牦牛乳酪蛋白降血壓肽制備工藝及分離純化研究

宋 禮，孫文靜，紀(jì)銀莉，馮 丹，劉 恭，謝小冬

(1.甘肅華羚生物技術(shù)研究中心,甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

牦牛乳酪蛋白降血壓肽制備工藝及分離純化研究

宋 禮1，孫文靜1，紀(jì)銀莉1，馮 丹1，劉 恭1，謝小冬2，*

(1.甘肅華羚生物技術(shù)研究中心,甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

研究了胰蛋白酶制備降血壓肽的最佳水解條件和分離純化工藝。通過單因素、正交實(shí)驗(yàn),確定了最佳水解條件胰蛋白酶添加量2.5%,溫度37℃,最適pH8.0,反應(yīng)時(shí)間2.5h,水解產(chǎn)物抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的能力為85.26%；通過液相色譜及質(zhì)樸檢測(cè),得到降血壓肽的序列片段為HQGLPQEVLNENLLR、AVPYPQR和TKVIPYVR。

降血壓肽,制備,純化

酪蛋白(casein)由動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞合成,是乳蛋白中最主要的蛋白質(zhì),約占其蛋白總量的80%。在pH4.6,溫度20℃的條件下,從脫脂乳中沉淀下來的蛋白質(zhì)就是酪蛋白[1]。牛乳酪蛋白中蘊(yùn)藏著許多具有生物活性的多肽,這些多肽在母體蛋白質(zhì)序列內(nèi)是無活性的,通過水解的方式釋放出來后即可成為活性肽。這些多肽物質(zhì)具有很多功能特性,如阿片活性、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性、免疫調(diào)節(jié)活性、結(jié)合礦物質(zhì)的活性、抗血栓活性、抑菌活性、降血脂活性等。國內(nèi)一些學(xué)者對(duì)酶水解蛋白制備降血壓肽制備工藝報(bào)道居多[2-4],對(duì)其降血壓功能也有研究[5],但是對(duì)水解產(chǎn)物中降血壓肽的分離純化及結(jié)構(gòu)分析報(bào)道較少。其目前,降血壓肽的主要制備方法有:酶解法,發(fā)酵法和自溶法?；蚬こ碳夹g(shù)這一新穎的方法,在藥物生產(chǎn)以及食品原料過程中的應(yīng)用已越來越多,利用基因工程技術(shù)制備降血壓肽目前也有所借鑒和發(fā)展。這4種方法中酶法水解具有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少以及易于控制等特點(diǎn),既不會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)成分的損失,也不會(huì)產(chǎn)生毒理性問題,已成為研究過程中使用最多的一種方法。常用的酶制劑有堿性蛋白酶[6]、中性蛋白酶[7]、胰蛋白酶[8]、Alcalase[9]等。降血壓肽的分離提取常用的方法包括:超濾[10]、離子交換層析[11]、凝膠過濾層析、高效液相色譜、反向高效液相色譜、薄層色譜毛細(xì)管電泳等。本研究通過研究降血壓肽的制備工藝及分離純化方法,為開發(fā)高附加值食源性的降血壓肽產(chǎn)品以及進(jìn)一步研究食源性降血壓肽的氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級(jí)牦牛乳酪蛋白 購自甘肅華羚酪蛋白股份有限公司；胰蛋白酶 購自北京恒源生物科技有限公司；兔肺丙酮粉 購自sigma；FAPGG 購自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；其他生化試劑 均為國產(chǎn)分析純。

UV2450紫外可見分光光度計(jì) 日本SHIMADZU；pH計(jì) 梅特勒；高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ACE抑制率測(cè)定 ACE酶液:50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL預(yù)冷至4℃硼酸緩沖液(pH8.3,100mmol/L)中,4℃保持12h后4℃、20000r/min離心40min,收集上清液并4℃保。

FAPGG底物溶液:將FAPGG溶于100mmol/L的硼酸沖液(含300mmol/L的NaCl,pH8.3),配制成1.6mmol/L溶液。

500μL FAPGG底物溶液與100μL超純水或抑制劑ACE抑制肽或卡托普利)混勻,37℃預(yù)熱2min,加入100μL ACE酶液開始反應(yīng),30min后立即加入100μL EDTA(100mmol/L)終止反應(yīng),加入4000μL超純水稀釋,實(shí)驗(yàn)平行3次。0min樣品的測(cè)定,要先加入EDTA再加入ACE酶液,其他相同。于340nm波長(zhǎng)處分別測(cè)系在0min和30min時(shí)的吸光度,計(jì)算差值ΔA(ΔA=A0min-A30min)。以單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化表示ACE酶活力,抑制劑對(duì)ACE的抑制程度用(2)式計(jì)算[12]。

式中:ΔAc為加入超純水時(shí)吸光度在30min內(nèi)的變；ΔAi為加入抑制劑時(shí)吸光度在30min內(nèi)的變化。

半抑制濃度(IC50)定義為抑制50% ACE酶活力時(shí)抑制劑濃度。配制不同濃度的ACE抑制劑(nmol/L或mg/mL)上述步驟測(cè)定其ACE抑制率,以lg抑制劑的濃度橫坐標(biāo),ACE抑制率(%)為縱坐標(biāo),進(jìn)行回歸分析回歸方程,利用回歸方程計(jì)算抑制劑的IC50。

1.2.2 酶解工藝優(yōu)化

1.2.2.1 溫度對(duì)水解條件的影響 設(shè)置反應(yīng)溫度30、35、40、45和50℃單因素條件,以酶添加量1%,pH7.0,反應(yīng)1h,進(jìn)行水解反應(yīng),以ACE酶抑制率為考核指標(biāo),研究酶的最佳反應(yīng)溫度。

1.2.2.2 pH對(duì)水解條件的影響 設(shè)置pH為6.5、7.0、7.5、8.0和8.5單因素條件,以胰蛋白酶添加量1%,反應(yīng)溫度40℃,反應(yīng)1h,進(jìn)行水解反應(yīng),以ACE酶抑制率為考核指標(biāo),研究最佳水解pH。

1.2.2.3 酶添加量對(duì)水解條件的影響 設(shè)置酶添加量1%、1.5%、2%、2.5%和3%單因素條件,以反應(yīng)溫度40℃,pH8.0,反應(yīng)1h,進(jìn)行水解反應(yīng),以ACE酶抑制率為考核指標(biāo),研究最佳添加量。

1.2.2.4 時(shí)間對(duì)水解條件的影響 設(shè)置反應(yīng)時(shí)間1、1.5、2、2.5和3h單因素條件,以酶添加量2%,反應(yīng)溫度40℃,pH8.0,進(jìn)行水解反應(yīng),以ACE酶抑制率為考核指標(biāo),研究酶的最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.2.5 正交組合實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn),以降血壓活性為衡量指標(biāo),研究胰蛋白酶水解酪蛋白制備降血壓肽最佳工藝參數(shù)。因素水平表見表1。

表1 水解條件因素水平表Table 1 Factors and levels of hydrolysis conditions

1.2.3 分離純化實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 葡聚糖凝膠分離 采用葡聚糖凝膠柱對(duì)離子交換分離產(chǎn)物進(jìn)行分離。將Sephadex G-15用蒸餾水平衡后裝柱(12mm×450mm),通過超濾膜對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行初分離,選用分子量在200～2500u的樣液0.1g進(jìn)行上樣,洗脫液為磷酸緩沖液,流速1d/6s,分管收集,每管1.5mL,收集70管,在280nm處分別測(cè)定各峰的活性。

1.2.3.2 色譜檢測(cè) 對(duì)凝膠分離的抗氧化肽進(jìn)行色譜純度分析。取葡聚糖凝膠分離的高活性ACE抑制肽進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。檢測(cè)條件:流動(dòng)相A液為純凈水,B液為無水乙腈+0.1%TFA,280nm C18柱,柱溫28℃,流速為0.5mL/min,進(jìn)樣體積是20μL,梯度洗脫見表2。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

1.2.3.3 質(zhì)譜檢測(cè) 通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對(duì)降血壓肽進(jìn)行分子量進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定,確定水解產(chǎn)物分子量。,該實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果有中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析中心檢測(cè)完成。

1.2.3.4 序列測(cè)定 用質(zhì)譜對(duì)降血壓肽進(jìn)行N端氨基酸序列分析,通過CNBI酪蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì),確定降血壓肽肽活性序列。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)水解條件的影響

由圖1可以看出,隨著溫度的逐步升高,胰蛋白酶的水解活性增強(qiáng),水解產(chǎn)物中ACE的活性也逐漸增高。當(dāng)溫度達(dá)到一定程度后,因高溫造成蛋白酶部分失活,水解產(chǎn)物的ACE活性也逐漸降低。當(dāng)溫度為40℃時(shí),產(chǎn)物有最大的ACE抑制率,抑制率達(dá)到65.3%。

2.2 pH對(duì)水解條件的影響

胰蛋白酶只有在最佳的pH條件下才能更好的發(fā)生酶解反應(yīng),由圖2可以看出,胰蛋白酶在pH8.0條件下,水解產(chǎn)物有最大的ACE酶抑制率57.2%。

圖1 溫度對(duì)ACE活性的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the degree of hydrolysis

圖2 pH對(duì)ACE活性的影響Fig.1 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.3 酶添加量對(duì)水解條件的影響

由圖2可以看出,隨著酶的添加量增大,水解產(chǎn)物的水解度逐漸增大,水解產(chǎn)物中肽的生成量逐漸增多,當(dāng)添加量為底物的2%時(shí),水解產(chǎn)物的ACE酶抑制率基本達(dá)到頂峰,ACE酶抑制率為為60.1%,當(dāng)添加量為底物的3%時(shí),水解產(chǎn)物的ACE抑制率為63.1%。

圖3 添加量對(duì)ACE活性的影響Fig.3 Effect of addition on the degree of hydrolysis

2.4 時(shí)間對(duì)水解條件的影響

由圖4可以看出,隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng),底物不斷被水解,產(chǎn)物的ACE抑制率也逐漸增大。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),水解反應(yīng)2h后,水解產(chǎn)物的ACE酶抑制率66.1%,基本達(dá)到頂峰。對(duì)比反應(yīng)2.5h產(chǎn)物ACE抑制率為66.7%和反應(yīng)3h產(chǎn)物ACE抑制率67.1%,產(chǎn)物的ACE酶抑制率差別不大,考慮到實(shí)驗(yàn)周期及生產(chǎn)成本,實(shí)驗(yàn)選擇2.5h作為本實(shí)驗(yàn)的水解時(shí)間。

圖4 時(shí)間對(duì)ACE活性的影響Fig.4 Effect of reaction time on the degree of hydrolysis

2.5 正交組合實(shí)驗(yàn)

正交組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal combination test

由正交實(shí)驗(yàn)可以看出,4個(gè)因素的主次順序?yàn)锳、C、B、即添加量、pH、溫度。根據(jù)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表4。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

通過方差分析可知,添加量對(duì)ACE酶抑制率有顯著影響。最佳實(shí)驗(yàn)組合為添加量為2.5%,溫度37℃,pH8.0,時(shí)間為150min,在最佳條件下,水解產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)到85.26%。

2.6 葡聚糖凝膠分離

酪蛋白水解產(chǎn)物中,肽分子大小是連續(xù)分布的,即水解物中存在著大小不等的肽分子,通過Sephadex G-15對(duì)除鹽酶解液進(jìn)行分離純化,磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫,在280nm

表5 降血壓肽氨基酸序列分析Table 5 Amino acid sequence analysis of antihypertensive peptide

處收集有吸收的樣液共50管。對(duì)收集到的各管樣液進(jìn)行ACE抑制肽活性檢測(cè),結(jié)果表明,18號(hào)樣液ACE抑制率64.7%、19號(hào)樣液ACE抑制率52.4%,抑制率相對(duì)較高。蛋白洗脫曲線圖如圖5所示:

圖5 收集液OD值Fig.5 The OD value of collect liquid

2.7 色譜檢測(cè)

對(duì)18、19號(hào)樣液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),結(jié)果如圖6所示。通過色譜比對(duì),均在14min和20min處出現(xiàn)色譜峰,而且20min時(shí)的色譜峰有較高的峰值。說明2個(gè)收集管存在相同物質(zhì)。

圖6 降血壓肽高效液相色譜圖Fig.6 The HPLC spectrogram of antihypertensive peptide

2.8 質(zhì)譜檢測(cè)

對(duì)18號(hào)樣液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),結(jié)果如圖7所示。由圖可以看出,分離出的降血壓肽有3個(gè)明顯的質(zhì)譜峰,分子量分別為830u,在977u和1760u。

圖7 降血壓肽質(zhì)譜圖Fig.5 The mass spectrogram of antihypertensive peptide

2.9 序列測(cè)定

對(duì)分離出的降血壓肽進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定,結(jié)果如表5所示,結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)可以看出,來自a-S2酪蛋白的198-205的氨基酸序列是降血壓肽的主要成分。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)得到了胰蛋白酶最佳水解條件為胰蛋白酶添加量2.5%,溫度37℃,pH8.0,反應(yīng)2.5h,水解產(chǎn)物有最強(qiáng)的ACE酶抑制率,抑制率達(dá)到85.26%。通過葡聚糖凝膠柱對(duì)降血壓肽進(jìn)行分離純化,利用高效液相色譜檢測(cè)純度并進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定,通過與NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),得到降血壓肽氨基酸序列分別為HQGLPQEVLNENLLR(1760u)、AVPYPQR(830u)和TKVIPYVR(997u),分別來自as1酪蛋白8-22,β-酪蛋白177-183和as2酪蛋白198-205。其中,來自as2酪蛋白198-205片段是降血壓肽的主要成分。

[1]李曉輝.牛乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)特性及其應(yīng)用[J].食品工業(yè),2002(1):29-31.

[2]于曉慶,王雄,司佳.酶法制備乳源ACE抑制肽[J].食品研究與開發(fā),2011,32(9),134-136.

[3]楊銘,胡志和. 乳源ACE抑制肽的開發(fā)與應(yīng)用[J],食品科學(xué),2010,31(19),461-464.

[4]王佳佳,胡志和. 乳源ACE抑制肽的制備及應(yīng)用[J].食品科學(xué),2012,33(3),286-291.

[5]王磊,成雪,毛學(xué)英.乳清蛋白及其活性多肽的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2010,12(5),30-35.

[6]趙肖蓉,郁曉盼,牟光慶. 酪蛋白降血壓肽的制備[J]. 食品工業(yè),2011(4):54-56.

[7]張賽賽,李恒星,沙莎，等. 酶膜反應(yīng)器水解酪蛋白連續(xù)制備ACE抑制肽的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2009,9(6):41-47.

[8]洪偉,薛正蓮,陳玲. 酪蛋白制備抑制肽的酶解工藝優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵科技,2010,46(2):37-40.

[9]Xin-Huai Zhao,Ya-Yun Li. An approach to improve ACE-inhibitory activity of caseinhydrolysates with plastein reaction catalyzed by Alcalase[J]. Eur Food Res Technol,2009,229:795-805.

[10]姜瞻梅,田波,霍貴成. 超濾法分離酪蛋白酶解物中的ACE抑制肽[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(10):59-61.

[11]代永剛,南喜平,李鐵柱,等. 酪蛋白源ACE抑制肽的分離純化[J]. 中國乳品工業(yè),2010,38(20):21-23.

[12]Murray B A,Walsh D J,Fitzgerald R J. Modification of the furanacryloyl-L-phenylalanyl-glycylglycine assay for determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity[J]. Journal of Bio-chemical and Biophysical Methods,2004,59(2):127-137.

Study of preparation and purification process ofantihypertensive peptides from Yak milk casein

SONG Li1,SUN Wen-jing1,JI Yin-li1,FENG Dan1,LIU Gong,XIE Xiao-dong2,*

(1. Gansu,Hua Ling Biotechnology Research Center,Lanzhou,Lanzhou 730000,China;2. school of basic medical sciences,Lanzhou University,Lanzhou,Lanzhou 730000,China)

To prepare the antihypertensive peptides,the optimal enzymatic hydrolysis conditions of Trypsin and purification process were studied.The optimal hydrolysis conditions were determined by single factors and orthogonal experiments,and the optimum hydrolysis conditions were temperature 37℃,pH8.0,trypsin added 2.5%,with reaction 2.5h,the capacity of angiotensin-converting enzyme inhibition was 85.26%. Hydrolyzates were separated and purified by high performance liquid chromatography(HPLC)and mass spectrometry,and the amino acid sequences were HQGLPQEVLNENLLR,AVPYPQR and TKVIPYVR.

antihypertensive peptides;preparation;purification

2014-04-29

宋禮(1984-),男,碩士,研究方向:食品科學(xué)。

*通訊作者:謝小冬(1969-),男,博士,教授,研究方向:生物工程。

牦牛乳資源利用及系列產(chǎn)品關(guān)鍵技術(shù)合作研發(fā)(國際科技合作重點(diǎn)項(xiàng)目計(jì)劃2011DFA32550)。

TS252.1

B

1002-0306(2015)03-0223-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.038