耐甲氧西林金葡菌檢測方法比較

黎文君

[摘要]目的：研究比較不同方法檢測（MRSA）的效果。方法：將從臨床感染標(biāo)本分離獲得的148株金葡菌菌株分別采用頭孢西丁、苯唑西林紙片擴(kuò)散法、基因聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測MRSA菌株，以采用基因聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法作為判斷MRSA的“金”標(biāo)準(zhǔn)。并用瓊脂稀釋法測定148株葡萄球菌對青霉素、紅霉素等10多種抗菌藥物的藥物敏感性。結(jié)果：頭孢西丁紙片法對MRSA的檢測靈敏度為93.18%，特異度為95%，漏診率為6.82%，誤診率為5%，Youden指數(shù)為0.818；苯唑西林紙片法對MRSA的檢測靈敏度為81.82%，特異度為76.67%，漏診率為18.18%，誤診率為23.33%，Youden指數(shù)為0.585，說明苯唑西林紙片法對MRSA的檢測準(zhǔn)確性低于頭孢西丁紙片法。結(jié)論：PCR技術(shù)檢測MRSA快速且敏感性和特異性強(qiáng)，可作為首選鑒別方法。頭孢西丁紙片擴(kuò)散法使用方法簡單，對實驗條件無特殊要求，較苯唑西林紙片擴(kuò)散法結(jié)果更準(zhǔn)確。

[關(guān)鍵詞]耐甲氧西林金葡菌；頭孢西丁紙片擴(kuò)散法；苯唑西林紙片擴(kuò)散法

中圖分類號：R446 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2095-5200（2015）01-074-02

金黃色葡萄球菌是臨床常見的高毒性細(xì)菌，是肺炎、腸炎、心包炎、膿毒癥以及局部化膿炎癥主要病原菌。部分金黃色葡萄球菌產(chǎn)生青霉素酶，能水解B-內(nèi)酰胺環(huán)，表現(xiàn)為對青霉素的耐藥。隨后研發(fā)出的甲氧西林為耐青霉素酶的半合成青霉素，但耐甲氧西林金葡菌（MRSA）已成為全世界范圍內(nèi)的重要病原菌。目前對MRSA的檢測主要圍繞耐藥表型及基因型進(jìn)行，為此，我們對美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦鑒定MRSA的頭孢西丁紙片擴(kuò)散法和苯唑西林紙片擴(kuò)散法與PCR檢測法進(jìn)行了比較，以尋找適合醫(yī)院實驗室檢測MRSA的簡單而可靠方法。

1.資料與方法

1.1菌株來源

本次研究全部188株金黃色葡萄球菌菌株取自于2013年我院各臨床科室，其來源主要為患者痰液、咽拭子、深靜脈置管、患者膿液、血液、尿液、壞死組織。

1.2材料

頭孢西丁紙片、苯唑西林紙片、抗菌藥物紙片購自中國生物制品研究所，抗菌藥物紙片主要包括：青霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、頭孢噻肟、萬古霉素、克林霉素、頭孢呋辛、奈替米星、阿米卡星、培氟沙星、頭孢唑林。

細(xì)菌培養(yǎng)基為英國BBL公司生產(chǎn)。

基因聚合酶鏈反應(yīng)PCR擴(kuò)增儀PE-9700美國PE公司生產(chǎn)。電泳檢測裝置英國BBL公司生產(chǎn)。

1.3實驗方法

1.3.1頭孢西丁紙片擴(kuò)散法 將金葡萄菌樣本調(diào)制成1.5×10CFU/mL濃度，并涂抹于4mm厚的MH瓊脂平板上，將頭孢西丁紙片貼于平板上，35℃溫度下孵化24h。抑菌圈直徑≥13mm為敏感，≤10mm為耐藥。

1.3.2苯唑西林紙片擴(kuò)散法 金葡萄菌樣本調(diào)制為1.5×10SCFU/mL濃度操作，將調(diào)制后標(biāo)本涂抹于4mm厚MH瓊脂平板上，將苯唑西林紙片貼于瓊脂板上，35℃溫度下孵化24h。抑菌圈直徑≥20mm為敏感，≤18mm為耐藥。

1.3.3基因聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法 將金葡萄菌樣本調(diào)制成3×108CFU/mL濃度，取10止菌懸液，滴入50μLDNA提取液，操作按PCR操作說明書進(jìn)行。于100℃下行水浴15min，20000r/min離心，離心時間為10min，去除雜質(zhì)，取5μL上清液擴(kuò)增。取10止擴(kuò)增液置于2.0%瓊脂糖的TRB緩沖系統(tǒng)中電泳，于紫外透射下檢測。出現(xiàn)1000bp條帶判定為陽性。

1.4統(tǒng)計方法

所有收集數(shù)據(jù)錄入Excell2003，在spss10.0中進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用卡方檢驗，檢驗水準(zhǔn)取a=0.05。

2.結(jié)果

2.1兩種不同紙片擴(kuò)散法與PCR檢測法比較

經(jīng)PCR法檢測148株菌株中耐甲氧西林金葡菌（MRSA）88株，甲氧西林敏感金葡菌60株。以此為標(biāo)準(zhǔn)，頭孢西丁紙片法對MRSA的檢測靈敏度為93.18%，特異度為95%，漏診率為6.82%，誤診率為5%，Youden指數(shù)為0.818，說明頭孢西丁紙片法對MRSA的檢測具有較高的準(zhǔn)確性。具體見表1。

苯唑西林紙片法對MRSA的檢測靈敏度為81.82%，特異度為76.67%，漏診率為18.18%，誤診率為23.33%，Youden指數(shù)為0.585，說明苯唑西林紙片法對MRSA的檢測準(zhǔn)確性低于頭孢西丁紙片法。具體見表2。

2.2對MRSA的耐藥性分析

采用Kirb-Bauer（K-B）法進(jìn)行藥物敏感性實驗，結(jié)果：MRSA對青霉素100%耐藥，對萬古霉素完全敏感，對羅紅霉素、阿奇霉素、頭孢噻肟、克林霉素、頭孢呋辛、奈替米星、阿米卡星、培氟沙星、頭孢唑林部分敏感。

3.討論

金黃色葡萄球菌又被稱為“嗜肉菌”、“金葡萄”，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是由金黃色葡萄球菌演變出的一種新型耐藥型金黃色葡萄球菌，其被稱為超級細(xì)菌，除萬古霉素外，幾乎可抵抗其他所有藥物。耐藥型金黃色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，其耐藥機(jī)制可能為：（1）病原菌自身固有耐藥性，這種固有耐藥性是由細(xì)菌染色體介導(dǎo)所得，與細(xì)菌自身生產(chǎn)的一種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）有關(guān)，這種蛋白優(yōu)勢細(xì)菌在B-內(nèi)酰胺類抗生素環(huán)境中依舊可以生存。（2）獲得性耐藥，獲得性耐藥多由質(zhì)粒介導(dǎo)而成，部分菌株可通過耐藥因子生成大量的B-內(nèi)酰胺，進(jìn)而導(dǎo)致耐青霉素酶活性消退，最終出現(xiàn)耐藥特征。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌不但可以通過生成B-內(nèi)酰胺形成耐藥性，還可通過改變抗生素作用靶向，降低膜通透性以及生成修飾酶等機(jī)制來抵抗大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、喹諾酮類等抗生素藥效。此外，國外有研究已發(fā)現(xiàn)萬古霉素耐藥性金黃色葡萄球菌。正是因為高耐藥的金黃色葡萄球菌誘發(fā)感染疾病的難治性，臨床很重視耐藥菌檢測。

目前，耐藥性金黃色葡萄球菌檢測方法主要有紙片擴(kuò)散法、基因聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法、稀釋法檢測誘導(dǎo)試驗等。其中紙片擴(kuò)散法具有檢測速度快、操作簡便、價格低廉，可直觀反應(yīng)檢測結(jié)果。但金黃色葡萄球菌表達(dá)情況是各不相同的，這也導(dǎo)致部分紙片擴(kuò)散檢測存在一定誤差?；蚓酆厦告湻磻?yīng)（PCR）法則是臨床公認(rèn)的金黃色葡萄球菌檢測標(biāo)準(zhǔn)，但檢測設(shè)備導(dǎo)致檢測費(fèi)用高昂，難以在實驗室內(nèi)常規(guī)開展。本次研究的兩種紙片法，頭孢西丁紙片法對MRSA的檢測靈敏度為93.18%，特異度為95%，陽性似然比為9.32，Youden指數(shù)為0.818，苯唑西林紙片法對MRSA的檢測靈敏度為81.82%，特異度為71.67%，陽性似然比為3.068，Youden指數(shù)為0.585，頭孢西丁紙片法對MRSA的檢測準(zhǔn)確度高于苯唑西林紙片法。使用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測MRSA方法簡便而有效，并且實驗條件也無特殊要求。