反相高效液相色譜法測定不同方法炮制關(guān)木通中馬兜鈴酸的含量

李天鳳 李連坤 張美玲 貢濟(jì)宇 蔡廣知 趙躍剛

長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春 130117

關(guān)木通，別名木通馬兜鈴、東北木通、馬木通、萬年藤，為馬兜鈴科植物。東北馬兜鈴Aristolochia manshuriensis Kom.的干燥藤莖可入藥，古書記載有通經(jīng)下乳、利小便、通心火等功效，為臨床常用藥物。

2000年以來，國內(nèi)外發(fā)生多起由于服用馬兜鈴屬植物的藥物引起腎臟毒害事件。經(jīng)學(xué)者研究證實(shí)，引起此類事件的是化合物馬兜鈴酸。目前該類藥材已被很多國家禁止應(yīng)用，關(guān)木通也已被 《中國藥典》（2005年版）取消用藥標(biāo)準(zhǔn)。但這種做法并不可取，幾乎所有的藥物都有損害機(jī)體的潛力。有效成分如在正常范圍內(nèi)則具有治療作用，但若超出正常范圍，就會變成有毒物質(zhì)。怎樣利用中醫(yī)特色的炮制方法，將關(guān)木通中馬兜鈴酸的含量降低到0.002%成為問題的關(guān)鍵。若解決此問題將會為其他含有馬兜鈴酸中草藥的解毒開辟新道路，為臨床的安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

本研究用蜜炙、炒炙、姜炙等10種炮制方法處理關(guān)木通，采用反相高效液相色譜法對原生藥及炮制品中的馬兜鈴酸進(jìn)行測定，計算馬兜鈴酸的脫除率。關(guān)木通中馬兜鈴酸的限量應(yīng)不高于 《中國藥典》（2010年版）細(xì)辛中馬兜鈴酸的限量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

采用四元泵、自動進(jìn)樣器和紫外二極管陣列檢測器、Agilent 1260高效液相色譜儀、Chemstation工作站來處理數(shù)據(jù)。其他儀器：藥材粉碎機(jī)（廣州興榮機(jī)械生產(chǎn)）、TDZ6B-WS型離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、加壓溶劑提取儀（北京吉天儀器有限公司）、潔康PS-D30A型超聲儀。由氮?dú)夤骸?/p>

1.2 藥品

馬兜鈴酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院，含馬兜鈴酸A 99.4%；色譜純甲醇、乙腈、冰醋酸、醋酸乙酯等購自Merck公司；純水（實(shí)驗(yàn)用超純水機(jī)獲得）。

1.3 材料

1.3.1 材料來源

關(guān)木通購自上海市藥材有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院副院長貢濟(jì)宇教授鑒定，此品為東北馬兜鈴的干燥藤莖，為真品。所涉及的炮制品均由同源生品制得。姜、蜜、醋、酒為市售產(chǎn)品。

1.3.2 關(guān)木通藥材的炮制

1.3.2.1 炒焦制品的制法 用分析天平稱取關(guān)木通藥材30 g，置干凈的炒鍋內(nèi)，使用文火炒至可以嗅到焦香味即可，倒出，冷卻干燥，稱重。將得到的炒焦制品密封保存，待用。

1.3.2.2 醋炙品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，精密量取25 mL陳醋噴灑于藥材表面[1]，待藥材將醋汁吸收完全后，置炒鍋內(nèi)文火炒至嗅得藥材香味即可，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得醋炙品。密封保存，待用。

1.3.2.3 酒炙品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，量取黃酒20 mL噴灑于藥材表面，待藥材完全吸收后，文火炒至出現(xiàn)微黃色，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得酒炙品[2]。密封保存，待用。

1.3.2.4 蜜炙品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，加煉蜜10 g，文火炒至藥材將煉蜜全部吸收，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得蜜炙品。密封保存，待用。

1.3.2.5 姜炙品制法 使用分析天平精密稱取關(guān)木通藥材30 g，將20 mL姜汁均勻噴灑于藥材上（生姜榨汁），文火炒至藥材將姜汁全部吸收[3]，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得姜炙品。密封保存，待用。

1.3.2.6 堿制品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，12 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色，25℃恒溫干燥[4]，冷卻，稱重，即得堿制品。密封保存，待用。

1.3.2.7 甘草炙品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，加甘草汁20 mL（取甘草20 g用8倍量水煎煮，濃縮甘草汁至40 mL），文火炒至藥材將甘草汁全部吸收[5]，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得甘草炙品。密封保存，待用。

1.3.2.8 堿蜜合制品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，6 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色。25℃恒溫干燥，再加煉蜜10 g[6]，文火炒至藥材將煉蜜全部吸收，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得堿蜜制品。密封保存，待用。

1.3.2.9 堿姜合制品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，6 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色。25℃恒溫干燥，姜汁20 mL（取新鮮生姜，榨汁機(jī)榨汁），文火炒至藥材將姜汁全部吸收 ，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得堿姜制品。密封保存，待用。

1.3.2.10 堿酒合制品制法 稱取關(guān)木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，6 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色。25℃恒溫干燥，量取黃酒20 mL噴灑于藥材表面[8]，待藥材吸收完全后，文火炒至出現(xiàn)微黃色，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得堿酒制品。密封保存，待用。

2 方法與結(jié)果

2.1 反相高效液相色譜法測定馬兜鈴酸的含量

2.1.1 色譜條件

流動相：甲醇-1%冰醋酸進(jìn)行梯度洗脫。1%冰醋酸在15 min內(nèi)由50%降至5%，檢測波長為315 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30℃[9]。在此條件下，各組分的分離度較好。馬兜鈴酸A的保留時間為13.999 min。

2.1.2 對照樣品的制備

精密稱取，取馬兜鈴酸A對照品1 mg，精密稱定，加甲醇用定容至50 mL，使用時稀釋，制成每毫升含0.2μg的溶液，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下馬兜鈴酸A對照品溶液 5、7、9、12、15 μL[10]，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)。得到回歸方程：y=1.6×105x+21.463，R2=0.9990，馬兜鈴酸 A 線性范圍為0.0010~0.0030 μg。

2.1.4 關(guān)木通不同炮制品中馬兜鈴酸A的含量測定

將“1.3.2”項(xiàng)中關(guān)木通各種炮制品和購買的生品粉末分別過四號篩，分別精密稱取1 g，置于25 mL的容量瓶中。制成溶液，超聲，過濾。在波長315 nm處進(jìn)行梯度洗脫，流動相是甲醇和1%冰醋酸。冰醋酸的比例在15 min內(nèi)由50%降至5%。將測得的峰面積值代入“2.1.3”項(xiàng)的回歸方程中，計算馬兜鈴酸的濃度值，進(jìn)而計算其含量。由表1可知，醋炙和堿制的關(guān)木通藥材中馬兜鈴酸的含量較低，并在合格范圍內(nèi)，所以初步確定醋炙和堿制效果較佳。

表1 不同方法炮制的關(guān)木通中馬兜鈴酸含量測定結(jié)果

2.2 浸出物含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備

精密稱取藥材粉末1 g，置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇-1%甲酸水溶液約15 mL，兩者比例為4∶1。浸泡1 h后，超聲提取3次[11]，15 min/次。定容至25 mL，過微孔濾膜，收集續(xù)濾液，注入1 mL進(jìn)樣瓶中，即得，待用。

2.2.2 水浸出物的測定

使用分析天平精密稱取供試品4 g，溶解于250 mL錐形瓶中，加入適量的水（50～100 mL）。密塞，精密稱定重量并記錄。靜置冷卻至室溫后，連接回流裝置，并保持微沸1 h。放冷，將錐形瓶取下，密塞，稱量[12]，減失的重量須用蒸餾水補(bǔ)足，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，于105℃干燥箱中干燥3 h[13]，再于干燥器中冷卻30 min，迅速稱重，記錄數(shù)據(jù)。除非另有規(guī)定，供試品中水溶性浸出物的百分含量[14]以干燥品來計算。

2.2.3 乙醇浸出物的測定

按“2.2.2”項(xiàng)中水溶性浸出物測定法完成關(guān)木通藥材中乙醇浸出物的測定。各個操作項(xiàng)下的溶劑用規(guī)定濃度的乙醇替代水。由表2可知，醋炙品水浸出物與醇浸出物的含量相當(dāng)，相對于其他方法比較穩(wěn)定，可認(rèn)為醋炙為最佳方法。

表2 浸出物含量的測定結(jié)果（mg）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度的考察

精密量取“2.1.2”項(xiàng)下的對照品溶液，分別平行進(jìn)樣6次，每次的進(jìn)樣量為10μL[15]并記錄峰面積。峰面積的平均值為1 257 231，計算得RSD=1.726%（＜2%），符合規(guī)定。結(jié)果表明儀器精密度良好，結(jié)果準(zhǔn)確可信。

2.3.2 重復(fù)性的考察

取“1.3.2”項(xiàng)下姜炙關(guān)木通粉末，過三號篩[16]，電子分析天平精密稱取5份，分別依“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法進(jìn)行制備。測定含量，記錄峰面積，計算得峰面積的平均值為3 917 288，進(jìn)而計算出峰面積的RSD=0.2687%（＜2%），說明儀器重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以用于含量測定。

2.3.3 穩(wěn)定性的考察

使用分析天平量取“1.3.2”項(xiàng)下的堿制關(guān)木通粉末，過三號篩，精密稱取1份，依“2.2.1”項(xiàng)下的方法制成供試溶液。 將供試品放置 0、2、4、6、12、24 h 后，分別精密量取這6種樣品溶液10μL，分別進(jìn)樣[17]，記錄峰面積。峰面積的平均值為1 646 202，進(jìn)而計算RSD=1.12%（＜2%）。結(jié)果表明，供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，可用于含量測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3.4 回收率的考察

使用分析天平精密量取已知含量的關(guān)木通粉末，過三號篩后，精密稱取5份，每份各1 g，分別精密添加相應(yīng)量的對照品，制成溶液，測定含量，記錄，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果

3 討論

3.1 馬兜鈴酸的測定方法

由穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品溶液放置0 h后測定與放置24 h后測定的相對標(biāo)準(zhǔn)差在誤差允許的范圍內(nèi)，說明供試液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的，進(jìn)一步說明此結(jié)果具有可信度。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，馬兜鈴屬的植物都含有馬兜鈴酸。因其具有羧基，所以在流動相中加入冰醋酸，分離度會提高20%，峰形也會得到改善。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，樣品的重復(fù)性好，穩(wěn)定性好，可用于馬兜鈴酸的測定。本方法簡單、準(zhǔn)確、快捷，可作為藥材關(guān)木通中馬兜鈴酸的含量測定方法。

3.2 炮制方法的合理性

關(guān)木通具有堅實(shí)的臨床基礎(chǔ)。自古以來因其具有毒性，人們常將其與其他藥材配伍使用。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乜疾炝怂幉年P(guān)木通炮制前后馬兜鈴酸含量的變化。結(jié)果顯示，炮制后馬兜鈴酸的含量比炮制前明顯降低，進(jìn)一步說明通過炮制降低關(guān)木通毒性的合理性。

3.3 最佳炮制方法

從炮制品中馬兜鈴酸含量的測定結(jié)果可知，將醋炙法對馬兜鈴酸的脫除效果進(jìn)行分析，結(jié)果較為理想。同時，該方法對浸出物的含量幾乎沒有影響。綜合各實(shí)驗(yàn)結(jié)果可分析得出，最佳的炮制方法為醋炙。

3.4 本方法的優(yōu)點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，使用反相高效液相色譜法測定馬兜鈴屬藥材中馬兜鈴酸的含量及炮制品中馬兜鈴酸含量的方法合理、可行，而且具有準(zhǔn)確性和靈敏度高的特點(diǎn)。在分離過程中，選擇梯度洗脫的方法，可最大程度地縮短馬兜鈴酸的分離周期，提高分離效率。

3.5 本實(shí)驗(yàn)的不足

實(shí)驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，炮制時的溫度及時間也會極大程度地影響炮制后樣品中馬兜鈴酸的含量，還應(yīng)采用正交試驗(yàn)等多種方法對每種炮制方法的溫度、時間進(jìn)行更深層次的計算與驗(yàn)證，探究其他因素是否對馬兜鈴酸的含量也有較大影響。

[1]肖鳳霞，鄧少東，鄧超明，等.HPLC法測定土茯苓中3種活性成分的含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2011，27（6）：604-608.

[2]孫亞欣，肇麗梅，朱旭，等.RP-HPLC法測定人血漿和尿液中美羅培南濃度[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2011，27（6）：567-570.

[3]歐彩娟，柳文媛，吳玉蘭，等.RP-HPLC法同時測定虎杖提取物中4種組分含量[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報，2011，27（6）：609-612.

[4]唐云，束志凌，倪瑋燁.HPLC法測定痛可舒貼中馬兜鈴酸 A 的含量[J].藥學(xué)進(jìn)展，2010，34（1）：39-41.

[5]袁延強(qiáng)，劉可春，韓利文，等.HPLC法測定北蟲草中的蟲草素含量[J].中國食物與營養(yǎng)，2010，6（2）：61-63.

[6]陸步實(shí)，喬成，郭立瑋.HPLC法測定左金膠囊中4種生物堿的含量[J].藥學(xué)進(jìn)展，2010，34（6）：272-275.

[7]Li C，Xu F，Cao C，et al.Comparative analysisof two species of Asari Radix et Rhizoma by electronic nose，head-space GC-MSand chemometrics[J].JPharm Biomed Anal，2013，85：231-238.

[8]曾超，劉雪梅，蒙萬香，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地細(xì)辛藥材中馬兜鈴酸的含量[J].內(nèi)科，2013，8（1）：56-57.

[9]胡世林，張宏啟，陳金泉，等.關(guān)木通毒性的初步研究[J].中草藥，2006，37（3）：415-418.

[10]王智民，由麗雙，李琳，等.關(guān)木通生品及其制品的藥效學(xué)及毒理學(xué)研究[J].中國藥物與臨床，2006，6（10）：728-732.

[11]李春香，丁里玉，李國川，等.復(fù)方配伍減低關(guān)木通腎毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)雜志，47（9）：694-697.

[12]薛翔，任進(jìn).龍膽瀉肝丸、關(guān)木通、三葉木通及五葉木通的小鼠體內(nèi)毒性比較[J].毒理學(xué)雜志，2007，21（4）：302-303.

[13]路金才，韓娜，杜曉曦，等.馬兜鈴酸的測定方法現(xiàn)狀分析[J].中草藥，2006，37（7）：112-114.

[14]Gao HM，Wang ZM，Wang WH.A new triterpenoid saponin from the stem of Akebia trifoliate var.australis[J].JAsian Nat Prod Res，2009，11（12）：1013-1018.

[15]劉學(xué)湘，吳曉峰，潘揚(yáng)，等.高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法分析青木香及其發(fā)酵品中馬兜鈴酸類成分[J].中國天然藥物，2010，8（6）：456-460.

[16]Liu GY，Ma SC，Zheng JZ，et al.Two new triterpenoid saponins from Akebia Quinata（Thunb.）dence[J].J Integrat Plant Biol，2007，49（2）：196-201.

[17]Mimaki Y，Doi S，Kuroda M，et al.Triterpene Glycosides from the stems of Akebia Quinata[J].Chem Pharm Bull，2007，55（9）：1319-1323.