南海珊瑚內(nèi)生細(xì)菌Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)中環(huán)二肽類次生代謝產(chǎn)物研究*

鄧 蕓，胡谷平，陳小潔，劉炳新，代樹文，何細(xì)新，張翠仙

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006;2.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州510275)

海洋微生物由于其生存環(huán)境的特異性 (高鹽、高壓、低溫、無光照)激活了其某些沉默基因［1］，誘導(dǎo)其產(chǎn)生獨(dú)特的生物代謝途徑，致使其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異、具有顯著生理活性的次生代謝產(chǎn)物，為海洋藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供重要來源。在前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)珊瑚內(nèi)生細(xì)菌Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)使真菌生長延遲，甚至死亡，同時(shí)藥理活性研究表明該菌株具有較好的抗腫瘤活性［2］?；诖?，對(duì)B－2的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，通過柱層析(硅膠、ODS和 Sephadex LH－20等)和HPLC分離純化，得到8個(gè)單體化合物，經(jīng)過NMR和MS及物理常數(shù)對(duì)照確定其結(jié)果依次為:環(huán)(羥脯－苯丙)二肽(1)、環(huán)(脯－酪)二肽(2)、環(huán)(苯丙－甘)二肽(3)、環(huán)(苯丙－ 丙)二肽(4)、環(huán)(丙－酪)二肽(5)、環(huán)(亮－ 甘)二肽(6)、環(huán)(甘－ 纈)二肽(7)、環(huán)(丙－纈)二肽(8)。所有化合物均為環(huán)二肽類且首次從該菌株中分離得到。研究表明此類物質(zhì)具有抑菌、抗腫瘤，心腦血管系統(tǒng)及神經(jīng)保護(hù)、脫癮解毒等方面的重要生理活性［3］。

圖1 珊瑚內(nèi)生細(xì)菌Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)中的環(huán)二肽化合物1，2，3，4，5，6，7，8Fig.1 Chemical structures of compounds 1，2，3，4，5，6，7，8 from coral-derived bacteria Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

儀器:GZX－9070MBE恒溫培養(yǎng)箱 (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);超凈工作臺(tái) (蘇州凈化設(shè)備廠);ER－120A電子天平 (日本 A＆D公司);HH-ZK6水浴鍋 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);DZ－900振蕩器 (太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);LXB75L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 (合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司);HYG-A全溫?fù)u瓶柜 (江蘇常州三盛儀器制造有限公司)。AVANCE AV400超導(dǎo)核磁共振儀 (瑞士 Bruker公司);Varian INOVA500NB超導(dǎo)核磁共振儀 (美國Varian公司);VG ZABHS質(zhì)譜儀 (美國 Finnigan公司);Orbitrap Elite高分辨質(zhì)譜儀 (Thermo Scientific公司);LCQDE-CAXP高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國Finnigan公司);QuikSep制備型高效液相色譜儀(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)。

試劑:蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏 (BR，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司);葡萄糖 (CP，天津市大茂化學(xué)試劑廠);海鹽 (廣州市荔水族科技有限公司);石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司);柱層析硅膠 (200～300目，青島海洋化工廠)。

菌種:實(shí)驗(yàn)用微生物 Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)由海南大學(xué)謝珍玉教授提供，中國科學(xué)研究院南海海洋研究所張長生研究員進(jìn)行種屬鑒定，樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 B－2細(xì)菌活化與發(fā)酵

將B－2接種到裝有40 mL液體LB培養(yǎng)基(牛肉浸膏 w=3.0%、葡萄糖w=2.0%、酵母膏w=1.0%、蛋白胨w=0.05%、人工海水500 mL，加蒸餾水定容至1000 mL，pH=7.0)的100 mL三角瓶中，在28℃搖床中150 r/min培養(yǎng)2 d得種子培養(yǎng)液。吸取該種子液 (1.5 mL)于培養(yǎng)瓶中(每升加500 mL液體LB培養(yǎng)基)，28℃搖床培養(yǎng)7 d至菌株生長成熟，停止發(fā)酵 (共發(fā)酵培養(yǎng)200 L)。

1.3 提取分離

將菌液和菌體高速離心分離。發(fā)酵液濃縮至18 L，依次用等體積的乙酸乙酯 (EtOAc)、正丁醇 (n-BuOH)進(jìn)行萃取，減壓回收有機(jī)溶劑得到發(fā)酵液的EtOAc浸膏 (72.6 g)和n-BuOH浸膏(131 g)。菌體用甲醇浸泡提取3次 (每次浸1 d)，所得甲醇提取液減壓濃縮共得到浸膏69 g;該浸膏用水涅溶至1 L，依次用等量的EtOAc和n-BuOH進(jìn)行水分配萃取，減壓濃縮提取液，得到菌體的EtOAc浸膏12.8 g和n-BuOH浸膏22 g。經(jīng)TLC追蹤發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液與菌體的EtOAc二者成分相似，合并得EtOAc相浸膏 (85.4 g)。

EtOAc浸膏 (85.4 g)經(jīng)硅膠柱層析分離，以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=1∶0、9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、3∶7、3∶17、0∶1)洗脫，得到10個(gè)組分 (Fr1～Fr10)。其中Fr10(8.0 g)用硅膠柱層析以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、2∶3、1∶3、1∶5、0∶10)洗脫得到 6個(gè)流分(Fr10－1～ Fr10－6)。Fr10－2(1.0 g)用硅膠柱層析以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=17∶3、4∶1、3∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4、0∶1)洗脫得到8個(gè)組分(Fr10－2－1～Fr10－2－8)。Fr10－2－3(85 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88，t=9.041 s)分離純化，得到化合物8(10 mg);Fr10－5(2.0 g)用硅膠柱層析以 PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、1∶3、3∶17、0∶1)洗脫得到7個(gè)組分(Fr10－5－1～Fr10－5－7)。Fr10－5－2(105 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88，t=6.506、12.389、16.838、18.155、20.922、32.554 s)分離得到化合物 1(15 mg)、2(14 mg)、3(10 mg)、4(5 mg)、6(5 mg)、7(10 mg);Fr－10－6(0.8 g)用硅膠柱層析以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4、3∶17、0∶1)洗脫得到4個(gè)組分 (Fr10－6－1～Fr10－6－4)，其中 Fr10－6－2(75 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88，t=10.291 s)分離得到化合物5(5 mg)。

1.4 物理常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)

化合物1:白色粉末 (甲醇)，紫外燈254 nm下無暗斑，碘蒸氣顯棕黃色，分子式C14H16N2O3，1H NMR(400 MHz，MeOD-d4)δH:7.31 ～7.15(5H，m)，4.46(1H，d，4.2 Hz)，4.33(1H，dt，18.0，8.9 Hz)，4.26(1H，t，4.7 Hz)，3.75 ～3.60(1H，m)，3.21～3.08(1H，m)，3.19～3.08(2H，m)，2.05(1H，dd，13.1，5.9 Hz)，1.42～1.30(1H，m)。

化合物2:白色粉末 (甲醇)，紫外燈254 nm下有暗斑，碘蒸氣顯棕黃色，分子式C14H16N2O3，ESI-MS m/z:259 ［M－ H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:9.36(1H，d，3.1 Hz)，7.27(2H，d，8.3 Hz)，7.09(2H，d，8.3 Hz)，4.51(1H，dd，10.1，4.2 Hz)，3.66(1H，dt，11.6，8.5 Hz)，3.41(2H，ddd，17.2，10.1，4.9 Hz)，3.30(1H，dd，13.6，6.3 Hz)，3.16(1H，dd，13.6，4.2 Hz)，2.20～2.08(1H，m)，1.91～1.76(1H，m)，1.66～1.55(1H，m)，1.52～1.37(1H，m)。

化合物3:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色，分 子 式 C11H12N2O2，ESI-MS m/z:203［M－ H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:9.29(1H，s)，9.01(1H，s)，7.24～7.45(2H，m)，7.26～7.19(3H，m)，4.59(1H，m)，3.96(1H，dd，17.2，3.2 Hz)，3.50(1H，17.2 Hz)，3.45(1H，dd，13.2，5.6 Hz)，3.29(1H，dd，13.2，4.4 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)δC:168.4(C)，166.7(C)，136.9(C)，130.7(2 CH)，128.7(CH)，127.2(2 CH)，57.3(CH)，45.0(CH2)，40.8(CH2)。

化合物4:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色，分子式 C12H14N2O4，ESI-MS m/z:217［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:7.67(1H，d，7.6 Hz)，7.39(1H，d，8.0 Hz)，7.14(2H，t，7.6 Hz)，7.07(1H，t，6.8 Hz)，4.34(1H，t，5.2 Hz)，3.78(1H，dt，14.4，8.0 Hz)，3.52(1H，dd，10.8，4.0 Hz)，3.22(1H，dd，10.8，3.6 Hz)，0.45(3H，d，3.6 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)δC:170.7(C)，169.7(C)，129.3(C)，125.9(CH)，122.6(CH)，120.3(CH)，116.3(CH)，109.4(CH)，57.6(CH)，51.5(CH)，30.9(CH2)，20.2(CH3)。

化合物5:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色，分子式 C12H14N2O3，ESI-MS m/z:233［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:11.32(1H，br s)，9.10(1H，s)，9.07(1H，s)，7.40(2H，d，8.4 Hz)，7.10(2H，d，8.4 Hz)，4.60(1H，m)，4.20(1H，m)，3.51(1H，dd，16.0，5.2 Hz)，3.30(1H，dd，13.4，4.2 Hz)，1.30(3H，d，7.2 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)δC:169.8(C)，168.8(C)，154.5(C)，132.8(2 CH)，129.3(CH)，115.6(2 CH)，60.3(CH)，54.7(CH2)，37.4(CH2)，17.0(CH3)。

化合物6:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色，分子式 C8H14N2O2，ESI-MS m/z:169［M－H］－。1H NMR(400 MHz，MeOD-d4)δH:3.98(1H，d，17.8 Hz)，3.88(1H，s)，3.81(1H，d，17.8 Hz)，1.85－1.75(1H，m)，1.66(2H，m，4.1 Hz)，0.95(6H，t，6.9 Hz);13C NMR(100 MHz，MeOD-d4)δC:171.7(C)，169.1(C)，55.1(C)，45.5(CH)，44.0(CH2)，25.5(CH)，23.5(CH3)，22.3(CH3)。

化合物7:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色，分子式 C7H12N2O2，ESI-MS m/z:155［M－H］－。1H NMR(500 MHz，Pyr-d5)δH:9.13(1H，s)，8.98(1H，s)，4.29(1H，d，17.5 Hz)，4.18(1H，dd，17.5，2.4 Hz)，4.06(1H，t，3.1 Hz)，2.56－2.47(1H，m)，1.11(3H，d，7.0 Hz)，1.05(3H，d，6.8 Hz)。

化合物8:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色，分子式C8H14N2O2，ESI m/z:170。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:9.18(1H，d，4.8 Hz)，8.95(1H，s)，4.33(1H，s)，4.17(1H，m)，2.66(1H，m)，1.69(1H，d，6.8 Hz)，1.17(1H，d，6.8 Hz)，1.13(1H，d，7.2 Hz)。

2 結(jié)果與討論

1)化合物1:白色粉末 (甲醇)，紫外燈254 nm下無暗斑，碘蒸氣顯棕黃色。1H NMR(400 MHz，MeOD-d4)譜中δH7.31～7.15(5H，m)為1個(gè)單取代芳環(huán)上的氫信號(hào)，結(jié)合δH4.46(1H，d，4.2 Hz)、3.75～3.60(1H，m)、3.21～3.08(1H，m)，顯示有苯丙氨酸片段;δH4.33(1H，dt，18.0，8.9 Hz)為連有羥基的叔碳上的氫信號(hào)，結(jié)合 δH4.26(1H，t，4.7 Hz)、3.19～3.08(2H，m)、2.05(1H，dd，13.1，5.9 Hz)、1.42～1.30(1H，m)顯示含有羥脯氨酸片段。將1的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) cyclo(Hyp-Phe)數(shù)據(jù)對(duì)照［4］，基本一致。故確定1為cyclo(Hyp-Phe)，即環(huán) (羥脯－苯丙)二肽。

2)化合物2:白色粉末 (甲醇)，紫外燈254 nm下有暗斑，碘蒸氣顯棕黃色。ESI-MS m/z:259［M－H］－，相對(duì)分子質(zhì)量為260。1H NMR中 δH7.85(1H，s)為1個(gè)酰胺氮?dú)滟|(zhì)子信號(hào)，結(jié)合δH4.51(1H，dd，10.1，4.2 Hz)、3.66(1H，dt，11.6，8.5 Hz)2個(gè)叔碳上的氫信號(hào)。與1的NMR數(shù)據(jù)對(duì)照發(fā)現(xiàn)2含有比1少了1個(gè)連氧碳質(zhì)子，而增加了 δH3.30(1H，dd，13.6，6.3 Hz)、3.16(1H，dd，13.6，4.2 Hz)亞甲基信號(hào)，推斷2含有脯氨酸片段。將2的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Pro-Tyr)數(shù)據(jù)對(duì)照［5］，基本一致。故確定2為 cyclo(Pro-Tyr)，即環(huán) (脯－酪)二肽。

3)化合物3:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色。1H NMR譜中 δH9.29(1H，s)和 9.01(1H，s)為2個(gè)氮上的氫信號(hào)，同時(shí)13C NMR譜中δC168.4(C)、166.7(s)也證實(shí)結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)肽鍵，說明3可能是環(huán)二肽類化合物。7.24～7.45(2H，m)和7.26～7.19(3H，m)為典型單取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號(hào)，同時(shí) δC168.4(C)、136.9(C)、130.7(2CH)、128.7(2CH)、127.2(CH)碳信號(hào)提示3同樣含有苯丙氨酸片段;同時(shí)δH3.96(1H，dd，17.2，3.2 Hz)、3.50(1H，d，17.2 Hz)和δC166.7(C)、45.0(CH2)提示該化合物含甘氨酸片段。將3的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Phe-Gly)數(shù)據(jù)對(duì)照［6－7］，基本一致。故確定3為cyclo(Phe-Gly)，即環(huán) (苯丙－甘)二肽。

4)化合物4:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色。13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)譜中 δC170.7(C)、169.7(C)為兩個(gè)酰胺羰基碳信號(hào)，說明該化合物可能是環(huán)二肽類化合物。將4的NMR與3對(duì)照，發(fā)現(xiàn)低場質(zhì)子信息基本一致，故確定苯丙氨酸殘基存在。同時(shí) NMR δH3.78(1H，dt，14.4，8.0 Hz)和 0.45(3H，d，3.6 Hz)和 δC57.6(CH)和20.2(CH3)提示4含丙氨酸片段。將4的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Phe-Ala)數(shù)據(jù)對(duì)照［7－10］，基本一致。故確定4 為 cyclo(Phe-Ala)，即環(huán) (苯丙－丙)二肽。

5)化合物5:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)譜中 δH9.10(1H，s)和9.07(1H，s)為2個(gè)氮上的氫信號(hào)，同時(shí)13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)譜中 δC169.8(C)，168.8(C)為兩個(gè)酰胺羰基碳信號(hào)，說明其可能為環(huán)二肽類物質(zhì)。其NMR數(shù)據(jù)與2對(duì)比發(fā)現(xiàn)十分相似，均存在酪氨酸殘基。而δH4.20(1H，m)和1.30(3H，d，7.2 Hz)及 δC54.7(CH2)、17.0(CH3)說明結(jié)構(gòu)中還存在丙氨酸片段。將5的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Ala-Tyr)數(shù)據(jù)對(duì)照［11］，基本一致。故確定5為cyclo(Ala-Tyr)，即環(huán) (丙－酪)二肽。

6)化合物6:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色。ESI-MS m/z:169［M－H］－，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C8H14N2O2，不飽和度為3。1H NMR中 δH9.38(1H，br s)和9.16(1H，br s)為氮上的活潑氫信號(hào)，存在酰胺的活潑氫質(zhì)子信息，δH4.34(1H，d，15.2 Hz)和4.25(2H，m)為氮雜環(huán)中叔碳上的質(zhì)子信號(hào)，推測可能為環(huán)二肽類化合物。δH4.25(2H，m)的峰可知氨基酸片段中在六元環(huán)上含有亞甲基，推測可能含有甘氨酸片段。δH2.03(1H，m)和1.92(1H，m)為1個(gè)亞甲基上的2個(gè)質(zhì)子信號(hào)且化學(xué)環(huán)境不同，結(jié)合δH1.80(1H，m)和0.89(3H，q，6.4，4.0 Hz)，可推斷該化合物含異丙基片斷。將6的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Leu-Gly)數(shù)據(jù)對(duì)照［12］，基本一致。故確定6為cyclo(Leu-Gly)，即環(huán) (亮－甘)二肽。

7)化合物7:白色粉末 (甲醇)，碘蒸氣顯棕黃色。ESI-MS m/z:155［M－H］－，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C7H12N2O2，不飽和度為3。與6相比，其分子質(zhì)量相差14(一個(gè)CH2);且含有與61H NMR基本一致的甘氨酸片段信號(hào)。而δH1.11(3H，d，7.0 Hz，)和1.05(3H，d，6.8 Hz)為兩個(gè)相鄰的甲基信號(hào)，而2.56～2.47(1H，m)為一個(gè)支鏈上的叔碳信號(hào)，推斷可能含纈氨酸片段。將7的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Gly-Val)數(shù)據(jù)對(duì)照［13］，基本一致。故確定7為cyclo(Gly-Val)，即環(huán) (甘－纈)二肽。

8)化合物8:白色粉末 (甲醇)，香草醛濃硫酸不顯色，茚三酮顯色陰性。ESI m/z:170，與7相比相對(duì)分子質(zhì)量相差15(CH3);1H NMR數(shù)據(jù)與7對(duì)比顯示結(jié)構(gòu)中含有纈氨酸殘基。4.33(1H，s)、1.69(1H，d，6.8 Hz)顯示結(jié)構(gòu)中有丙氨酸殘基。將化合物的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Ala-Val)對(duì)照［14－16］，基本一致。確定8為cyclo(Ala-Val)，即環(huán) (丙－纈)二肽。

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