響應(yīng)面Box—Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲提取桑椹多酚條件

韋麗文 陳振建

【摘要】 目的：利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲提取桑椹多酚工藝條件。方法：選擇乙醇濃度、桑椹粉碎度、料液比、提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素考察，在此基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)影響較大的單因素進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析，以確定最佳提取條件。結(jié)果：桑椹多酚類化合物的最佳提取工藝為乙醇濃度為44.6%、桑椹粉碎度為120目、料液比為1∶34（g/ml）。結(jié)論：響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)能優(yōu)化超聲提取桑椹多酚提取條件，提高桑椹多酚提取得率。

【關(guān)鍵詞】 響應(yīng)面法；Box-Behnken設(shè)計(jì)；超聲提取；桑椹多酚

【中圖分類號(hào)】R284.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2015）10-0025-03

Optimization of the parameters on extraction of Polyphenol from Mori Fructus with ultrasonic wave technology by Box-Behnken design-response surface method

WEI Liwen1CHEN Zhenjian2

1.Guangxi university of Chinese medicine，Guangxi Nanning 530001；2. The pepole′s hospital of Guangxi Lingshan county，Guangxi Lingshan 535400

Abstract：Objective To optimize ultrasonic extraction technology process conditions of polyphenol from Mori Fructus by the response surface method. Method Base on ethanol concentration， comminution degree， the liquid-solid ratio， ultrasonic time of single factor experiment， the BoxBehnken design for 3 star factor 3 level response surface methodology was applied， to ascertain the best extraction condition. Results The ethanol concentration of 44.6%， comminution degree of 120 section and liquid-solid ratio of 34.1∶1 were selected as the optimum conditions. Conclusion Box-Behnken design of response surface methodology was applied to optimize ultrasonic extraction technology process conditions of polyphenol from Mori Fructus

Keywords：the response surface method；Box-Behnken；ultrasonic extraction； polyphenol of Mori Fructus

桑椹Mori Fructus為桑科植物桑（Morus alba L.）的果實(shí)，為藥食兩用之佳品，具有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥的功效，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、心悸失眠、須發(fā)早白、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘[1]?！侗静菥V目》記載“椹有烏、白二種”?！端臅r(shí)月令》云“四月宜飲桑椹酒，能理百種風(fēng)熱。”《本草新編》有云“四月采桑椹數(shù)斗，飯鍋蒸熟曬干即可為末”。多酚廣泛存在于植物體中，也是桑椹中的主要成分，其主要包括黃酮類、棓酸類及黃烷醇類等，具有抗氧化、抗菌、防癌抗癌等作用[2-4]。超聲廣泛用于有效成分提取，其可加速成分進(jìn)入溶劑，保持被浸提的生物活性物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)保持不變，極大提高提取效率[5]。Box-Behnken設(shè)計(jì)是用來評(píng)價(jià)因素指標(biāo)和因素間非線性關(guān)系的一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，具有試驗(yàn)次數(shù)相對(duì)較少，評(píng)價(jià)準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于中藥有效成分的提取條件優(yōu)化。本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲提取桑椹多酚條件，為今后桑椹多酚資源更好地利用墊定了基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；島津UV-1800紫外分光光度計(jì)；Elmasonic P300H超聲清洗器；梅特勒-托利多電子分析天平。

1.2試劑與材料桑椹采于廣西蠶業(yè)推廣總站，經(jīng)廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站朱方容研究院鑒定為桑科植物廣東桑Morus atropurpurea Roxb.的果穗。沒食子酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）、乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、Na2CO3（天津博迪化工股份有限公司）、福林酚試劑（上海荔達(dá)生物科技有限公司）均為分析純。

2方法

2.1桑椹藥材處理將采回的桑椹用沸水蒸1min后置于鼓風(fēng)干燥箱，55℃烘干，打粉，過篩。

2.2桑椹多酚測(cè)定方法桑椹多酚測(cè)定方法參照李巨秀[6]多酚測(cè)定方法，在此基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)。

2.2.1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定為0.0020g，用純水溶解并定溶于100ml容量瓶，得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20mg/L的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液。

2.2.2最佳測(cè)定波長(zhǎng)的確定用移液槍吸取1.0ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和桑椹多酚提取液分別置于10ml的容量瓶中，分別加入1mol/l 福林酚試劑1ml，混勻，加入2ml質(zhì)量濃度為0.15g/ml Na2CO3溶液，充分混勻后定容，室溫避光放置80min后進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)（200～800）光譜掃描，并設(shè)試劑空白對(duì)照，最終確定760nm為最大吸收波長(zhǎng)。

2.2.3沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml于10ml容量瓶中，分別加入1mol/l 福林酚試劑1ml，混勻，再加入0.15g/ml Na2CO3溶液2ml，充分混勻后定容，配成0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L沒食子酸樣品溶液，室溫避光放置80min。以不加標(biāo)準(zhǔn)液的溶液為空白對(duì)照，在760nm處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.0953X+0.0675（r=0.9989），表明在2～12mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

2.3超聲提取單因素實(shí)驗(yàn)選取乙醇溶度、桑椹粉碎度、料液比、超聲時(shí)間4個(gè)因素作單因素實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行超聲提取后取1ml粗提液用2.2下方法測(cè)其吸光度，帶入回歸方程中計(jì)算多酚濃度（mg/l），從而得到多酚提取質(zhì)量。

2.4Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取對(duì)桑椹多酚提取率影響較大的乙醇濃度（%）、桑椹粉碎度（目）、料液比（g/ml）三個(gè)因素三水平為自變量進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。多酚提取質(zhì)量（mg）為因變量，選取的三因素分別編碼為乙醇濃度A、粉碎度B、料液比C，三水平分別用-1、0、1表示，編碼因素及水平見表1。

表1Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表

編碼因素

水平

-101

A乙醇濃度/ %405060

B粉碎度/目80100120

C料液比1∶20 1∶301∶40

3結(jié)果與分析

3.1單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1乙醇濃度對(duì)多酚提取質(zhì)量的影響稱取桑椹粉末0.25g于50ml具塞三角瓶中，分別加入濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液10ml，超聲提取30min，提取溫度60℃，4000r離心，取上清液，測(cè)多酚含量。結(jié)果桑椹多酚提取質(zhì)量隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)多酚提取質(zhì)量達(dá)到最高，因此最佳的乙醇濃度為40%，如圖1所示。但考慮到有機(jī)溶劑對(duì)多酚提取能起到氫鍵斷裂作用（有機(jī)溶劑所占比例最佳為50%～70%）[7]。因此選取40%、50%、60%，三水平再做響應(yīng)面分析。

3.1.2粉碎度對(duì)多酚提取質(zhì)量的影響分別稱取過3號(hào)50目、4號(hào)65目、5號(hào)80目、6號(hào)100目、7號(hào)120目篩的桑椹粉末0.25g于50ml具塞三角瓶中，加入50%乙醇10ml，超聲提取30min，提取溫度60℃度，4000r離心，取上清液，測(cè)定多酚含量，結(jié)果桑椹多酚的提取質(zhì)量隨著桑椹粉碎度的增加而增加，在粉碎達(dá)到120目時(shí)，多酚提取質(zhì)量達(dá)到最大，因此最佳粉碎度為120目，如圖2所示。

3.1.3料液比對(duì)多酚提取質(zhì)量的影響稱取過120目篩的桑椹粉末0.5g于50ml具塞三角瓶中，以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50分別加入50%乙醇5、10、15、20、25ml，超聲提取30min，提取溫度60℃，4000r離心，取上清液，測(cè)多酚含量，結(jié)果桑椹多酚提取質(zhì)量隨著料液比的增大而增大，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，多酚提取質(zhì)量達(dá)到最大，因此最佳料液比為1∶40，如圖3所示。

3.1.4超聲提取時(shí)間對(duì)多酚提取質(zhì)量的影響稱取過120目篩的桑椹粉末0.25g，共6份于50ml具塞三角瓶中，各加入50%乙醇15ml，分別提取10、20、30、40、50、60、70min，提取溫度60℃，4000r離心，去上清液，測(cè)多酚含量。結(jié)果多酚提取質(zhì)量與提取時(shí)間無明顯線性關(guān)系，提取時(shí)間為20min時(shí)，提取多酚質(zhì)量最多，與30、50min提取時(shí)間相當(dāng)，如圖4所示。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可確定桑椹多酚提取的最佳單因素條件為：乙濃度40%，桑椹粉碎度為120目，料液比1∶40，超聲時(shí)間20min。

3.2響應(yīng)面試驗(yàn)與分析響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2.

3.2.1多元二次回歸模型的建立利用Design-Expert8.5.0 軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得超聲提取桑椹多酚質(zhì)量（Y）對(duì)乙醇濃度（A）、桑椹粉碎度（B）、料液比（C）的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：Y=14.07-0.63A+1.67B+0.49C-0.77AB-1.29A2-0.59C2。

式中Y為多酚提取質(zhì)量（mg），A為乙醇濃度（%），B為粉碎度（目），C為料液比（g/ml）。AB為乙醇濃度和粉碎度的交互項(xiàng)，A2為乙醇濃度的二次項(xiàng)，C2為料液比的二次項(xiàng)。

表2Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCY（mg）

1-1-1011.397

21-1010.885

3-11016.427

411012.825

5-10-111.535

610-111.715

7-10113.08

810111.963

90-1-111.668

1001-114.448

110-1112.33

1201115.9

1300014.337

1400013.34

1500014.24

1600013.945

1700014.04

表3Box-Behnken設(shè)計(jì)回歸方程方差分析表

方差來源平方和自由度均方差F值P值顯著性

總模型38.5966.4323.9<0.0001**

A3.1913.1911.850.0063**

B22.18122.1882.41<0.0001**

C1.9111.917.090.0238*

AB2.3912.398.870.0138*

A27.0717.0726.280.0004**

C21.4811.485.480.0412*

殘差2.69100.27

失擬項(xiàng)2.0860.352.280.2227

純誤差0.6140.15

總變異41.2916

注：**P<0.01，*P<0.05。

利用Design-Expert8.0.61軟件的ANOVA分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，回歸方程中各自變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)來判定，P值中，P ≤0.01的項(xiàng)，對(duì)Y影響極為顯著；P ≤0.05的項(xiàng)，對(duì)Y影響顯著；P>0.05的項(xiàng)，對(duì)Y影響不顯著，一般將該項(xiàng)剔除。模型項(xiàng)P ≤0.05說明Y與A、B、C回歸方程的關(guān)系是顯著的；P ≤0.01說明Y與A、B、C回歸方程的關(guān)系是極顯著的；P>0.05說明Y與A、B、C回方程的關(guān)系是不顯著的。失擬項(xiàng)的P>0.05，說明方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例小，方程表示Y與A、B、C的關(guān)系好。

由表3可以看出，該回歸方程模型的P<0.0001，說明該回歸方程具有極顯著性，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠；失擬項(xiàng)P=0.2227>0.05，說明回歸方程模型失擬不顯著；乙醇濃度（A）一次相及其二次項(xiàng)、粉碎度（B）一次相的P<0.01具有極顯著性。而料液比（C）一次相及其二次項(xiàng)，乙醇濃度和粉碎度的交互項(xiàng)的P<0.05，具有顯著性。從分析結(jié)果可知，對(duì)Y值的影響大小順序?yàn)椋悍鬯槎龋˙）>乙醇濃度（A）>料液比（C）。

3.2.2效應(yīng)面分析由3.2.1分析可知，只有AB交互項(xiàng)具有顯著性，通過Design-ExPert8.0.61軟件分析可以得出AB兩個(gè)因素交互影響超聲提取桑椹多酚的響應(yīng)曲面和等高線圖，直觀的反映AB因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，如圖2所示，B因素為粉碎度，隨著粉碎度的增加，響應(yīng)面的平面最高，且達(dá)到最大值，而在A因素（乙醇濃度）的影響下，隨著乙醇濃度的增大，響應(yīng)值先增大后減小，則當(dāng)粉碎度取實(shí)驗(yàn)最大值，乙醇濃度取實(shí)驗(yàn)中間值時(shí)，響應(yīng)值（桑椹多酚提取質(zhì)量）最大，如圖5所示。

3.3驗(yàn)證試驗(yàn)以上述響應(yīng)面優(yōu)化條件，取乙醇濃度45%，桑椹粉碎度120目，料液比1∶34，進(jìn)行超聲提取桑椹多酚，進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果為桑椹多酚平均提取質(zhì)量為16.18mg，與預(yù)測(cè)值16.43mg極為相近。

4結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究超聲提取桑椹多酚的提取工藝條件，運(yùn)用Design-Expert8.0.61軟件的Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，優(yōu)化結(jié)果表明，乙醇濃度、粉碎度對(duì)桑椹多酚提取質(zhì)量的影響有極顯著性，料液比對(duì)桑椹多酚提取質(zhì)量的影響有顯著性。最優(yōu)提取條件為乙醇濃度A為44.6%、粉碎度為120目、料液比為1∶34，多酚提取質(zhì)量達(dá)到最大，其預(yù)測(cè)值為16.43mg。以響應(yīng)面的優(yōu)化條件進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)，桑椹多酚提取質(zhì)量為16.18mg，與預(yù)測(cè)最高值極為相近，說明該回歸方程模型有效，優(yōu)化條件切實(shí)可行。響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)可以用于有效成分的提取條件優(yōu)化，通過回歸方程的建立，得出確切的優(yōu)化值，并通過實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，有效提高有效成分的提取率，為桑椹多酚資源的利用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015.04.03）