組織氧化損傷和抗氧化功能的抑制，而且還引起了心臟的炎癥反應(yīng)。低溫引起心血管疾病事件的發(fā)生增加，尤其是冷空氣過程會造成心血管疾病發(fā)生率和死亡率的急劇升高[8]。以往研究發(fā)現(xiàn)冷空氣過程可能通過升高血壓及其他危險因子如血壓、血脂、血纖維蛋白原等來增加心血管疾病危險[9, 10]。本研究中，低溫刺激除引起心肌組織SOD顯著的降低外，其他指標并未出現(xiàn)明顯變化。因此，可以認為低溫刺激還可能會通過降低心肌的抗氧化能力來增加心血管疾病危險性。

研究認為低溫能夠增加PM2.5對心血管疾病的影響，引起心血管疾病發(fā)生和死亡的增加，但其機制尚不清楚。本實驗利用低溫刺激與PM2.5進行聯(lián)合毒理實驗，結(jié)果提示低溫(0℃)時，PM2.5對大鼠心肌組織SOD、MDA、IL-6及CRP影響顯著。盡管交互作用檢驗并不顯著，但該結(jié)果提示較低氣溫刺激可能會增加PM2.5對心血管系統(tǒng)的影響，并通過增加PM2.5暴露對心肌組織抗氧化能力的抑制和促進炎癥的發(fā)生而發(fā)生。PM2.5主要通過呼吸系統(tǒng)進入體內(nèi)，粒徑較小的顆粒甚至通過肺泡毛細血管進入心臟中，從而對心臟產(chǎn)生毒性作用[11]。低溫刺激可能會抑制呼吸系統(tǒng)對PM2.5的防御，如低溫刺激可以破壞氣道纖毛結(jié)構(gòu)[12]，并降低肺泡巨噬細胞的吞噬能力[13]。因此低溫刺激可以抑制氣道纖毛對PM2.5的清除及肺巨噬細胞等吞噬細胞對PM2.5的吞噬作用，從而使得進入體內(nèi)的PM2.5增加。此外，低溫刺激還能引起心臟的其他毒性作用，如引起抗氧化能力下降，心血管疾病危險因子增加，從而加重PM2.5對心臟的毒性作用[9, 14]。

綜上所述，低溫刺激可能會增加PM2.5的心臟毒性，使其抑制心肌組織抗氧化能力和促進炎癥的發(fā)生增加。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(41405108)；蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目(861495)

2014-09-23 【修回日期】2014-11-07

R122

A

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