IL－34和CSF－1在狼瘡腎炎小鼠腎臟的表達(dá)及意義＊

廖文慧， 杜艷軍， 曾 銳

論著

IL－34和CSF－1在狼瘡腎炎小鼠腎臟的表達(dá)及意義＊

廖文慧1， 杜艷軍2， 曾 銳3△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1綜合科3腎內(nèi)科，武漢 430030
2湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430061

目的 探討巨噬細(xì)胞活化因子白細(xì)胞介素－34（IL－34）和集落刺激因子－1（CSF－1）在狼瘡腎炎小鼠腎臟的表達(dá)及意義。方法 以自發(fā)性狼瘡腎炎小鼠MRL－Faslpr和TgZ－MRL－Faslpr小鼠為模型，于6周、3月、5月末處死動(dòng)物，檢測尿蛋白和血肌酐的變化；PAS染色觀察腎臟病理改變；實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA法檢測腎組織IL－34和CSF－1的表達(dá)；免疫組化和免疫熒光法檢測腎組織F4／80＋巨噬細(xì)胞數(shù)量、雪蓮花凝集素（LTL）和雙花扁豆凝集素（DBA）的分布；原位雜交檢測腎臟IL－34的分布；X－gal染色檢測腎組織CSF－1的分布。結(jié)果 ①隨著鼠齡增加MRL－Faslpr小鼠腎臟IL－34和CSF－1mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加（均P＜0.01），增加的IL－34和CSF－1主要分布在皮髓交界處的腎小管中，部分分布于皮質(zhì)腎小管。②腎臟IL－34和CSF－1表達(dá)增加與腎臟病理分級(jí)和腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤呈量效關(guān)系。③尿蛋白定量與腎臟IL－34的表達(dá)密切相關(guān)。相關(guān)分析顯示，尿IL－34含量與尿白蛋白排泌呈正相關(guān)（r＝0.915 4，P＜0.01），明顯優(yōu)于CSF－1（r＝0.150 6，P＝0.07）。結(jié)論 與CSF－1相比，腎臟IL－34的表達(dá)和分泌與尿蛋白定量密切相關(guān)，尿IL－34含量能夠反映狼瘡腎炎的活動(dòng)程度。

狼瘡腎炎； 蛋白尿； 白細(xì)胞介素－34； 集落刺激因子－1

集落刺激因子－1，即CSF－1（colony－stimulating factor－1），又稱M－CSF，是一種單核巨噬細(xì)胞生長因子，它能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的存活、增殖、分化和趨化［1］。腎小管上皮細(xì)胞過表達(dá)CSF－1、激活炎癥性巨噬細(xì)胞是狼瘡腎炎進(jìn)行性進(jìn)展的主要機(jī)制［23］。臨床研究表明，血液和尿液CSF－1升高是促進(jìn)狼瘡腎炎啟動(dòng)、進(jìn)展和復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素［4］。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)，CSF－1并不是CSF－1受體（CSF－1R）的唯一配體，敲除CSF－1不能完全阻斷CSF－1R途徑誘導(dǎo)的腎臟巨噬細(xì)胞活化［5－6］。Lin等［7］通過蛋白質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn)，CSF－1R還存在另外一個(gè)配體，即白細(xì)胞介素－34（interleukine－34，IL－34）。IL－34的氨基酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)、受體結(jié)合的位點(diǎn)、受體親和力、受體后信號(hào)通路均不同于CSF－1［8－10］。IL－34在狼瘡腎炎的表達(dá)、分布和功能尚不清楚。本研究以自發(fā)性狼瘡腎炎小鼠MRL／MpJ－Faslpr小鼠為模型，觀察IL－34與CSF－1在狼瘡腎炎的表達(dá)差異及其與疾病活動(dòng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用自發(fā)性狼瘡腎炎小鼠MRL／MpJFaslpr小鼠（簡稱MRL－Faslpr小鼠），CSF－1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LacZ報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因MRL－Faslpr小鼠（簡稱TgZ－MRL－Faslpr小鼠），C57B6／J小鼠（簡稱B6小鼠）購于美國Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME）。自發(fā)性狼瘡腎炎小鼠于6周齡開始以Dipstick法監(jiān)測尿蛋白，每周1次。代謝籠收集6周、3月、5月齡小鼠尿液，測定尿白蛋白／肌酐。

1.2 主要試劑

T7RNA多聚酶、蛋白酶K、地高辛復(fù)合物、BM Purple顯色底物、堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的抗地高辛抗體（美國Roche公司），X－gal（美國Sigma公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記－雪蓮花（Lotus tetragonolobus lectin，LTL）凝集素和FITC標(biāo)記－雙花扁豆（biotinylated dolichos biflorus agglutinin，DBA）凝集素（美國Vector Laboratories公司），蛋白酶抑制劑（美國Sigma公司），美國IL－34和CSF－1ELISA kit（美國R＆D Systems公司），Trizol RNA抽提試劑盒、F4／80抗體（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（美國Qiagen公司），生物素標(biāo)記的兔抗大鼠抗體、Avidin／Biotin Blocking Kit、DAB顯色液和Vectshield封片液（美國Vector Laboratories公司）。

1.3 腎臟病理學(xué)檢測

腎臟組織石蠟包埋，2μm切片，脫蠟水化后進(jìn)行PAS染色。對腎臟病理進(jìn)行半定量分級(jí)，0級(jí):正常腎小球，無腎間質(zhì)浸潤；1級(jí):輕度腎間質(zhì)浸潤；2級(jí):中度腎間質(zhì)浸潤，少量管型，輕至中度腎小球增生；3級(jí):重度腎間質(zhì)浸潤，大量管型，重度腎小球增生伴有節(jié)段或球性硬化，或新月體形成。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測

腎臟組織勻漿，Trizol抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25μL，擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5min；二步法PCR反應(yīng)95℃10s，55℃30s，35個(gè)循環(huán)；熔解曲線從60℃至95℃，每0.5℃1s。結(jié)束后讀取Ct值（樣本復(fù)孔），通過2－ΔΔCt法計(jì)算各指標(biāo)相對mRNA值。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5 ELISA檢測

剪碎腎臟，Lysis緩沖液（20mmol／L Tris－HCl，pH7.5，150mmol／L NaCl，1%NP－40，2 mmol／L EDTA，1∶1 000蛋白酶抑制劑）冰上裂解30min，15 000g 4℃離心10min，留取上清。按照ELISA試劑盒說明書檢測腎組織和尿液的IL－34和CSF－1。

1.6 IL－34原位雜交

以小鼠腎臟cDNA為模板，利用T7RNA多聚酶和地高辛復(fù)合物外轉(zhuǎn)錄合成IL－34寡核苷酸原位雜交探針。MRL－Faslpr小鼠腎臟經(jīng)4%多聚甲醛、30%蔗糖固定后，OCT包埋，20μm切片。蛋白酶K消化10min，地高辛標(biāo)記的IL－34寡核苷酸雜交探針雜交爐內(nèi)68℃孵育過夜，洗脫后，AP標(biāo)記的抗地高辛抗體4℃過夜，BM Purple顯色。

1.7 β－半乳糖苷酶顯色（X－gal staining）

4%多聚甲醛、30%蔗糖順序固定TgZ－MRL－Faslpr小鼠腎臟，OCT包埋，16μm切片，1mg／mL X－gal染色液37℃避光孵育24h，Eosin Y襯染，封片、照相。

1.8 免疫熒光和免疫組化檢測

OCT包埋腎組織，6μm厚切片，25%乙醇／75%丙酮固定10min，加入大鼠抗小鼠F4／80抗體（1∶300）4℃過夜，繼以兔抗大鼠抗體（1∶500）孵育，DAB顯色。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)連續(xù)不重復(fù)腎間質(zhì)視野（×400），計(jì)數(shù)F4／80陽性細(xì)胞數(shù)目，按以下標(biāo)準(zhǔn)分類，正常:無巨噬細(xì)胞浸潤；輕度巨噬細(xì)胞浸潤:＜50細(xì)胞／HPF；中度巨噬細(xì)胞浸潤:50～100細(xì)胞／HPF；重度巨噬細(xì)胞浸潤:＞100細(xì)胞／HPF。為檢測近端和遠(yuǎn)端腎小管，將原位雜交腎組織連續(xù)切片（6μm厚），分別利用FITC標(biāo)記－LTL和DBA（1∶1 000）室溫孵育切片1h，Vectshield液封片，熒光顯微鏡觀察、照相。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism Software 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，組間比較用非參數(shù)Mann－Whitney U檢驗(yàn)。兩變量間的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL－34和CSF－1在不同鼠齡MRL－Faslpr小鼠腎臟的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（圖1A）與ELISA（圖1B）結(jié)果顯示，隨著鼠齡增加，IL－34和CSF－1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加（均P＜0.01）。由于MRL－Faslpr小鼠于3月齡開始出現(xiàn)自發(fā)性狼瘡腎炎，該結(jié)果提示IL－34和CSF－1的表達(dá)與狼瘡腎炎活動(dòng)密切相關(guān)。

圖1 IL－34和CSF－1在不同鼠齡MRL－Faslpr小鼠腎臟的表達(dá)Fig.1 The mRNA and protein expression of IL－34and CSF－1in MRL－Faslpr

2.2 IL－34和CSF－1在MRL－Faslpr自發(fā)性狼瘡腎炎的分布

由于IL－34和CSF－1抗體不能有效檢測二者的分布（二者為分泌性蛋白，抗體難以有效捕捉有效抗原位點(diǎn)），我們采取原位雜交法檢測IL－34分布，X－gal染色檢測CSF－1分布（圖2A），結(jié)果顯示自發(fā)性狼瘡腎炎伴有腎小管IL－34和CSF－1分布顯著增加，二者主要分布于腎臟髓質(zhì)，以皮髓交界處為主，腎小球無表達(dá)。我們進(jìn)一步分離了腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（圖2B）檢測表明IL－34和CSF－1主要增加于腎臟髓質(zhì)，且自發(fā)性狼瘡腎炎小鼠的IL－34和CSF－1表達(dá)明顯強(qiáng)于正常小鼠。LTL、DBA熒光染色與IL－34原位雜交連續(xù)切片（圖2C）證實(shí)自發(fā)性狼瘡腎炎IL－34在近、遠(yuǎn)端腎小管均有表達(dá)。以上結(jié)果表明，在自發(fā)性狼瘡腎炎表達(dá)增加的IL－34和CSF－1分布在皮髓交界處的腎小管中，部分分布于近端腎小管。

圖2 IL－34和CSF－1在MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎的分布Fig.2 The distribution of IL－34and CSF－1in MRL－Faslpr

2.3 IL－34和CSF－1表達(dá)與MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎病理表現(xiàn)的關(guān)系

由于IL－34和CSF－1為巨噬細(xì)胞生存因子，我們以腎間質(zhì)炎癥為主要分級(jí)依據(jù)，對MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎進(jìn)行了病理分級(jí)，詳見1.3。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測表明腎臟IL－34和CSF－1均隨腎臟病理分級(jí)增加而表達(dá)增加（圖3）。隨IL－34和CSF－1表達(dá)增加，腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤加重（圖4）。

圖3 IL－34和CSF－1表達(dá)與MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎病理分級(jí)的關(guān)系Fig.3 The relationship between kidney IL－34and CSF－1expression and the pathological of MRL－Faslpr

圖4 IL－34和CSF－1表達(dá)與MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎巨噬細(xì)胞浸潤的關(guān)系Fig.4 The relationship between kidney IL－34and CSF－1expression and macrophage infiltration in MRL－Faslpr

2.4 IL－34和CSF－1表達(dá)／分泌與MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎蛋白尿的關(guān)系

蛋白尿是反映狼瘡腎炎活動(dòng)度的指標(biāo)，因此我們進(jìn)一步分析了腎臟IL－34和CSF－1表達(dá)、尿液IL－34和CSF－1含量與MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎蛋白尿的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿蛋白定量與腎臟IL－34的表達(dá)密切相關(guān)，腎臟IL－34表達(dá)越高，尿蛋白越多，而CSF－1表達(dá)與蛋白尿定量的關(guān)聯(lián)度較弱（圖5）。收集MRL－Faslpr小鼠24h尿量，ELISA檢測尿IL－34和CSF－1濃度，并將其與尿白蛋白／肌酐比值進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)尿IL－34含量與尿白蛋白濃度的相關(guān)性（P＜0.01）優(yōu)于CSF－1（P＝0.07），以上提示尿IL－34含量能夠較好反映狼瘡腎炎的活動(dòng)（圖6）。

圖5 腎臟IL－34和CSF－1表達(dá)與MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎蛋白尿的關(guān)系Fig.5 The relationship between kidney IL－34and CSF－1expression and proteinuria

3 討論

Bethunaickan等［11］利用Affymetrix表達(dá)譜芯片檢測3種自發(fā)性狼瘡腎炎小鼠，均發(fā)現(xiàn)腎臟IL－34 mRNA的表達(dá)上調(diào)，但是IL－34在狼瘡腎炎的分布和功能尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與CSF－1相似，IL－34的mRNA和蛋白表達(dá)在狼瘡腎炎中顯著增加，上調(diào)的IL－34主要分布于皮髓交界處的腎小管中，皮質(zhì)腎小管也有分布。IL－34的表達(dá)高低反映狼瘡病理和腎間質(zhì)單核巨噬細(xì)胞浸潤的嚴(yán)重程度。與CSF－1相比，腎臟IL－34的表達(dá)和分泌與尿蛋白定量關(guān)系更加密切，尿IL－34含量能夠反映狼瘡腎炎的活動(dòng)度。

圖6 尿IL－34和CSF－1含量與MRL－Faslpr小鼠自發(fā)性狼瘡腎炎蛋白尿的相關(guān)性分析Fig.6 The relationship between urine IL－34and CSF－1excretion and proteinuria

IL－34是近年發(fā)現(xiàn)的一種CSF－1R的新配體［7］，是一種糖基化分泌蛋白，在進(jìn)化學(xué)上較CSF－1保守［5］。IL－34和CSF－1亞基均含有αA、αB、αC和αD結(jié)構(gòu)，形成4螺旋折疊，但是CSF－1亞基二聚體以二硫鍵鏈接，而IL－34以共價(jià)鍵結(jié)合。二者與CSF－1R的結(jié)合位點(diǎn)也不相同，IL－34與受體的結(jié)合更加牢固［9］。

IL－34在組織器官的分布有一定的選擇性，它特異性表達(dá)于神經(jīng)元和皮膚角質(zhì)細(xì)胞，調(diào)控大腦和皮膚巨噬細(xì)胞的成熟和分化［12］。皮膚組織分泌的IL－34不影響炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的浸潤，但對炎癥消散后皮膚Langerhans細(xì)胞數(shù)量和功能的維持非常重要［13］。多種自身免疫性疾病的病變組織如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜、干燥綜合征的唾液腺常有IL－34的過表達(dá)，并伴有血清IL－34水平的升高［1415］。在脾臟，IL－34可以誘導(dǎo)濾泡樹突細(xì)胞相關(guān)性單核細(xì)胞成熟，進(jìn)而促進(jìn)B細(xì)胞增殖［16］。正常腎臟僅有少量IL－34表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞［13］，本研究發(fā)現(xiàn)隨著狼瘡腎炎的進(jìn)展，腎小管上皮細(xì)胞IL－34的表達(dá)顯著增加。

IL－34和CSF－1維持外周血單核細(xì)胞的存活、成熟和分化的能力相似［7，17］，二者均可促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞分化成M2型巨噬細(xì)胞［17］。但是，二者的受體后信號(hào)激活動(dòng)力學(xué)卻不盡相同。IL－34對 CSF－1R酪氨酸位點(diǎn)、受體下游粘附斑激酶（FAK）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活明顯強(qiáng)于CSF－1，但是信號(hào)持續(xù)時(shí)間卻短于CSF－1［18］。IL－34對巨噬細(xì)胞功能的影響也不同，IL－34刺激巨噬細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化因子（MCP－1）明顯少于CSF－1，但是促進(jìn)細(xì)胞膜趨化因子受體（CCR2）和補(bǔ)體3a受體（C3aR1）的表達(dá)卻強(qiáng)于CSF－1［18－19］。IL－34和CSF－1對巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性和信號(hào)途徑的不同影響，決定了二者在疾病中的作用差異。因此，盡管本研究發(fā)現(xiàn)IL－34和CSF－1在狼瘡腎炎的表達(dá)和分布相似，但是二者與蛋白尿的相關(guān)性卻不盡相同。相對于CSF－1，檢測尿IL－34含量更能反映狼瘡腎炎的活動(dòng)度。

IL－34在狼瘡腎炎中究竟是通過腎小球還是腎小管本身影響蛋白尿的濾過或重吸收，還需要進(jìn)一步研究。闡述IL－34和CSF－1在狼瘡腎炎的表達(dá)分布，及其與狼瘡腎炎的關(guān)系，將有利于發(fā)現(xiàn)新的狼瘡腎炎標(biāo)記物，了解巨噬細(xì)胞功能對狼瘡腎炎的影響，將為未來監(jiān)測和治療狼瘡腎炎提供新策略。

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（2014－10－13 收稿）

Expressions of IL－34 and CSF－1 in the Kidney of Mice with Spontaneous Lupus Nephritis

Liao Wenhui1，Du Yanjun2，Zeng Rui3△
1 Department of Geriatrics，3Department of Nephrology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China
2Department of Acupuncture and Moxibition，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430061，China

ObjectiveTo investigate the expressions of interleukine－34（IL－34）and colony－stimulating factor－1（CSF－1）in the kidney of mice with spontaneous lupus nephritis and its significance.Methods MRL－Faslprand／or TgZ－MRL－Faslprmice were used to develop spontaneous lupus nephritis.Mice were sacrificed at age of 6weeks，3months and 6months.Blood and urine samples were taken for detection of serum creatinine levels and urinary protein excretion，respectively.PAS staining was used to assess renal histological changes.Immunohistochemical staining was used to detect the number of F4／80＋macrophage.Lotus tetragonolobus lectin（LTL）and dolichos bifows agglutinin（DBA）were detected by immunofluorescense.Real－time PCR and ELISA were used to detect the mRNA and protein expressions of IL－34and CSF－1.The distributions of IL－34and CSF－1in the kidney were detected by in situ hybridization and X－gal staining，separately.Results ①The mRNA and protein levels of IL－34and CSF－1were increased in the kidney of MRL－Faslprmice with the age of the mice increasing（P＜0.01）.The increased IL－34and CSF－1were mainly distributed in the renal tubules in the cortico－medullary junction and some in the cortical renal tubules.②The increased levels of IL－34and CSF－1were associated with the pathological grades of lupus nephritis and the infiltration of macrophages in the renal interstitium.③Proteinuria was closely correlated with the expression of IL－34（r＝0.915 4，P＜0.01）.Correlation analysis showed that urine IL－34contents were positively associated with the excretion of urine albumin whereas CSF－1was weakly correlated with proteinuria（r＝0.150 6，P＝0.07）.Conclusion Compared with CSF－1，renal and urine IL－34was closely correlated with proteinuria.Urinary levels of IL－34could reflect the severity of lupus nephritis.

spontaneous lupus nephritis； proteinuria； interleukine－34； colony－stimulating factor－1

R593.242

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.001

＊國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81270771）

廖文慧，女，1977年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E－mail:liaowh163＠163.com

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:zengrui＠tjh.tjmu.edu.cn