薺菜芳香成分的固相微萃取條件優(yōu)化與分析

薛妍君,張 麗,馮 莉,姜 麗,郁志芳，*

(1.南京農業(yè)大學,江蘇南京 210095;2.蘇州市農科院,江蘇蘇州 215155)

薺菜芳香成分的固相微萃取條件優(yōu)化與分析

薛妍君1,張 麗2,馮 莉1,姜 麗1,郁志芳1，*

(1.南京農業(yè)大學,江蘇南京 210095;2.蘇州市農科院,江蘇蘇州 215155)

采用固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用方法分析薺菜香氣成分,并通過單因素對比實驗優(yōu)化萃取條件。結果表明:選用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度50℃、時間40min,解析溫度250℃、時間3min萃取效果最佳;實驗共鑒定有效香氣成分64種,以醇類、醛類、烴類及含硫雜氧化合物為主。薺菜的特征香氣成分主要有二甲基二硫、正己醛、葉醇、青葉醛、二甲三砜、2,6-二甲基環(huán)己醇、β-紫羅蘭酮等。

薺菜,香氣,固相微萃取(SPME),氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)

香氣是衡量果蔬品質的重要指標,固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)技術作為一種新的樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機物的分析方法,可與氣相色譜(GC)、氣相色譜-質譜(GC-MS)、液相色譜-質譜(LC-MS)聯用,因此,自20世紀90年代出現以來受到廣泛關注并大量應用于各類食品、環(huán)境及生物樣品的檢測中[1-2]。目前,已通過SPME技術鑒別出香氣成分的蔬果主要有桃子[3]、草莓[4]、櫻桃[5]、哈密瓜[6]、龍眼[7]、冬瓜[8]、洋蔥[9]、南瓜[10]等。

SPME萃取過程受萃取纖維涂層種類、萃取溫度、平衡時間、解析溫度及時間、無機鹽添加量等很多因素影響,萃取參數不同,結果存在很大差異[11]。近年來,很多文獻針對不同實驗材料對SPME操作參數進行了優(yōu)化介紹,但SPME分析薺菜中香氣物質的研究鮮見報道。

薺菜為十字花科薺菜屬,一、二年生草本植物,作為食物常以嫩莖、葉供食用,氣味清香甘甜。由于富含谷氨酸等多種氨基酸,味道鮮美至極,被譽為“野菜之上品”。就香氣而言,薺菜多呈現馥郁的草葉清香和蔬果香氣,郭華等通過同時蒸餾萃取方法提取薺菜揮發(fā)油并確定其主要呈香物質為葉醇、乙酸葉醇酯及含硫化合物等[12],這與劉宇等通過水蒸氣蒸餾法獲得的薺菜揮發(fā)油成分略有差異。后者發(fā)現,薺菜揮發(fā)油中長鏈烷烴和有機酸類化合物含量較高,萜類及酯類化合物含量較低[13]。本文擬采用SPME與GC-MS聯用分析薺菜香氣成分,并通過萃取頭的選擇、萃取溫度及時間、解析溫度及時間等單因素優(yōu)化實驗,建立SPME萃取薺菜香氣成分的最佳體系并明確薺菜芳香成分的組成和特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生薺菜2012年11月采自南京郊外,成熟度一致、無機械損傷、無病蟲害,經分級→清洗→除雜→去黃葉→剪除根部后瀝干水分備用。

Trace GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo公司;Tri-Plus自動進樣器 美國Thermo公司;100μm PDMS、85μm PA、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司;15mL萃取瓶 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原材料處理方法 選取大小相同、成熟度一致的薺菜500g,切成1cm長的小段,隨機取樣于液氮中研磨成細粉狀[14],凍藏備用。取樣重復三次。

1.2.2 SPME技術參數優(yōu)化設計 以萃取頭種類、萃取溫度、萃取時間、解析溫度及時間為單因素設計優(yōu)化實驗。萃取頭選用100μm PDMS、85μm PA、50/30μm DVB/CAR/PDMS;萃取溫度控制在30～70℃之間,設計30、40、50、60、70℃五個水平;萃取時間以20、30、40、50、60min為時間梯度。

解析溫度及時間對比實驗:設計230～270℃五個溫度水平和1～5min五個時間水平,分別探究解析溫度和時間對萃取結果的影響。

1.2.3 SPME操作方法 準確稱取研磨好的薺菜2.0g于15mL萃取瓶中,用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封后置于水浴鍋中平衡20min,將固相微萃取頭在氣相色譜儀進樣口老化,100μm PDMS老化溫度250℃、時間0.5h;85μm PA 280℃老化1h;50/30μm DVB/CAR/PDMS老化溫度270℃、時間1h。萃取吸附結束后將萃取頭插入GC-MS進樣口解析脫附。

1.2.4 GC-MS分析條件 GC條件:HP-5MS(30×0.25×0.25)色譜柱,反復實驗確認升溫程序為初溫35℃,保留2min,以5℃/min的速度上升到80℃,保持1min;再以8℃/min上升至180℃,保留1min;最后以10℃/min上升至250℃,保留2min;進樣口溫度250℃,載氣為He氣,柱流量1mL/min,不分流進樣。

MS條件:離子源溫度200℃,電離方式EI,檢測溫度240℃,電子能70ev,燈絲電流150μA,掃描范圍33～540。

1.2.5 圖譜解析 通過對總離子色譜圖峰的分析,經計算機與NIST Library和Wiley Library質譜庫匹配,挑選出匹配度和反匹配度大于800(最大值1000)的信號峰,根據相對分子質量、化學式及分子結構確定峰物質名稱。按峰面積歸一化法計算百分含量。

1.2.6 數據統(tǒng)計 采用Excel 2007、SPSS18.0軟件對數據結果進行統(tǒng)計處理及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 萃取參數優(yōu)化

2.1.1 萃取頭的選擇 萃取頭極性和厚度是固相微萃取技術的核心,對目標物萃取效果有直接影響,不同極性萃取頭針對的目標物極性不同。本實驗選用的三種不同類型萃取頭,PA主要吸附極性半揮發(fā)性物質,PDMS吸附非極性揮發(fā)性物質,DVB/CAR/PDMS則對揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質都有較好的吸附效果[15]。三種萃取頭對新鮮薺菜風味物質的GC-MS總離子色譜圖如圖1所示。

由圖1可知,DVB/CAR/PDMS萃取頭對薺菜風味物質分離效果最好,捕集香氣組分數最多,為61種,且涵蓋了其它兩種萃取頭所檢測到的大部分化合物;PDMS萃取頭次之,分離香氣組分23種,多為長鏈烷烴,對醇、醛等極性化合物分離效果不好;PA萃取頭萃取效果最差,僅分離出19種香氣成分,以脂肪酸等極性化合物為主,故而薺菜香氣捕集時宜選用DVB/CAR/PDMS萃取頭。

2.1.2 萃取溫度的優(yōu)化 萃取溫度對香氣物質的分離效果具有雙重性。低萃取溫度下香氣物質揮發(fā)速度慢,達到動態(tài)平衡的時間長,且低沸點化合物比重增加;反之溫度升高,萃取頭吸附能力降低,萃取效率減小。另外,高溫使部分香氣組分發(fā)生異構化或裂解,影響分析結果的真實性[16-17]。實驗設30～70℃五個溫度水平,以歸一法計算得到的總峰面積及總峰面積與峰數的比值為優(yōu)化依據[18],經GC-MS分析,所得結果見圖2。

隨著萃取溫度的升高,總峰面積和總峰面積/峰數值呈現上升趨勢,其中30℃和40℃條件下,上升趨勢緩慢,50℃出現吸附高峰,總峰面積和總峰面積/峰數值達到最大,且升高趨勢極顯著(p<0.01)。繼續(xù)升高溫度,二者數值均有不同程度降低,60℃降低趨勢極顯著(p<0.01),70℃顯著(p<0.05)。高溫導致峰面積下降的原因可能是分析物在萃取涂層與基質中的分配系數降低,影響了SPME的靈敏度。另外,高溫條件下,低沸點化合物流失嚴重,并在與高沸點物質的競爭吸附中處于弱勢地位,使得部分低沸點成分不能被吸附或吸附量減少[19]。綜合以上結果,最佳萃取溫度設定為50℃。

2.1.3 萃取時間的選擇 萃取時間對萃取結果的影響如圖3所示。40min前隨著萃取時間的延長,總峰面積及其與峰數的比值均增加,說明香氣物質的吸附量不斷增大,20～40min內,總峰面積由3.2×109增加到4.1×109,變化極顯著(p<0.01),峰面積/峰數值變化顯著(p<0.05),40min時二者達到最大。50～60min,峰面積稍有降低,但降低趨勢不明顯(p>0.05),峰面積/峰數值趨于平衡,說明萃取頭在40min即處于吸附飽和狀態(tài),繼續(xù)延長時間不會改善吸附效果,這可能與待分析物的分配系數、樣品基質及體積、萃取頭涂層的物理化學性質有關[20],因此,選擇40min為最佳萃取時間。

圖1 不同萃取頭分離效果比較Fig.1 Total ion chromatogram comparison of volatile flavor compounds extracted by PA(a)、 PDMS(b)and DVB/CAR/PDMS(c)coated fibers

圖2 萃取溫度對總峰面積(a) 和總峰面積與峰數比值(b)的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on total peak area(a) and total peak area-to-peak number ratio(S/N)(b)

相對于萃取溫度,時間選擇對香氣物質總峰面積的影響要小得多。

圖3 萃取時間對總峰面積(a) 和總峰面積與峰數比值(b)的影響Fig.3 Effect of extraction time on total peak area(a) and total peak area-to-peak number ratio(S/N)(b)

2.1.4 解析溫度和時間對萃取結果的影響 解析作為固相微萃取操作的關鍵步驟,其溫度和時間對結果有重要影響。解析溫度過高,物質脫附速度快,解析時間短,但高溫會縮短萃取纖維的使用壽命,同時造成一些香氣物質發(fā)生氧化、裂解或異構化反應,影響實驗結果的準確性;解析時間短易造成解析不完全,污染后續(xù)樣品分析,而長時間解析則會導致峰形變寬,損害分離效果[21]。實驗預設230～270℃五個溫度水平和1～5min五個時間水平,分別探究解析溫度和時間對總峰面積的影響,結果見圖4?？偡迕娣e隨解析溫度的升高和時間的延長不斷增加,當溫度達到250℃,時間為3min時,峰面積值基本穩(wěn)定,繼續(xù)升高溫度或延長時間峰面積值無明顯變化(p>0.05),因此確定最佳解析條件為250℃,3min。

表1 薺菜香氣成分的GC-MS分析結果Table 1 Volatile composition of Capsella bursa-pastoris L

圖4 解析溫度(a)和解析時間(b)對總峰面積的影響Fig.4 Effect of desorption temperature(a) and time(b)on total peak area

2.2 香氣成分分析

在最優(yōu)萃取條件下對薺菜進行SPME萃取操作,經GC-MS檢測并與NIST Library和Wiley Library質譜庫匹配、篩選,最終確定薺菜中揮發(fā)性香氣成分,結果見表1。

由表1可知,實驗共檢出薺菜有效香氣成分64種,占出峰化合物總數的92.9%,峰面積和為總峰面積的91.3%,其中醛類物質種類最豐富,共檢出18種;其次為醇類物質12種;碳氫化合物作為薺菜香氣成分的重要組成部分,檢出11種;另酯類信號峰6種,酸類3種,酮類2種。此外,含硫化合物,雜氧化合物(統(tǒng)稱其它化合物)對薺菜香氣組分也有較大貢獻,共分離出12種,占種類總數的18.75%。劉宇等利用水蒸氣蒸餾法提取薺菜揮發(fā)油,經GC-MS分析,共捕集45種化合物,占揮發(fā)油總量的70%[13];郭華等應用同時蒸餾-萃取法分析薺菜揮發(fā)性成分,只分離得到化合物組分17種[12]。本研究結果表明,SPME不僅能吸附薺菜中較多的揮發(fā)性物質成分,而且可提高芳香物質的檢出率,因而是一種更有效的檢測方法。

就含量而言,醇類物質和醛類物質的相對含量最高,為薺菜的主要香氣成分,分別占總含量的26.65%和27.03%;其次是含硫及雜氧化合物,相對含量21%;碳氫化合物的相對含量也較高,為7.98%,分別是酯類、酸類、酮類物質的2.46、2.17、4.67倍。

續(xù)表

色譜圖中,各香氣組分出峰時間集中在34min前,尤其以10～25min內出峰數量最多,化合物相對含量最高,主要出峰物多為醇類、醛類、酯類等低沸點化合物,其中含量較高的組分有正己醛、2-甲基-4-戊烯酸、葉醇、青葉醛、反式-2-己烯-1-醇、順-4-庚烯醛、苯甲醛等,相對含量分別為5.28%、2.17%、6.84%、3.89%、4.91%、1.99%和5.64%,這些多物質大都呈現草葉清香和蔬果香,部分物質有鮮果、油脂香氣。萃取后期,烷烴類、雜氧化合物等高沸點物質居多,大部分物質含量較低,但有些化合物如2-正戊基呋喃、桉葉油素、2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪等香氣強度高且香氣閾值低,因此對整體香氣的貢獻作用不可忽視[22]。

值得注意的是,薺菜中含硫化合物含量相當豐富,二甲基二硫、二甲三砜、二甲基四硫等硫化物含量高達14.6%,這與郭華等人的研究結果一致[12]。

3 結論

SPME萃取薺菜香氣成分的最優(yōu)萃取參數為:取2g樣品于15mL萃取瓶中,選用50/30μmDVB/CAR/PDMS纖維萃取頭,50℃平衡20min,萃取40min,解析溫度250℃,解析時間3min。

優(yōu)化條件下共分離出有效薺菜香氣成分64種,占化合物總數的92.9%,峰面積和占到總峰面積的91.3%,種類從多到少分別為醛類18種、醇類12種、碳氫化合物11種、酯類6種、酸類3種、酮類2種、其它化合物12種,相對含量分別為27.03%、26.65%、7.98%、3.25%、3.68%、1.71%和21%。

薺菜香氣組分主要由醛類、醇類、酯類及含硫化合物等組成,特征化合物包括二甲基二硫、正己醛、葉醇、青葉醛、二甲三砜、2,6-二甲基環(huán)己醇、檸檬醛、β-紫羅蘭酮等,這些物質共同作用形成了薺菜特有的香氣特征。

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Optimization and analysis of volatile components ofCapsellabursa-pastorisLby SPME-GC-MS

XUE Yan-jun1,ZHANG Li2,FENG Li1,JIANG Li1,YU Zhi-fang1,*

(1.Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;(2.Suzhou Academy of Agricultural Sciences,Suzhou 215155,China)

SPME-GC-MS was used to analysis volatile components ofCapsellabursa-pastorisand the extraction conditions were investigated. Experimental results showed that the optimal SPME extraction time and temperature were 40min and 50℃,while the desorption time and temperature were 3min and 250℃ by using DVB/CAR/PDMS fiber. A total of 64 volatile components were identified mainly of which were aldehydes,alcohols,hydrocarbons and other compounds including sulfide and heterocycle. The characteristic volatile components ofCapsellabursa-pastoriswere disulfide,dimethyl;Hexanal;3-Hexen-1-ol;2-Hexenal,(E)-;Dimethyl trisulfide;Cyclohexanol,2,6-dimethyl-;3-Buten-2-one,4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-and so on.

Capsellabursa-pastorisL;volatile components;SPME;GC-MS

2014-03-10

薛妍君(1987-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬采后生物學。

*通訊作者:郁志芳(1960-)，男，博士，教授，研究方向：農產品加工與貯藏。

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新資金( CX(13)5076)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)01-0328-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.061