鄧 蕓,胡谷平,陳小潔,劉炳新,代樹文,何細(xì)新,張翠仙
(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州510006;2.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院,廣東廣州510275)
海洋微生物由于其生存環(huán)境的特異性 (高鹽、高壓、低溫、無光照)激活了其某些沉默基因[1],誘導(dǎo)其產(chǎn)生獨(dú)特的生物代謝途徑,致使其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)各異、具有顯著生理活性的次生代謝產(chǎn)物,為海洋藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供重要來源。在前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)珊瑚內(nèi)生細(xì)菌Pelomonas puraquae sp.nov(B-2)使真菌生長(zhǎng)延遲,甚至死亡,同時(shí)藥理活性研究表明該菌株具有較好的抗腫瘤活性[2]?;诖?,對(duì)B-2的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,通過柱層析(硅膠、ODS和 Sephadex LH-20等)和HPLC分離純化,得到8個(gè)單體化合物,經(jīng)過NMR和MS及物理常數(shù)對(duì)照確定其結(jié)果依次為:環(huán)(羥脯-苯丙)二肽(1)、環(huán)(脯-酪)二肽(2)、環(huán)(苯丙-甘)二肽(3)、環(huán)(苯丙- 丙)二肽(4)、環(huán)(丙-酪)二肽(5)、環(huán)(亮- 甘)二肽(6)、環(huán)(甘- 纈)二肽(7)、環(huán)(丙-纈)二肽(8)。所有化合物均為環(huán)二肽類且首次從該菌株中分離得到。研究表明此類物質(zhì)具有抑菌、抗腫瘤,心腦血管系統(tǒng)及神經(jīng)保護(hù)、脫癮解毒等方面的重要生理活性[3]。
圖1 珊瑚內(nèi)生細(xì)菌Pelomonas puraquae sp.nov(B-2)中的環(huán)二肽化合物1,2,3,4,5,6,7,8Fig.1 Chemical structures of compounds 1,2,3,4,5,6,7,8 from coral-derived bacteria Pelomonas puraquae sp.nov(B-2)
儀器:GZX-9070MBE恒溫培養(yǎng)箱 (上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);超凈工作臺(tái) (蘇州凈化設(shè)備廠);ER-120A電子天平 (日本 A&D公司);HH-ZK6水浴鍋 (鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);DZ-900振蕩器 (太倉(cāng)市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);LXB75L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 (合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司);HYG-A全溫?fù)u瓶柜 (江蘇常州三盛儀器制造有限公司)。AVANCE AV400超導(dǎo)核磁共振儀 (瑞士 Bruker公司);Varian INOVA500NB超導(dǎo)核磁共振儀 (美國(guó)Varian公司);VG ZABHS質(zhì)譜儀 (美國(guó) Finnigan公司);Orbitrap Elite高分辨質(zhì)譜儀 (Thermo Scientific公司);LCQDE-CAXP高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó)Finnigan公司);QuikSep制備型高效液相色譜儀(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)。
試劑:蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏 (BR,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司);葡萄糖 (CP,天津市大茂化學(xué)試劑廠);海鹽 (廣州市荔水族科技有限公司);石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(AR,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);柱層析硅膠 (200~300目,青島海洋化工廠)。
菌種:實(shí)驗(yàn)用微生物 Pelomonas puraquae sp.nov(B-2)由海南大學(xué)謝珍玉教授提供,中國(guó)科學(xué)研究院南海海洋研究所張長(zhǎng)生研究員進(jìn)行種屬鑒定,樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋微生物實(shí)驗(yàn)室。
將B-2接種到裝有40 mL液體LB培養(yǎng)基(牛肉浸膏 w=3.0%、葡萄糖w=2.0%、酵母膏w=1.0%、蛋白胨w=0.05%、人工海水500 mL,加蒸餾水定容至1000 mL,pH=7.0)的100 mL三角瓶中,在28℃搖床中150 r/min培養(yǎng)2 d得種子培養(yǎng)液。吸取該種子液 (1.5 mL)于培養(yǎng)瓶中(每升加500 mL液體LB培養(yǎng)基),28℃搖床培養(yǎng)7 d至菌株生長(zhǎng)成熟,停止發(fā)酵 (共發(fā)酵培養(yǎng)200 L)。
將菌液和菌體高速離心分離。發(fā)酵液濃縮至18 L,依次用等體積的乙酸乙酯 (EtOAc)、正丁醇 (n-BuOH)進(jìn)行萃取,減壓回收有機(jī)溶劑得到發(fā)酵液的EtOAc浸膏 (72.6 g)和n-BuOH浸膏(131 g)。菌體用甲醇浸泡提取3次 (每次浸1 d),所得甲醇提取液減壓濃縮共得到浸膏69 g;該浸膏用水涅溶至1 L,依次用等量的EtOAc和n-BuOH進(jìn)行水分配萃取,減壓濃縮提取液,得到菌體的EtOAc浸膏12.8 g和n-BuOH浸膏22 g。經(jīng)TLC追蹤發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液與菌體的EtOAc二者成分相似,合并得EtOAc相浸膏 (85.4 g)。
EtOAc浸膏 (85.4 g)經(jīng)硅膠柱層析分離,以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=1∶0、9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、3∶7、3∶17、0∶1)洗脫,得到10個(gè)組分 (Fr1~Fr10)。其中Fr10(8.0 g)用硅膠柱層析以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、2∶3、1∶3、1∶5、0∶10)洗脫得到 6個(gè)流分(Fr10-1~ Fr10-6)。Fr10-2(1.0 g)用硅膠柱層析以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=17∶3、4∶1、3∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4、0∶1)洗脫得到8個(gè)組分(Fr10-2-1~Fr10-2-8)。Fr10-2-3(85 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88,t=9.041 s)分離純化,得到化合物8(10 mg);Fr10-5(2.0 g)用硅膠柱層析以 PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、1∶3、3∶17、0∶1)洗脫得到7個(gè)組分(Fr10-5-1~Fr10-5-7)。Fr10-5-2(105 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88,t=6.506、12.389、16.838、18.155、20.922、32.554 s)分離得到化合物 1(15 mg)、2(14 mg)、3(10 mg)、4(5 mg)、6(5 mg)、7(10 mg);Fr-10-6(0.8 g)用硅膠柱層析以PE/EtOAc體系(V(PE)/V(EtOAc)=4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4、3∶17、0∶1)洗脫得到4個(gè)組分 (Fr10-6-1~Fr10-6-4),其中 Fr10-6-2(75 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88,t=10.291 s)分離得到化合物5(5 mg)。
化合物1:白色粉末 (甲醇),紫外燈254 nm下無暗斑,碘蒸氣顯棕黃色,分子式C14H16N2O3,1H NMR(400 MHz,MeOD-d4)δH:7.31 ~7.15(5H,m),4.46(1H,d,4.2 Hz),4.33(1H,dt,18.0,8.9 Hz),4.26(1H,t,4.7 Hz),3.75 ~3.60(1H,m),3.21~3.08(1H,m),3.19~3.08(2H,m),2.05(1H,dd,13.1,5.9 Hz),1.42~1.30(1H,m)。
化合物2:白色粉末 (甲醇),紫外燈254 nm下有暗斑,碘蒸氣顯棕黃色,分子式C14H16N2O3,ESI-MS m/z:259 [M- H]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:9.36(1H,d,3.1 Hz),7.27(2H,d,8.3 Hz),7.09(2H,d,8.3 Hz),4.51(1H,dd,10.1,4.2 Hz),3.66(1H,dt,11.6,8.5 Hz),3.41(2H,ddd,17.2,10.1,4.9 Hz),3.30(1H,dd,13.6,6.3 Hz),3.16(1H,dd,13.6,4.2 Hz),2.20~2.08(1H,m),1.91~1.76(1H,m),1.66~1.55(1H,m),1.52~1.37(1H,m)。
化合物3:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色,分 子 式 C11H12N2O2,ESI-MS m/z:203[M- H]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:9.29(1H,s),9.01(1H,s),7.24~7.45(2H,m),7.26~7.19(3H,m),4.59(1H,m),3.96(1H,dd,17.2,3.2 Hz),3.50(1H,17.2 Hz),3.45(1H,dd,13.2,5.6 Hz),3.29(1H,dd,13.2,4.4 Hz);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC:168.4(C),166.7(C),136.9(C),130.7(2 CH),128.7(CH),127.2(2 CH),57.3(CH),45.0(CH2),40.8(CH2)。
化合物4:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色,分子式 C12H14N2O4,ESI-MS m/z:217[M-H]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:7.67(1H,d,7.6 Hz),7.39(1H,d,8.0 Hz),7.14(2H,t,7.6 Hz),7.07(1H,t,6.8 Hz),4.34(1H,t,5.2 Hz),3.78(1H,dt,14.4,8.0 Hz),3.52(1H,dd,10.8,4.0 Hz),3.22(1H,dd,10.8,3.6 Hz),0.45(3H,d,3.6 Hz);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC:170.7(C),169.7(C),129.3(C),125.9(CH),122.6(CH),120.3(CH),116.3(CH),109.4(CH),57.6(CH),51.5(CH),30.9(CH2),20.2(CH3)。
化合物5:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色,分子式 C12H14N2O3,ESI-MS m/z:233[M-H]-。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:11.32(1H,br s),9.10(1H,s),9.07(1H,s),7.40(2H,d,8.4 Hz),7.10(2H,d,8.4 Hz),4.60(1H,m),4.20(1H,m),3.51(1H,dd,16.0,5.2 Hz),3.30(1H,dd,13.4,4.2 Hz),1.30(3H,d,7.2 Hz);13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)δC:169.8(C),168.8(C),154.5(C),132.8(2 CH),129.3(CH),115.6(2 CH),60.3(CH),54.7(CH2),37.4(CH2),17.0(CH3)。
化合物6:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色,分子式 C8H14N2O2,ESI-MS m/z:169[M-H]-。1H NMR(400 MHz,MeOD-d4)δH:3.98(1H,d,17.8 Hz),3.88(1H,s),3.81(1H,d,17.8 Hz),1.85-1.75(1H,m),1.66(2H,m,4.1 Hz),0.95(6H,t,6.9 Hz);13C NMR(100 MHz,MeOD-d4)δC:171.7(C),169.1(C),55.1(C),45.5(CH),44.0(CH2),25.5(CH),23.5(CH3),22.3(CH3)。
化合物7:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色,分子式 C7H12N2O2,ESI-MS m/z:155[M-H]-。1H NMR(500 MHz,Pyr-d5)δH:9.13(1H,s),8.98(1H,s),4.29(1H,d,17.5 Hz),4.18(1H,dd,17.5,2.4 Hz),4.06(1H,t,3.1 Hz),2.56-2.47(1H,m),1.11(3H,d,7.0 Hz),1.05(3H,d,6.8 Hz)。
化合物8:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色,分子式C8H14N2O2,ESI m/z:170。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)δH:9.18(1H,d,4.8 Hz),8.95(1H,s),4.33(1H,s),4.17(1H,m),2.66(1H,m),1.69(1H,d,6.8 Hz),1.17(1H,d,6.8 Hz),1.13(1H,d,7.2 Hz)。
1)化合物1:白色粉末 (甲醇),紫外燈254 nm下無暗斑,碘蒸氣顯棕黃色。1H NMR(400 MHz,MeOD-d4)譜中δH7.31~7.15(5H,m)為1個(gè)單取代芳環(huán)上的氫信號(hào),結(jié)合δH4.46(1H,d,4.2 Hz)、3.75~3.60(1H,m)、3.21~3.08(1H,m),顯示有苯丙氨酸片段;δH4.33(1H,dt,18.0,8.9 Hz)為連有羥基的叔碳上的氫信號(hào),結(jié)合 δH4.26(1H,t,4.7 Hz)、3.19~3.08(2H,m)、2.05(1H,dd,13.1,5.9 Hz)、1.42~1.30(1H,m)顯示含有羥脯氨酸片段。將1的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) cyclo(Hyp-Phe)數(shù)據(jù)對(duì)照[4],基本一致。故確定1為cyclo(Hyp-Phe),即環(huán) (羥脯-苯丙)二肽。
2)化合物2:白色粉末 (甲醇),紫外燈254 nm下有暗斑,碘蒸氣顯棕黃色。ESI-MS m/z:259[M-H]-,相對(duì)分子質(zhì)量為260。1H NMR中 δH7.85(1H,s)為1個(gè)酰胺氮?dú)滟|(zhì)子信號(hào),結(jié)合δH4.51(1H,dd,10.1,4.2 Hz)、3.66(1H,dt,11.6,8.5 Hz)2個(gè)叔碳上的氫信號(hào)。與1的NMR數(shù)據(jù)對(duì)照發(fā)現(xiàn)2含有比1少了1個(gè)連氧碳質(zhì)子,而增加了 δH3.30(1H,dd,13.6,6.3 Hz)、3.16(1H,dd,13.6,4.2 Hz)亞甲基信號(hào),推斷2含有脯氨酸片段。將2的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Pro-Tyr)數(shù)據(jù)對(duì)照[5],基本一致。故確定2為 cyclo(Pro-Tyr),即環(huán) (脯-酪)二肽。
3)化合物3:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色。1H NMR譜中 δH9.29(1H,s)和 9.01(1H,s)為2個(gè)氮上的氫信號(hào),同時(shí)13C NMR譜中δC168.4(C)、166.7(s)也證實(shí)結(jié)構(gòu)中存在兩個(gè)肽鍵,說明3可能是環(huán)二肽類化合物。7.24~7.45(2H,m)和7.26~7.19(3H,m)為典型單取代芳環(huán)上的質(zhì)子信號(hào),同時(shí) δC168.4(C)、136.9(C)、130.7(2CH)、128.7(2CH)、127.2(CH)碳信號(hào)提示3同樣含有苯丙氨酸片段;同時(shí)δH3.96(1H,dd,17.2,3.2 Hz)、3.50(1H,d,17.2 Hz)和δC166.7(C)、45.0(CH2)提示該化合物含甘氨酸片段。將3的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Phe-Gly)數(shù)據(jù)對(duì)照[6-7],基本一致。故確定3為cyclo(Phe-Gly),即環(huán) (苯丙-甘)二肽。
4)化合物4:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色。13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)譜中 δC170.7(C)、169.7(C)為兩個(gè)酰胺羰基碳信號(hào),說明該化合物可能是環(huán)二肽類化合物。將4的NMR與3對(duì)照,發(fā)現(xiàn)低場(chǎng)質(zhì)子信息基本一致,故確定苯丙氨酸殘基存在。同時(shí) NMR δH3.78(1H,dt,14.4,8.0 Hz)和 0.45(3H,d,3.6 Hz)和 δC57.6(CH)和20.2(CH3)提示4含丙氨酸片段。將4的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Phe-Ala)數(shù)據(jù)對(duì)照[7-10],基本一致。故確定4 為 cyclo(Phe-Ala),即環(huán) (苯丙-丙)二肽。
5)化合物5:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色。1H NMR(400 MHz,Pyr-d5)譜中 δH9.10(1H,s)和9.07(1H,s)為2個(gè)氮上的氫信號(hào),同時(shí)13C NMR(100 MHz,Pyr-d5)譜中 δC169.8(C),168.8(C)為兩個(gè)酰胺羰基碳信號(hào),說明其可能為環(huán)二肽類物質(zhì)。其NMR數(shù)據(jù)與2對(duì)比發(fā)現(xiàn)十分相似,均存在酪氨酸殘基。而δH4.20(1H,m)和1.30(3H,d,7.2 Hz)及 δC54.7(CH2)、17.0(CH3)說明結(jié)構(gòu)中還存在丙氨酸片段。將5的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Ala-Tyr)數(shù)據(jù)對(duì)照[11],基本一致。故確定5為cyclo(Ala-Tyr),即環(huán) (丙-酪)二肽。
6)化合物6:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色。ESI-MS m/z:169[M-H]-,結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C8H14N2O2,不飽和度為3。1H NMR中 δH9.38(1H,br s)和9.16(1H,br s)為氮上的活潑氫信號(hào),存在酰胺的活潑氫質(zhì)子信息,δH4.34(1H,d,15.2 Hz)和4.25(2H,m)為氮雜環(huán)中叔碳上的質(zhì)子信號(hào),推測(cè)可能為環(huán)二肽類化合物。δH4.25(2H,m)的峰可知氨基酸片段中在六元環(huán)上含有亞甲基,推測(cè)可能含有甘氨酸片段。δH2.03(1H,m)和1.92(1H,m)為1個(gè)亞甲基上的2個(gè)質(zhì)子信號(hào)且化學(xué)環(huán)境不同,結(jié)合δH1.80(1H,m)和0.89(3H,q,6.4,4.0 Hz),可推斷該化合物含異丙基片斷。將6的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Leu-Gly)數(shù)據(jù)對(duì)照[12],基本一致。故確定6為cyclo(Leu-Gly),即環(huán) (亮-甘)二肽。
7)化合物7:白色粉末 (甲醇),碘蒸氣顯棕黃色。ESI-MS m/z:155[M-H]-,結(jié)合NMR數(shù)據(jù)推斷其分子式為C7H12N2O2,不飽和度為3。與6相比,其分子質(zhì)量相差14(一個(gè)CH2);且含有與61H NMR基本一致的甘氨酸片段信號(hào)。而δH1.11(3H,d,7.0 Hz,)和1.05(3H,d,6.8 Hz)為兩個(gè)相鄰的甲基信號(hào),而2.56~2.47(1H,m)為一個(gè)支鏈上的叔碳信號(hào),推斷可能含纈氨酸片段。將7的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Gly-Val)數(shù)據(jù)對(duì)照[13],基本一致。故確定7為cyclo(Gly-Val),即環(huán) (甘-纈)二肽。
8)化合物8:白色粉末 (甲醇),香草醛濃硫酸不顯色,茚三酮顯色陰性。ESI m/z:170,與7相比相對(duì)分子質(zhì)量相差15(CH3);1H NMR數(shù)據(jù)與7對(duì)比顯示結(jié)構(gòu)中含有纈氨酸殘基。4.33(1H,s)、1.69(1H,d,6.8 Hz)顯示結(jié)構(gòu)中有丙氨酸殘基。將化合物的NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)cyclo(Ala-Val)對(duì)照[14-16],基本一致。確定8為cyclo(Ala-Val),即環(huán) (丙-纈)二肽。
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