運動對急性暴露于2,3,7,8-四氯二苯并二惡英大鼠肝組織酶活性的影響

閆會萍，張弛，杜樂，宋小波，丁孝民，魏東洋，許振成，陸一帆,*

1. 北京體育大學運動康復系，北京 100084 2. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所，廣州 510655

運動對急性暴露于2,3,7,8-四氯二苯并二惡英大鼠肝組織酶活性的影響

閆會萍1，張弛1，杜樂1，宋小波1，丁孝民1，魏東洋2，許振成2，陸一帆1,*

1. 北京體育大學運動康復系，北京 100084 2. 環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所，廣州 510655

為了研究運動對2,3,7,8-四氯二苯并二惡英(2,3,7,8-TCDD)急性暴露大鼠肝組織酶活性的影響，將40只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC)、染毒組(NT)、運動對照組(EC)、運動染毒組(ET)。染毒組(NT組與ET組)腹腔注射10 μg·kg-1(以單位體重計)的TCDD，對照組(NC組與EC組)腹腔注射等量的玉米油；NT、NC組靜養(yǎng)4周，ET、EC組運動(尾部負重5%游泳30分鐘) 4周。4周后，稱重并宰殺大鼠，分離肝組織，稱重后-80 ℃保存待測7-乙氧基異吩惡唑酮脫乙基酶(EROD)、7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)及芳香烴羥化酶(AHH)的活性。將數(shù)據(jù)進行多因素方差分析(MAVONA)處理，結果表明，染毒可降低大鼠體重，增加肝濕重和肝相對重量、增加EROD、ECOD活性；運動可增加大鼠肝相對重量、增加AHH的活性；染毒后運動可降低EROD、ECOD的活性。結論：急性10 μg·kg-1(以單位體重計)TCDD染毒后4周可增加大鼠肝相對重量；4周的運動能有效降低TCDD對EROD、ECOD活性的激活作用。

2,3,7,8-四氯二苯并二惡英(2,3,7,8-TCDD)；大鼠；肝毒性；肝微粒體酶；運動

二惡英類化合物(doxin-like compounds, DLC)作為各類工業(yè)過程、被污染的氣體、水及土壤的副產(chǎn)品，難降解，卻易聚集于動物食物鏈和人體中，對機體危害大[1-3]；肝臟是較早大量接觸二惡英類化合物的臟器，也是最主要的毒性靶器官。二惡英類化合物中，2,3,7,8-TCDD毒性最強，因其非致癌風險比致癌毒性對人體健康危害的風險更大而被廣泛關注[4]。

運動對機體最根本的作用就是使其產(chǎn)生適應的過程。規(guī)律的有氧運動能使機體產(chǎn)生良好的適應，有益于身心健康，被國際運動醫(yī)學會推薦為最佳的健身運動[5]。美國運動醫(yī)學學會(ACSM)于近年來首先倡導并提出了“運動即良醫(yī)(exercise is medicine)”。目前，運動已經(jīng)成為一種醫(yī)療模式，成為預防或治療疾病的一種全新途徑。

如何從不同的視角來預防和控制二惡英類物質對人體健康影響的研究還比較匱乏。研究表明，從飲食[6]和藥物[7-9]方面進行干預，有助于消除體內二惡英類化合物，但還未見運動干預對二惡英類化合物毒性作用的相關研究。本文通過隨機對照試驗(randomized controlled trail, RCT)研究運動對急性TCDD暴露后大鼠肝組織微粒體酶活性的影響，為運動預防TCDD肝毒性的有效性提供理論依據(jù)。

1 對象與方法(Subjects and methods)

1.1 對 象

8周齡VAF/SPF級雄性Wistar大鼠40只，體重(336.03±16.07) g，購自北京維通利華實驗動物中心(許可證編號：SCXK(京)2006-0009)。實驗已由清華大學實驗動物福利倫理委員會批準。將大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為4組：正常對照組(Normal Control, NC)、染毒組(Normal Toxic, NT)、運動對照組(Exercise Control, EC)及運動染毒組(Exercise Toxic, ET)，各組分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度(22.75±1.33) ℃，濕度為(50.57±7.53)%，晝夜交替時間為12 h，自由飲用水和食物，以國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)室、用具等定期消毒滅菌。

1.2 給藥劑量、方式及運動強度的選擇

將2,3,7,8-TCDD溶于玉米油中，染毒(NT與ET)組腹腔注射10 μg·kg-1(以單位體重計)的2,3,7,8-TCDD(購自美國Cambridge Isotope Laboratories Inc，純度99%)，對照(NC與EC)組腹腔注射等量的玉米油。NT、NC組靜養(yǎng)4周，ET、EC組運動4周。運動方式為尾部負重5%進行游泳(尾根套負重螺絲)，每周游泳6天，每天游泳30 min，水溫為(32±2) ℃。游泳水桶直徑150 cm，水深75 cm。每組大鼠每天游泳時間固定，于每周稱重后調整負重。

1.3 實驗取材

取材前大鼠禁食8 h，稱重并記錄，用20%(w/v)的烏拉坦，按2 g·kg-1(以單位體重計)腹腔注射麻醉大鼠，快速剝離肝臟組織，用0.9%(w/v)生理鹽水浸洗，吸干，稱重并記錄，裝入事先標號的Eppendorf管中，待測組織酶活性。

1.4 指標測試方法

酶活性采用熒光分光光度法測試，所用試劑盒購自北京華英生物技術研究所，主要儀器為RF540型熒光分光光度計(日本島津公司)。7-乙氧基異吩惡唑酮脫乙基酶(7-ethoxyresorufin O-deethylase, EROD)、7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(7-ethoxycoumarin O-deethylase, ECOD)的活力單位用每克蛋白產(chǎn)生的異吩惡唑(Resorufin)的nmol數(shù)表示；芳香烴羥化酶(aryl hydrocarbon hydroxylase, AHH)的活力單位規(guī)定為每分鐘產(chǎn)生1 pmol的3-羥基苯并[a]芘為一個酶活力單位(U)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結果(Results)

2.1 大鼠體重、肝濕重和肝相對重量

大鼠體重、肝濕重和肝相對重量結果見表1，結果顯示，運動、染毒對大鼠體重(F=0.644，P=0.428，偏Eta方=0.019)、肝濕重(F=0.194，P=0.663，偏Eta方=0.006)和肝相對重量(F=1.211，P=0.279，偏Eta方=0.034)的影響無可靠的交互效應；運動對肝相對重量(F=7.273，P=0.011，偏Eta方=0.176)有可靠的主效應，運動可非常顯著增加肝相對重量，運動對大鼠體重(F=0.000，P=0.987，偏Eta方=0.000)、肝濕重(F=3.850，P=0.058，偏Eta方=0.102)無可靠的主效應；染毒對大鼠體重(F=10.537，P=0.003，偏Eta方=0.237)、肝濕重(F=55.157，P=0.000，偏Eta方=0.619)和肝相對重量(F=149.692，P=0.000，偏Eta方=0.815)有可靠的主效應，染毒可非常顯著降低大鼠體重、增加肝濕重和肝相對重量。

表1 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝絕對 重量和相對重量的影響Table 1 The effects of exercise on the liver weight and relative liver weight of rat after exposure to 2,3,7,8-TCDD

2.2 肝組織EROD活性

肝組織EROD活性水平見圖1，結果顯示，運動對EROD(F=3.815，P=0.059，偏Eta方=0.096)活性的影響無可靠的主效應，染毒對EROD(F=9.907，P=0.003，偏Eta方=0.216)活性的影響有可靠的主效應，使EROD活性顯著增高；運動、染毒對大鼠肝組織EROD(F=13.377，P=0.001，偏Eta方=0.271)活性的影響有可靠的交互效應，染毒后運動可非常顯著降低EROD活性。

圖1 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝組織 EROD活性的影響Fig. 1 The effect of exercise on the activity of liver EROD of rat after exposure to 2,3,7,8-TCDD

2.3 肝組織ECOD活性

肝組織ECOD活性水平見圖2，結果顯示，運動對ECOD(F=1.545，P=0.222，偏Eta方=0.041)活性的影響無可靠的主效應，染毒對ECOD(F=15.509，P=0.000，偏Eta方=0.301)活性的影響有可靠的主效應，使ECOD活性顯著增高；運動、染毒對大鼠肝組織ECOD(F=16.237，P=0.000，偏Eta方=0.311)活性的影響有可靠的交互效應，染毒后運動可非常顯著降低ECOD活性。

圖2 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝組織 ECOD活性的變化Fig. 2 The effect of exercise on the activity of liver ECOD of rat after exposure to 2,3,7,8-TCDD

2.4 肝組織AHH活性

肝組織AHH活性水平見圖3，結果顯示，運動對AHH(F=12.896，P=0.001，偏Eta方=0.264)活性的影響有可靠的主效應，運動可顯著升高AHH活性；染毒對AHH(F=0.023，P=0.881，偏Eta方=0.001)活性的影響無可靠的主效應。運動、染毒對大鼠肝組織AHH(F=1.894，P=0.177，偏Eta方=0.050)活性的影響無可靠的交互效應。

圖3 運動對2,3,7,8-TCDD染毒大鼠肝組織 AHH活性的變化Fig. 3 The effect of exercise on the activity of liver AHH of rat after exposure to 2,3,7,8-TCDD

3 討論(Discussion)

3.1 運動對TCDD大鼠體重、肝濕重和肝相對重量的影響

體重是反映機體營養(yǎng)狀態(tài)最簡單、最直接的指標，也是衡量健康狀況的重要標志之一；肝相對重量(肝臟的濕重與體重的百分比)可作為評價肝毒性的一個參數(shù)[10]；急性二惡英中毒后，體重的降低與劑量沒有效應關系，而大鼠肝臟相對重量明顯增加[11-12]。本研究中，染毒可非常顯著降低大鼠體重、增加肝濕重和肝相對重量，染毒使肝相對重量的增加可能為肝腫大的原因[13]；運動使肝相對重量顯著增加，運動后肝濕重增加幅度比體重增加幅度大是其可能原因；染毒和運動對大鼠肝相對重量的增加無交互影響作用。

3.2 運動對TCDD大鼠肝組織微粒體氧化酶活性的影響

研究表明，肝臟是2,3,7,8-TCDD發(fā)揮毒性作用的主要靶器官，也是機體進行代謝及發(fā)揮生物轉化作用的主要器官[4]。微粒體氧化酶系存在于細胞的光面內質網(wǎng)上，在生物轉化的氧化還原反應中占有重要地位，是需細胞色素P450(CYP450)的氧化酶系，屬于易被誘導的酶。目前在環(huán)境生物學中廣泛研究的微粒體氧化酶主要有AHH、ECOD及EROD，主要分布于肝臟，參與生物體內源性物質和外源性物質(如藥物、環(huán)境致癌物等)的生物轉化，其中AHH是人體中由遺傳所決定的一種酶，在肝組織和肺組織含量較高，是預防醫(yī)學中研究環(huán)境污染與癌癥關系的常用指標之一。

TCDD具有親脂性，其高度脂溶性的特點使其極易透過細胞膜進入細胞漿，在胞漿內作為配體與轉錄因子芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AHR)結合后，以與固醇類激素的相似作用機制發(fā)揮毒性作用。AHR幾乎是TCDD誘發(fā)所有毒性作用的必經(jīng)之路，通過與AHR結合進入細胞核內，結合到靶基因的特異反應序列，誘導其轉錄[14]。研究表明，TCDD通過與AHR結合來誘導CYP1A1、CYP1A2等與毒物代謝有關的微粒體氧化酶[15-18]；CYP1A對污染物的特征反應是誘導，CYP1A1主要影響EROD的活性，也能影響AHH的活性，CYP1A2主要影響ECOD的活性。在肝微粒體氧化酶系中，ECOD比EROD更敏感，因為肝細胞被誘導前，CYP1A1是被抑制的。

當急性染毒劑量為0.1 μg·kg-1TCDD時，24 h后就能誘導大鼠肝臟CYP1A1基因的表達[19]。急性2,3,7,8 - 四溴二苯并二惡英(TBDD)染毒劑量為10 μg·kg-1及以上時，肝臟AHH、ECOD、EROD活性持續(xù)增加，肝相對重量增加，說明肝微粒體單氧酶是TBDD影響肝臟功能的最早的敏感指示劑(TBDD的急性肝毒性與2,3,7,8-TCDD的毒性接近)[12]。，急性10 μg·kg-1TCDD染毒后4周，可致大鼠肝組織EROD、ECOD活性非常顯著升高，表明10 μg·kg-1TCDD染毒后4周誘導大鼠肝臟CYP1A1、CYP1A2，從而使肝組織EROD、ECOD活性顯著升高。由于肝細胞在被誘導前，CYP1A1是被抑制的，因此急性10 μg·kg-1TCDD染毒后4周AHH活性未出現(xiàn)明顯變化可能與染毒時間和染毒劑量有關。

運動過程中機體會產(chǎn)生相應的反應和適應，反應可由急性或是次急性運動所產(chǎn)生，適應則是一個長期系統(tǒng)運動的結果，表現(xiàn)為機體在功能上和形態(tài)結構上的持久性變化，此變化正是體質增強和訓練水平提高的基礎；而運動對機體最根本的作用就是使其產(chǎn)生適應的過程。研究表明，規(guī)律的有氧運動能使機體產(chǎn)生良好的適應[5]，有氧運動能提高肝臟抗氧化酶活性，保護肝臟免受活性氧和能量損耗導致的損傷[20]。10 μg·kg-1TCDD染毒后運動4周，可非常顯著降低EROD、ECOD活性，提示有氧運動可有效抵抗TCDD對CYP1A1和CYP1A2的誘導，有氧運動對體內毒物分布及代謝途徑的影響研究目前還鮮有報道，本研究認為運動對機體TCDD毒性的短期作用可能是通過提高機體的代謝能力，從而減少體內毒物的濃度，而長期作用則可能是提高肝臟抗氧化酶活性，減輕肝臟損傷，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，急性10 μg·kg-1(以單位體重計)TCDD染毒后4周可增加大鼠肝相對重量，并誘導大鼠肝組織CYP1A的活性，使肝組織EROD、ECOD活性顯著升高；而運動能有效抵抗TCDD對CYP1A1和CYP1A2的誘導，從而減少其對EROD、ECOD活性的激活作用。

致謝：特別感謝環(huán)境保護部華南環(huán)境科學研究所許振成研究員、國家體育總局運動醫(yī)學研究所方子龍研究員及北京體育大學運動人體科學學院石麗君教授的支持和幫助。

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◆

The Effect of Exercise on the Activity of Liver Microsomal Oxidase in 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)-Exposed Rats

Yan Huiping1, Zhang Chi1, Du Le1, Song Xiaobo1, Ding Xiaomin1, Wei Dongyang2, Xu Zhencheng2, Lu Yifan1,*

1. Sport Rehabilitation College, Beijing Sport University, Beijing 10043, China 2. South China Institute of Environmental Sciences of Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510655, China

14 December 2013 accepted 15 November 2014

The aim of the present study was to investigate the effects of exercise on the activity of liver microsomal oxidase in acute 2,3,7,8-TCDD-exposed rats. Forty male Wistar rats were randomly divided into four groups: normal control (NC), normal toxic (NT), exercise control (EC), and exercise toxic (ET). The rats in NC and ET groups were intraperitoneal injection of 2,3,7,8-TCDD (10 μg·kg-1); the NC and EC animals were administered with equivalent volume of coin oil, and the rats in exercise groups were submitted to swimming for 30 min·d-1with 5% weights attached to tails. After 4 weeks, the rats were sacrificed and the livers were immediately isolated and weighted. The lobe of each liver was kept at -80 °C for detecting the activity of hepatic microsomal enzymes. The results were statistically analyzed using MANOVA. A decreased body weight together with increased liver weight, relative liver weight, and the activities of 7-ethoxyresorufin O-deethylase (EROD) and 7-ethoxycoumarin O-deethylase (ECOD) were observed in toxic group; an increased relative liver weight and the activity of aryl hydrocarbon hydroxylase (AHH) were observed in exercise group; and exercise could effectively prevent the activation of 2,3,7,8-TCDD on the activities of EROD and ECOD. The results suggest that acute exposure to 2,3,7,8-TCDD can increase the relative liver weight, and exercise can effectively prevent the activation of 2,3,7,8-TCDD on the activities of EROD and ECOD.

2,3,7,8-TCDD; rat; hepatotoxicity; liver microsomal oxidase; exercise

北京體育大學自主科研課題(2014YB015)；全國重點地區(qū)環(huán)境與健康專項調查(21111011101EHH(2011)-505)

閆會萍(1975-)，女，博士，研究方向為運動與健康，E-mail: yanhp000@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: fanluyi@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20131214001

2013-12-14 錄用日期：2014-11-15

1673-5897(2015)2-204-06

X171.5

A

陸一帆(1963—)，男，運動生理學博士，教授，博士研究生導師，主要研究方向為運動訓練監(jiān)控、社區(qū)體育健身、運動與健康。

閆會萍, 張弛, 杜樂, 等. 運動對急性暴露于2,3,7,8-四氯二苯并二惡英大鼠肝組織酶活性的影響[J]. 生態(tài)毒理學報, 2015, 10(2): 204-209

Yan H P, Zhang C, Du L, et al. The effect of exercise on the activity of liver microsomal oxidase in 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD) -exposed rats [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 204-209(in Chinese)