層層自組裝血管內(nèi)皮生長因子／磺化殼聚糖改性鈦表面的研究＊

汪 洋， 劉小斌， 葉 巍， 梅 黎， 魏戰(zhàn)杰， 張凱倫

層層自組裝血管內(nèi)皮生長因子／磺化殼聚糖改性鈦表面的研究＊

汪 洋＃， 劉小斌＃， 葉 巍， 梅 黎， 魏戰(zhàn)杰， 張凱倫△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科，武漢 430022

目的 利用層層自組裝技術(shù)，在鈦金屬表面構(gòu)建血管內(nèi)皮生長因子／磺化殼聚糖（VEGF／SCS）多層膜，評價(jià)其體外血液相容性，并探討其在醫(yī)用金屬表面改性方面的應(yīng)用前景。方法 采用化學(xué)合成制備磺化殼聚糖（sulfated chitosan，SCS）并對其表征進(jìn)行分析；利用層層自組裝技術(shù)在鈦表面構(gòu)建VEGF／SCS多層膜；對鈦表面涂層進(jìn)行表征分析并評價(jià)其體外血液相容性。結(jié)果 鈦－VEGF／SCS自組裝多層膜表面光整，該涂層體外溶血率為0.567%，可延長部分活化凝血酶原時(shí)間（APTT）至（49.29±1.05）s，減少血小板粘附和激活。結(jié)論 VEGF／SCS層層自組裝形成的多層膜可以提高鈦合金的體外血液相容性，顯示其在醫(yī)用金屬表面改性方面的應(yīng)用前景。

鈦； 磺化殼聚糖； 自組裝； 血液相容性

近年來，由于鈦及其合金具有良好的機(jī)械性能和生物相容性，被廣泛用于血液接觸材料，包括心臟瓣膜、血流泵、心室輔助裝置及血管內(nèi)支架等［1］。然而，鈦及其合金與血液接觸過程中形成血栓依舊是一個(gè)亟待解決的問題。鈦及其合金表面改性作為一種可行的方式正受到廣泛的研究。

殼聚糖（chitosan，CS）是天然多糖，化學(xué)名為聚（1，4）－2－氨基－2－脫氧－β－D－葡聚糖，以β－1，4糖苷鍵連接N－乙酰－D－葡萄糖胺單元構(gòu)成，在自然界中含量豐富。殼聚糖分子中含有較高比例的羥基（—OH）和氨基（—NH2），可通過多種化學(xué)修飾得到不同結(jié)構(gòu)和功能的衍生物。其中，磺化殼聚糖（sulfated chitosan，SCS）具有類似肝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、潛在的抗凝血活性［2］和對生物活性因子的保護(hù)作用［3］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血管生成的重要因子之一，在血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、遷移中起著重要的作用［4］。

層層自組裝技術(shù)是在帶有電荷的基材表面交替吸附聚陽離子物質(zhì)和聚陰離子物質(zhì)，可形成多層膜結(jié)構(gòu)［5］，該技術(shù)方便易得，應(yīng)用廣泛。本研究通過層層自組裝技術(shù)在鈦合金表面構(gòu)建VEGF／SCS多層膜，制備同時(shí)具有抗凝和趨化誘導(dǎo)作用的生物界面，并對其進(jìn)行表征分析，評價(jià)其血液相容性。

1 材料與方法

1.1 SCS的制備與表征

取5mL氯磺酸（AR，上海金山亭新化工試劑廠），在冰水浴條件下，加入到20mL N，N－二甲基甲酰胺（DMF，AR，國藥）中，攪拌后制得磺化試劑；將1.5g殼聚糖（Sigma－Aldrich）加入到60mL DMF中，再加入2mL二氯乙酸（AR，國藥），充分?jǐn)嚢韬笾频脷ぞ厶菓乙海?0℃條件下，將磺化試劑緩慢加入到殼聚糖懸液中，反應(yīng)1.5h；向反應(yīng)液中加入大量無水乙醇，收集沉淀，反復(fù)無水乙醇沖洗后，重新溶于雙蒸水中；透析、凍干，制得磺化殼聚糖粉末。通過傅里葉變換顯微紅外光譜儀（VERTEX 70）檢測其化學(xué)組成，元素分析儀（Vario ELⅢCHNSO）檢測含硫量。

1.2 鈦表面層層自組裝VEGF／SCS多層膜與表征

①鈦表面預(yù)處理。鈦片（5mm×5mm，合肥沙泰機(jī)械）經(jīng)金相砂紙逐級打磨后，依次丙酮、無水乙醇、雙蒸水超聲清洗15min。再將已清洗的鈦片浸沒在5mol／L NaOH溶液中，60℃水浴24h，然后在去離子水中80℃水浴8h，沖洗后室溫下氮?dú)獯蹈桑═i－OH）備用。②自組裝多層膜的制備。將吹干后的鈦片浸于多聚賴氨酸（1mg／mL）的PBS溶液中24h，清洗后氮?dú)獯蹈?。此時(shí)試件表面帶正電荷，標(biāo)記為Ti－PLL。配制pH 6.0、5mg／mL的SCS溶液和pH7.4、含1μg／mL VEGF165（PEPROTCH，美國）的PBS溶液（0.1mol／L的NaOH和1%乙酸調(diào)節(jié)pH）。將Ti－PLL浸入VEGF165溶液12h，取出后去離子水沖洗，收集清洗液，試件氮?dú)獯蹈?；再浸入SCS溶液20min，取出后去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈?。重?fù)以上過程10次，得到Ti－（VEGF／SCS）10多層膜。③分別使用接觸角測量儀（JC2000C1）、環(huán)境掃描電子顯微鏡（Quanta 200）和ELISA試劑盒檢測試件表面水接觸角、表面形態(tài)及表面VEGF165含量。

1.3 鈦－VEGF／SCS多層膜的體外血液相容性試驗(yàn)

1.3.1 溶血試驗(yàn) 采集健康成人血液9mL，按比例9∶1加入1mL 3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑。再按比例1∶1.25加入生理鹽水12.5mL，置于清潔試管中待用。取待測試件用去離子水反復(fù)沖洗后加入10mL生理鹽水，37℃孵育30min。孵育后每試件加入待用稀釋血200μL，輕輕混勻，37℃孵育60 min后取出試件，將液體移入離心管中1 000r／min離心5min。離心完成后取上清液200μL加入96孔板中，用酶標(biāo)儀（SUNRISE）測定A545nm值。同時(shí)，設(shè)置陰性對照組:取待用稀釋血200μL加入10 mL生理鹽水；陽性對照組:取待用稀釋血200μL加入10mL蒸餾水，條件與測定方法同實(shí)驗(yàn)組。溶血率計(jì)算公式:溶血率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組A545nm－陰性對照組A545nm）／（陽性對照組A545nm－陰性對照A545nm）×100%［6］。

1.3.2 活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）及凝血酶原時(shí)間（PT） 采集健康成人血液9mL，按比例9∶1加入1mL 3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑，置于清潔試管中待用。分別加入2mL全血與待測試件表面完全接觸，在37℃孵育30min，采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（ACS－180plus）測定凝血酶原時(shí)間（PT）和部分凝血酶原時(shí)間（APTT）。

1.3.3 血小板粘附試驗(yàn) 采集健康成人血液9 mL，按比例9∶1加入1mL 3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑，移入離心管中離心10min（4℃，1 000r／min），轉(zhuǎn)移富含血小板的血漿（platelet－rich plasma，PRP）至EP管待用。在待測試件表面滴加150μL的PRP，用EP管封閉（12mm內(nèi)徑）使得每個(gè)樣品表面均等地暴露于PRP，置入37℃恒溫孵育箱中孵育30min后，取出試件用生理鹽水反復(fù)沖洗，去掉試件表面松散粘附的血小板，經(jīng)2.5%戊二醛溶液在室溫下固定2h，再分別通過25%、50%、75%以及無水乙醇梯度脫水干燥，最后噴金于掃描電鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 磺化殼聚糖的表征分析

通過傅里葉紅外光譜來分析合成的磺化殼聚糖化學(xué)組成，圖1所示磺化殼聚糖與殼聚糖在2 000～500cm－1的傅里葉紅外光譜圖。CS在1 645與 1 602cm－1、SCS在1 365與1 532cm－1處均出現(xiàn)殼聚糖典型的酰胺譜帶。SCS的紅外光譜中出現(xiàn)1 259和813cm－12個(gè)峰，其中1 259cm－1峰表示硫酸酯中O—S—O鍵的伸縮振動(dòng)，813cm－1處峰代表C—O—S鍵的伸縮振動(dòng)，由此可確定合成的SCS中存在硫酸酯結(jié)構(gòu)。元素分析儀檢測合成的SCS含硫量為6.7%。

2.2 鈦表面VEGF／SCS多層膜的表征分析

①ELISA Kit檢測剩余VEGF165溶液及已收集清洗液中VEGF165含量，以配置的VEGF165總量相減，計(jì)算試件表面VEGF165含量［7］。檢測結(jié)果顯示鈦表面VEGF含量為（29.0±2.7）ng／cm2。

②接觸角測量結(jié)果示，PLL涂層的Ti組較裸Ti組表面水接觸角下降［（52.83±1.79）°vs.（60.17 ±1.52）°］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；多層膜改性的Ti組［（43.16±1.55）°］較Ti－PLL組進(jìn)一步下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明經(jīng)表面改性后的鈦合金由于表面含有大量親水性基團(tuán)，如羥基、羧基等，使得接觸角逐漸變小，親水性增強(qiáng)。

③環(huán)境掃描電鏡結(jié)果如圖2所示，裸鈦（圖2A）經(jīng)過金相砂紙逐級打磨及清洗后，表面較為平整，僅有微小不規(guī)則凸起；經(jīng)NaOH處理過的鈦片（圖2B）表面呈現(xiàn)疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形狀均一；自組裝多層膜改性的鈦片（圖2C）表面雖仍可見孔隙，但較Ti－OH表面明顯光整。

圖1 樣品的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 Fourier transform infrared（FTIR）spectra of samples

圖2 環(huán)境掃描電鏡下觀察樣品表面Fig.2 Observation of the surfaces of samples under the environmental scanning electron microscope

2.3 鈦－VEGF／SCS多層膜的體外血液相容性試驗(yàn)

2.3.1 溶血試驗(yàn) 溶血是因?yàn)檫^度的外界化學(xué)或機(jī)械張力致使紅細(xì)胞膜破裂、溶解，并引起血紅蛋白的釋出。表1結(jié)果顯示，血液與Ti－（VEGF／SCS）10聚電解質(zhì)多層膜孵育后測得溶血率為0.567%，為高度血液相容［8］，顯著低于Ti組（5.942%）和Ti－OH組（6.554%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 溶血試驗(yàn)結(jié)果（，n＝10）Table 1 The results of hemolysis test（，n＝10）

表1 溶血試驗(yàn)結(jié)果（，n＝10）Table 1 The results of hemolysis test（，n＝10）

組別A545nm值溶血率（%）0.035 1±0.002 1－陽性對照0.476 0±0.008 1－Ti 0.061 3±0.001 1 5.942 Ti－OH 0.064 0±0.001 4 6.554 Ti－（VEGF／SCS）10陰性對照0.037 6±0.001 1 0.567

2.3.2 活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）及凝血酶原時(shí)間（PT） PT和APTT分別用來檢測外源性和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)活化的敏感指標(biāo)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)組與正常血漿的PT值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ti組、Ti－PLL組與正常血漿的APTT值差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），Ti－（VEGF／SCS）10組APTT值為（49.29±1.05）s，與Ti組（39.33±0.99）s差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明表面涂覆有VEGF／SCS多層膜的Ti試件具有抑制內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活的功能。

2.3.3 血小板粘附試驗(yàn) 血小板的粘附與激活是導(dǎo)致血液接觸材料表面形成血栓的重要環(huán)節(jié)，因此，材料表面血小板粘附是評價(jià)醫(yī)用材料血液相容性的另一個(gè)重要指標(biāo)［9］。圖3所示試件與PRP后表面粘附血小板的環(huán)境掃描電鏡照片，可見裸鈦（圖3A）表面粘附大量的血小板，相互聚集；NaOH預(yù)處理的鈦合金（圖3B）表面仍然粘附有較多的血小板，也可以看到聚集現(xiàn)象，并且有較多“偽足”；Ti－VEGF／SCS聚電解質(zhì)多層膜（圖3C）的表面血小板粘附數(shù)量明顯變少。這說明Ti－VEGF／SCS聚電解質(zhì)多層膜可以減少血小板的粘附與激活。

圖3 環(huán)境掃描電鏡下材料表面吸附血小板形貌Fig.3 Observation of adherent platelets on the surfaces of samples under the environmental scanning electron microscope

3 討論

鈦及其合金的優(yōu)異性能使其在生物醫(yī)用裝置領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但是仍不能滿足全部的臨床需要。缺乏良好的血液相容性使其應(yīng)用在血液接觸材料上具有潛在的致血栓和栓塞的風(fēng)險(xiǎn)，長期服用抗凝藥物亦具有潛在的出血風(fēng)險(xiǎn)。鈦及其合金與血液接觸形成血栓，本質(zhì)上是金屬表面與血液接觸時(shí)的相互作用。目前，改性鈦及其合金表面使其具有生物學(xué)效應(yīng)是目前研究的熱點(diǎn)之一。殼聚糖作為一種天然的大分子物質(zhì)，含有較多的羥基（—OH）和氨基（—NH2），有較好的生物相容性和可降解性，化學(xué)性質(zhì)活潑，適當(dāng)條件下化學(xué)修飾，可以生成多種結(jié)構(gòu)和功能的衍生物［10］。殼聚糖經(jīng)過磺化修飾，不僅可表現(xiàn)出抗凝能力，還具有抗菌、抗病毒等多種功能［2］，在藥物的裝載和運(yùn)輸方面也被廣泛的研究［11］。有研究表明，磺化殼聚糖的含硫量高低是決定其抗凝血能力的重要因素［12］。VEGF是機(jī)體分泌的由二硫鍵共價(jià)鏈接的二聚體同源糖蛋白，對內(nèi)皮細(xì)胞分裂和趨化具有特異性。研究表明VEGF可促進(jìn)血管發(fā)生［13］，在血管損傷模型中，VEGF可以促進(jìn)血管發(fā)生以及再內(nèi)皮化過程［14－16］。通過固定VEGF改性醫(yī)用材料已經(jīng)成為目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)［1719］。

我們首先合成磺化殼聚糖，紅外光譜顯示其帶有硫酸酯結(jié)構(gòu)，且有較高含硫量。再用NaOH處理鈦表面，使鈦表面帶有負(fù)電荷，以帶正電荷的聚賴氨酸吸附于鈦表面構(gòu)建基底層。通過層層自組裝在表面交替吸附VEGF和SCS，構(gòu)建鈦表面多層膜結(jié)構(gòu)。血液相容性檢測表明VEGF／SCS多層膜結(jié)構(gòu)相對于裸鈦，具有更好的血液相容性，這對于鈦合金裝置在心血管領(lǐng)域中的應(yīng)用有積極意義。本研究旨在鈦表面構(gòu)建抗凝和誘導(dǎo)趨化內(nèi)皮細(xì)胞雙重作用的多層膜，期望在表面SCS抗血栓形成的同時(shí)，通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞快速包覆于材料表面，達(dá)到長期抗凝、抗血栓形成的目的。但是，對于自組裝后自組裝多層膜體內(nèi)和體外細(xì)胞相容性、VEGF生物活性大小，以及對Ti－VEGF／SCS多層膜在體內(nèi)表現(xiàn)出抗凝并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞趨化增殖雙重能力的評價(jià)，均有待進(jìn)一步探索。

［1］ Yu S，Yu Z T，Wang G，et al.Evaluation of Haemocompatibility of TLM titanium alloy with surface heparinization［J］.Rare Metal Eng，2009，38（3）:384－388.

［2］ Jayakumar R，Nwe N，Tokura S，et al.Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials［J］.Int J Biol Macromol，2007，40（3）:175－181.

［3］ 吳興杰，馬列，高長有.磺化殼聚糖的制備及其對生長因子活性的保護(hù)作用［J］.高分子學(xué)報(bào)，2012，（4）:418－426.

［4］ Soker S，Machado M，Atala A.Systems for therapeutic angiogenesis in tissue engineering［J］.World J Urol，2000，18（1）: 10－18.

［5］ Tsai C C，Chang Y，Sung H W，et al.Effects of heparin immobilization on the surface characteristics of a biological tissue fixed with a naturally occurring crosslinking agent（genipin）: an in vitro study［J］.Biomaterials，2001，22（6）:523－533.

［6］ 伏鵬，劉成珪，張凱倫.利用陰極電泳涂裝技術(shù)提高鈦合金血液相容性的研究［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，40（4）:437－440.

［7］ Chen P R，Chen M H，Lin F H，et al.Release characteristics and bioactivity of gelatin－tricalcium phosphate membranes covalently immobilized with nerve growth factors［J］.Biomaterials，2005，26（33）:6579－6587.

［8］ 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第4部分:與血液相互作用試驗(yàn)選擇［G］.GB／T 16886.4－2003／ISO 10993－5:1999.

［9］ Kim Y J，Kang I K，Huh M W，et al.Surface characterization and in vitro blood compatibility of poly（ethylene terephthalate）immobilized with insulin and／or heparin using plasma glow discharge［J］.Biomaterials，2000，21（2）:21－30.

［10］ Elsabee M Z，Morsi R E，AI－Sabagh A M.Surface active properties of chitosan and its derivatives［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2009，74（1）:1－16.

［11］ Saranya N，Moorthi A，Saravanan S，et al.Chitosan and its derivatives for gene delivery［J］.Int J Biol Macromol，2011，48（2）:234－238.

［12］ Drozd N N，Sher A I，Makarov V A，et al.Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosan derivatives in vivo and in vitro system［J］.Thromb Res，2001，102（5）:445－455.

［13］ Pepper M S，F(xiàn)errara N，Orci L，et al.Potent synergism be－tween vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro［J］.Biochem Biophys Res Commun，1992，189（2）:824－831.

［14］ Takeshita S，Zheng L P，Brogi E，et al.Therapeutic angiogenesis.A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model［J］.J Clin Invest，1994，93（2）:662－670.

［15］ Banai S，Jaklitsch M T，Shou M，et al.Angiogenic－induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs［J］.Circulation，1994，89（5）:2183－2189.

［16］ 鄭凱，項(xiàng)帥，董漢華，等.大鼠食管靜脈曲張模型中VEGF參與內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，43（6）:636－638.

［17］ Poh C K，Shi Z，Lim T Y，et al.The effect of VEGF functionalization of titanium on endothelial cells in vitro［J］.Biomaterials，2010，31（7）:1578－1585.

［18］ Singh S，Wu B M，Dunn J C.Delivery of VEGF using collagen－coated polycaprolactone scaffolds stimulates angiogenesis［J］.J Biomed Mater Res A，2012，100（3）:720－727.

［19］ Zhang H，Jia X，Han F，et al.Dual－delivery of VEGF and PDGF by double－layered electrospun membranes for blood vessel regeneration［J］.Biomaterials，2013，34（9）:2202－2212.

（2014－11－25 收稿）

Surface Modification of Titanium with Vascular Endothelial Growth Factor／Sulfated Chitosan by Use of Layer－by－layer Self－assembling Technique

Wang Yang＃，Liu Xiaobin＃，Ye Wei et al
Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

ObjectiveTo establish the multilayers of vascular endothelial growth factor／sulfated chitosan（VEGF／SCS）on the surface of titanium by layer－by－layer（LBL）self－assembling technique，and to explore the in vitro blood compatibility of this titanium and its application prospect in the area of medical metal surface modification.Methods Sulfated chitosan was prepared by chemical synthesis and its characteristics were analyzed.The VEGF／SCS multilayers were obtained by LBL self－assembling technique.The physical properties of the multilayers were analyzed.The blood compatibility of the films in vitro was evaluated.Results The surface of VEGF／SCS multilayers was smooth and uniform.The rate of hemolysis of VEGF／SCS multilayers was 0.567%，and VEGF／SCS multillayers could prolong APTT to（49.29±1.05）s，inhibit platelet adhesion and activation effectively.Conclusion The in vitro blood compatibility of titanium alloy can be improved significantly after being coated with VEGF／SCS multilayers，and this technology shows favorable prospects in the area of medical metal surface modification.

titanium； sulfated chitosan； self－assemble； blood compatibility

R318.11

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.003

＊湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2013CFB166）

＃同為第一作者

汪 洋，男，1989年生，碩士研究生，E－mail:Jasonmasterwy＠163.com；劉小斌，男，1969年生，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學(xué)博士，E－mail: docterlxb＠sina.cn

△通訊作者，Corresponding author，E－mail:prozkl＠163.com